可口革囊星虫纤溶酶基因、可口革囊星虫重组纤溶酶及其应用

摘要

本发明提供了一种可口革囊星虫纤溶酶基因、可口革囊星虫重组纤溶酶及其应用，所述可口革囊星虫纤溶酶基因序列如SEQ？ID？NO：1所示；通过蛋白表达系统对所述的可口革囊星虫纤溶酶基因进行重组蛋白诱导表达，得到所述可口革囊星虫重组纤溶酶，所述可口革囊星虫重组纤溶酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示；一种所述的可口革囊星虫重组纤溶酶的应用，所述可口革囊星虫纤溶酶基因用于制备溶栓药物，以及用于治疗血栓性疾病。本发明的可口革囊星虫纤溶酶基因和可口革囊星虫重组纤溶酶具有直接溶解血块中纤维蛋白的能力，降解纤维蛋白时，首先降解α链，然后降解β链，最后降解γ链，为α-纤溶酶，并且对肿瘤细胞有一定的抑制作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可口革囊星虫纤溶酶基因，特别指一种口革囊星虫重组 纤溶酶及其应用。

背景技术

血栓栓塞性疾病是一种常见的心脑血管疾病，常表现为心肌梗死、缺血 性脑梗死、静脉血栓栓塞。随着我国人民生活水平的提高和人口老龄化的到 来，血栓栓塞性疾病现已成为我国发病率，致残率和死亡率最高的疾病。因 此寻找新型高效抗栓药物迫在眉睫，溶栓药物的研发已经成为抗血栓药物的 研发热点。截止目前，已经从生物中得到196条用于开发溶栓药物的基因， 寻找和开发一种新型的海洋溶栓物质，能够用来治疗血栓性疾病。通过对其 溶栓性质的研究，用基因工程的手段进一步研究其活性位点，从而研发出抗 血栓效果更好，副作用更低的溶栓药物。

可口革囊星虫(Phascolosomaesculenta)俗称“泥蒜”、海蛆、沙虫、 海丁、土笋，福建安海著名小吃土笋冻就是由其制做而成的。隶属于星虫动 物门(Sipunculoidea)、星虫纲(Sipuncula)、革囊星虫属(Phascolosoma)。该 种为我国特有，也是我国星虫中种群数量较大的一个种，分布于我国东南沿 海，广布于广西、广东、海南岛、福建和浙江，栖息于潮间带、高潮区的泥 滩内，营底栖穴居生活。以废屑和动植物碎片为食料，对温度和盐度的适应 能力较强，因此，具有许多海洋生物不具有的特征，同样也具有很多不为人 知的功能因子，为了充分利用海洋生物资源，开发更多的功能食品。

目前，可口革囊星虫主要还是供人食用，其科学研究利用价值还有待进 一步的研究探讨。国内主要是对可口革囊星虫的营养成分及增养殖方面进行 研究。展望未来，随着现代分子生物学技术，生物下游工程等技术的不断发 展，可口革囊星虫的研究利用价值会逐步被发掘出来，其体内重要的活性物 质也会被逐一探明。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种可口革囊星虫纤溶酶基 因。

本发明是这样实现上述技术问题之一的：一种可口革囊星虫纤溶酶基 因，所述可口革囊星虫纤溶酶基因序列如SEQIDNO：1所示。

本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种可口革囊星虫重组纤溶 酶。

本发明是这样实现上述技术问题之二的：一种可口革囊星虫重组纤溶 酶，通过蛋白表达系统对所述的可口革囊星虫纤溶酶基因进行重组蛋白诱导 表达，得到所述可口革囊星虫重组纤溶酶，所述可口革囊星虫重组纤溶酶的 氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明要解决的技术问题之三，在于提供一种所述的可口革囊星虫重组 纤溶酶的应用。

本发明是这样实现上述技术问题之三的：一种所述的可口革囊星虫重组 纤溶酶的应用，其特征在于：所述可口革囊星虫纤溶酶基因用于制备溶栓药 物，以及用于治疗血栓性疾病。

本发明的优点在于：可口革囊星虫纤溶酶基因和可口革囊星虫重组纤溶 酶具有直接溶解血块中纤维蛋白的能力，降解纤维蛋白时，首先降解α链， 然后降解β链，最后降解γ链，为α-纤溶酶，并且对肿瘤细胞有一定的抑 制作用。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1是本发明中可口革囊星虫天然纤溶酶序列模式图。

图2是本发明中克隆可口革囊星虫重组纤溶酶3’-FullRACECoreSet Ver.2.0实验原理图。

图3是本发明中重组纤溶酶Western-Blot检测结果原始图。

图4是本发明中可口革囊星虫重组纤溶酶利用纤维平板法进行纤溶活性 的检测结果的示意图。

具体实施方式

一种可口革囊星虫纤溶酶基因，所述可口革囊星虫纤溶酶基因序列如 SEQIDNO：1所示，编码区为720bp，编码多肽长度为240个氨基酸。可 口革囊星虫纤溶酶基因的获取，是从福建沿海的海洋生物可口革囊星虫的肠 组织中寻找和分离到的天然纤溶蛋白质进行N端7个氨基酸测序，序列 为NH4-IVGGRDV-OH，根据序列比对丝氨酸超家族酶的保守序列设计引 物对，初步克隆基因，3’RACE和5’RACE技术和生物信息学分析得到 其基因序列。具体的实施方法如下：

1实验耗材：

1.1实验材料：可口革囊星虫(Phasolosmaesculenta)，雄性昆明种小鼠， 大肠埃希氏菌DH5α、BL21(DE3)，pET-22b质粒，毕赤酵母GS115，Ppic9 质粒。

1.2、仪器

高速冷冻离心机；台式离心机；磁力搅拌器；精密pH计；电泳仪；凝 胶成像仪；微波炉；电子天平；微量移液器；恒温摇床；脱色摇床；冻干机； 制冰机；恒温水浴锅DK-S24；恒温干燥箱；酶标仪；核酸蛋白检测系统； N3000色谱工作站；恒流泵；数码照相机；分光光度计；超纯水仪；组 织匀浆器；洁净工作台；立式自动压力蒸汽灭菌器；架盘药物天平；涡旋振 荡器；超低温冰箱；普通冰箱；PCR仪；数显电热培养箱；超声波细胞破 碎仪；基因导入仪。

1.3药物与试剂

凝血酶；牛纤维蛋白原；戊巴比妥钠，角叉菜胶，注射用尿激酶；考马 斯亮蓝R-250；低分子量标准蛋白(2KDa-220KDa)；三羟基氨基甲烷；美国 陶氏分装丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；甘氨酸；过硫酸铵；十二烷基磺酸 钠(SDS)；β-巯基乙醇；TEMED；甲醇；氯化钠；磷酸氢二钾；磷酸二 氢钾；氢氧化钠；氯化钙；氯化钾；二乙基焦碳酸酯；三氯甲烷；乙酸；无 水乙醇；琼脂糖；溴化乙锭；N,N,N,N,-四甲基乙二胺；蛋白胨；酵母浸出物； 甘油；氨苄青霉素；异丙醇；溴酚蓝；二甲苯青；醋酸钠；琼脂粉；限制性 内切酶BgLII，XhoI，BamHI，NcoI；dNTPMix(10mM)；10×ReactionBuffer； TaqDNA聚合酶；PlatinumpfxDNA聚合酶；MgSO4；10×pfxBuffer； 10×LoadingBuffer；乳糖；PrecisionPlusProteinTMStandardsDualColor；； Tween-20；脱脂奶粉；苯甲基磺酰氟；PVDF膜0.22μ；mHis-tag(27E8)Mouse mAb；StabilizedPeroxidaseConjugatedGoatAnti-mouse(H+L)；尿素；硫酸镍； 咪唑；YNB；生物素；D-葡萄糖；山梨醇；TritonX-100；NiSepharoseTM6 FastFlow；BCA蛋白浓度测定试剂盒；UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂 盒(生工生物工程(上海)有限公司)；RevertAid^TMFirstStrandcDNASynthesis Kit(美国Fermentas)；PCRPurificationKit(德国QIAGEN)；新型 pUM-T快速克隆试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；TIANprepMini PlasmidKit(天根生化科技(北京)有限公司)；3’-FullRACECoreSetVer.2.0(日 本Takara)；5′RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds,Version2.0 (美国Invitrogen)；重组克隆试剂盒(南京金斯瑞生物科技有限公 司)；TIANprepMiniPlasmidKit(天根生化科技(北京)有限公司)；SanPrep柱 式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司)；SanPrep柱式PCR 产物纯化试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司)；eBlot^TM蛋白转印系统试 剂盒(南京金斯瑞生物科技有限公司)；SuperWestPicoTrialKit(美 国Thermoscientific)

1.4试剂配制

(1)6×LoadingBuffer(100mL)：

用移液器吸取6mLEDTA(500mM，pH8.0)，5mL1％的溴酚蓝，36mL 甘油至装有50mLddH₂O的烧杯中，调pH至7.0，定容至100mL，4℃分 装保存。

(2)1％琼脂糖凝胶(100mL)

称取1.0g琼脂糖粉，微波炉内加热2min直至完全融化，溶液清澈透 明，补齐液体体积为100mL，将锥形瓶静置直到手可以直接触摸，加入5μL EB，使得EB终浓度为0.5μg/mL，混匀后备用。

(3)TB(固/液)培养基(500mL)：

称取6g蛋白胨，12g酵母浸出物，2mL甘油至烧杯中，加ddH₂O至 450mL，121℃高压灭菌20min，待冷却至60℃后加入50mL磷酸缓冲液， 轻轻摇动，充分混匀。固体培养基需加入7.5g琼脂。

(4)FML培养基(3L)：

分别称取21.0gK₂HPO₄·3H₂O，9.0gNaH₂PO₄·2H₂O，7.5gNaCl，36.0g 蛋白胨，45.0g酵母浸出物，0.8gMgSO₄，2.2g乳糖，6.0g葡萄糖置于干 净的3L烧杯中，加ddH₂O充分搅拌，使其完全溶解，定容至3L，116℃ 高压灭菌30min，冷却后置于4℃备用。

(5)2×PCRMasterMix(10×100μL)

将下列试剂依次加入到干净的1.5mL离心管中混匀，－20℃保存备用。

(6)PfxMix(10×45.5μL)

将下列试剂依次加入到干净的1.5mL离心管中混匀，－20℃保存备用。

(7)30％(w/v)丙烯酰胺(100mL)

在通风橱中分别称取29.0g丙烯酰胺，1.0g甲叉双丙烯酰胺于干净的 100mL烧杯中，加ddH₂O充分搅拌，使其完全溶解，定容至100mL，用 0.45μm滤器滤去杂志，于试剂瓶中，4℃避光保存备用。

(8)5×Tris-GlycineSDS-PAGE电泳缓冲液(1L)：

分别称取15.1gTris，94.0g甘氨酸，5.0gSDS溶于烧杯中，加入ddH₂O 充分搅拌溶解，定容至1L，室温保存。

(9)5×SDS-PAGELoadingBuffer(5mL)：

分别称取0.5gSDS，0.025g溴酚蓝(BPB)置于10mL离心管中，分 别吸取1.25mL1.0MTris-HCl(pH＝6.8)，2.5mL甘油置于离心管中，加 ddH₂O定容至5mL，分装成10份，每份500μL，并在使用前向每份中加入 25μLβ-巯基乙醇，室温下保存。

(10)10×PBS缓冲液(200mL)：

分别称取16.0gNaCl，0.4gKCl，0.58gNa₂HPO₄·12H₂O，0.4gKH₂PO₄置于烧杯中，加ddH₂O充分搅拌使其溶解，定容至200mL后室温保存备用。

(11)5％浓缩胶配制(4mL，使用前配)：

(12)12％分离胶配制(10mL，使用前配)：

(13)TBST缓冲液(1L)：

称取8.766gNaCL，吸取20mL1MTris-HCl(pH＝7.4)，500μLTween-20 置于烧杯中，加ddH2O充分搅拌溶解，定容至1L，装入蓝盖瓶中保存备用。

(14)封闭液(5％脱脂奶粉10mL，使用前配制)：

称取0.5g脱脂奶粉置于烧杯中，加入ddH2O充分搅拌溶解，定容至 10mL。

(15)重悬缓冲液(20mMTris-HCl，pH＝8.0)(500mL)：

称取1.21gTris置于烧杯中，加入ddH2O充分搅拌溶解，用浓HCl调 pH＝8.0，定容至500mL，保存备用。

(16)包涵体洗涤缓冲液(200mL)：

20mMTris-HCl，pH＝8.0；0.5MNaCl；2M尿素；1％TritonX-100。

(17)包涵体溶解缓冲液(200mL)：

20mMTris-HCl，pH＝8.0；0.5MNaCl；8M尿素；1％TritonX-100。

(18)BindingBuffer(200mL)：

20mMTris-HCl，pH＝8.0；0.5MNaCl；5mM咪唑。

(19)WashBuffer(200mL)：

20mMTris-HCl，pH＝8.0；0.5MNaCl；50mMEDTA(pH＝7.4)。

(20)ElutionBuffer(各200mL)：

20mMTris-HCl，pH＝8.0；0.5MNaCl；(100、200、300、400、500) mM咪唑。

(21)透析液(3L)：

20mMTris-HCl，pH＝8.0；0.5MNaCl；50mM咪唑；4M尿素。

(22)10xD溶解200gD-葡萄糖于100mL去离子水中，过滤除菌， 存放于4℃冰箱。

(23)10xYNB溶解13.4gYNB于100mL去离子水中，过滤除菌，存 于4℃保藏

(24)500x生物素溶解20mg生物素于100mL去离子水中，过滤 除菌，放于4℃冰箱备用。

(25)1M磷酸钾缓冲液32mL1MK2HPO4，868ml1MKH2PO4， 调整PH值为6，高压灭菌，室温放置。

(26)10xGY混合10mL甘油与90mL去离子水，过滤除菌，室温 放置备用。

(27)10xM混合5mL甲醇与95mL去离子水，过滤除菌，4℃冰箱 备用。

(28)1M山梨醇溶解18.2g山梨醇于100mL去离子水中，高温高 压灭菌，存放于4℃备用。

(29)YPD培养基溶解2.5g酵母浸出粉，5g胰蛋白胨于225mL 去离子水中，高温高压灭菌20min；加入25mL10xD，混匀，存于4℃冰 箱。

(30)MM培养基80mL无菌去离子水，于60℃下加入10mL 10xYNB,0.2mL500xB，10mL10xM

(31)BMG培养基(1L)在700mL无菌去离子水中加入100mL1M 磷酸钾缓冲液PH＝6.0,100mL10xYNB，2mL500XB，100mL10xGY，4℃保 存，可放两个月。

(32)BMMY(1L)溶解10g酵母浸出粉，20g胰蛋白胨于700mL 去离子水中，高温高压灭菌20min；冷却至室温，加入100mL1M磷酸钾 缓冲液PH6.0,100mL10xYNB，2mL500xB，100mL10xD。

(33)1％角叉菜胶溶液的配制：称取0.5g角叉菜胶溶于50mL的生 理盐水中，沸水浴至完全溶解，37℃恒温水浴备用。

(34)PFE溶液配制：取5mgPFE蛋白冻干粉溶于10mL生理盐水 中，配制成0.5mg/mL的PFE溶液。另取25mgPFE蛋白冻干粉溶于10 mL生理盐水中，配制成2.5mg/mL的PFE溶液。

(35)尿激酶的配制：将一瓶10万单位的注射用尿激酶溶于200mL 的生理盐水中，则得到500U/mL的尿激酶。

2可口革囊星虫纤溶酶基因获得

2.1可口革囊星虫纤溶酶基因引物设计

根据先前获得的可口革囊星虫天然纤溶酶N端7个氨基酸序列 NH4-IVGGRDV-OH，以及通过序列比对丝氨酸超家族酶的保守序列得到两个 保守序列LTAAH和GDSGG，并设计引物，初步克隆基因。经过分析，可口革 囊星虫天然纤溶酶序列模拟图如图1所示。

根据可口革囊星虫天然纤溶酶序列模式图可设计引物：方案：根据保守 序列LTAAH和保守序列GDSGG设计简并引物

上游引物IVG：5’-ATHGTNGGNGGNAGRGAYGT-3’(简并度为768) (如SEQIDNO：3所示)

下游引物GDS：5’-GGVCCVCCSGARTC-3’(简并度为36)(如SEQID NO：4所示)

2.2可口革囊星虫肠道总RNA的提取

2.2.1仪器处理：

所有玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤8h；塑料器皿用0.1％ DEPC水浸泡，80℃烘干；有机玻璃的电泳槽等，先用去污剂洗涤，双蒸水冲 洗，乙醇干燥，再浸泡在3％H₂O₂室温10min，然后用0.1％DEPC水冲洗，晾 干。

2.2.2试剂处理：

配制的溶液用0.1％DEPC，在37℃处理12h以上；在RPESolution试 剂瓶中加入4倍体积的无水乙醇。

2.2.3实验材料处理：

用海水洗去新鲜可口革囊星虫表面的泥沙杂质，放入海水中暂养，排尽 体内杂质；解剖可口革囊星虫，将黄色肠道组织取出置于装有1mLTrizol 的5mL离心管中，用匀浆器匀浆匀浆。

2.2.4RNA抽提步骤

处理后的样品室温放置10min后，加入0.2mL氯仿，剧烈振荡30s， 室温放置3min。4℃，12000rpm离心10min，将上层水相转移至干净的1.5 mL离心管中，加入1/2倍体积的无水乙醇，混匀，转移至吸附柱中，室温 静置2min，12000rpm离心3min，弃废液；向吸附柱中加入500μLRPE Solution，室温静置2min，10000rpm离心30s，弃废液；10000rpm离心2 min，将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，加入30μLDEPC-treated ddH2O，室温静置5min，12000rpm离心2min；取4.5μLRNA与0.5μL 的10×LoadingBuffer混匀后进行凝胶电泳检测，剩余RNA于－80℃保存。

2.3可口革囊星虫纤溶酶基因特异性片段的扩增

2.3.1反转录PCR：利用RevertAid^TMFirstStrandcDNASynthesisKit (Fermentas)进行反转录实验。

2.3.2纤溶酶基因特异性片段PCR扩增

冰浴中加入下列试剂；25μL2×PCRMasterMix，4μL上游引物，4μL 下游引物，1μL反转录PCR产物，用ddH₂O补至50ul，混匀，短暂离心后 将PCR管置于PCR仪中，按以下程序进行反应：

反应完成后，吸取5μLPCR反应液与1μL的6×LoadingBuffer混匀， 1％琼脂糖凝胶上电泳，其余样品－20℃保存并用于后续实验。

2.3.3PCR扩增产物回收

本发明采用PCRPurificationKit(QIAGEN)进行PCR产物 回收。

2.3.4构建重组克隆载体

采用北京百泰克生物技术有限公司的新型pUM-T快速克隆试剂盒构建 纤溶酶基因特异性片段重组克隆载体。

2.3.5重组克隆载体转化

2.3.5.1TB(Amp+)固体琼脂培养基平板的制备：

称取2.4g蛋白胨，4.8g酵母浸出物，0.8mL甘油，3.0g琼脂至烧杯 中，加ddH₂O至180mL，121℃高压灭菌20min，待冷却至60℃后加入20 mL磷酸缓冲液，轻轻摇动，充分混匀。待冷却至60℃后加入200μLAmpcilin (100mg/mL)，使得终浓度为100μg/mL，温和混匀后到平板。

2.3.5.2转化

取感受态细胞DH5α置于冰浴融化；分别向感受态细胞悬液中加入10 μLpUM-T重组克隆载体和目的基因PCR产物，混匀，冰浴中静置30min； 42℃热激60～90s，迅速转移至冰浴中静置2～3min；加入900μLTB液体培 养基中，混匀后37℃，180rpm振荡培养45min；吸取100μL菌液加到TB (Amp+)固体培养基平板上，均匀涂开，倒置37℃培养12～16h。

2.3.5.3重组子检测

在长满菌落的平板上随机挑取10个单克隆，分别溶解到10μLddH₂O 中，涡旋混匀后短暂离心，使PCR管壁上的液体沉到管底；分别吸取2μL 稀释菌液至干净的200μLPCR管中，99℃热处理5min；冰浴中加入5μL 2×PCRMasterMix，1μL上游引物，1μL下游引物，1μL热处理后的菌液， 用ddH₂O补至10ul，混匀，短暂离心后将PCR管置于PCR仪中，按以下程 序进行反应，

待反应完成后，吸取5μLPCR反应液与1μL的6×LoadingBuffer混匀， 1％琼脂糖凝胶上电泳；将阳性克隆对应的单菌落加入到3mLTB(Amp+) 液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，用于小量质粒提取。

2.3.6同源性比对

将成功测序的核苷酸序列录入到NCBI数据库中进行同源性比对，根据 同源性结果，可以判断序列是否为新基因以及可能具有的功能。

2.4可口革囊星虫纤溶酶全长基因的克隆

2.4.1可口革囊星虫纤溶酶cDNA序列3’末端扩增

请参见图2，采用3’-FullRACECoreSetVer.2.0试剂盒(Takara)。

2.4.1.1根据测序成功的纤溶酶特异性片段序列设计引物，如下：

2.4.1.2反转录

冰浴中加入5.5μLTotalRNA，1μL3’RACEAdapter(5μM)，2 μL5×M-MLVBuffer，1μLdNTPMixture(10mM)，0.25μLRNaseInhibitor (40u/μL),0.25μLReverseTranscriptaseM-MLV(200u/μL),用ddH₂O补至 10ul，混匀，短暂离心后将PCR管置于PCR仪中，按以下程序进行反应， 42℃温浴60min,70℃终止反应,－20℃保存备用；

2.4.1.3套式PCR

(1)OuterPCR反应

冰浴中加入4μLcDNA，6μL1×cDNADilutionBufferII，2μLA-GSP1， 2μL3’RACEOuterPrimer，25μL2×PCRMasterMix，用ddH₂O补至50ul； 混匀，短暂离心后将PCR管置于PCR仪中，按以下程序进行反应；

反应结束后，吸取5μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余反 应液－20℃保存备用；

(2)InnerPCR反应

冰浴中加入1μLOuterPCR反应产物，2μLA-GSP2(10μM)，2μL 3’RACEInnerPrimer(10μM)，25μL2×PCRMasterMix，用ddH₂O补至 50ul；混匀，短暂离心后将PCR管置于PCR仪中，按以下程序进行反应；

反应结束后，吸取5μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余反 应液－20℃保存备用。

2.4.1.43’RACE产物纯化后克隆测序

2.4.2可口革囊星虫纤溶酶cDNA序列5’端扩增

本发明采用5’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds Version2.0(Invitrogen)。

2.4.2.1根据测序成功的纤溶酶特异性片段序列设计引物，如下：

2.4.2.25’RACE前准备

用0.1％DEPC水浸泡200μLPCR管，80℃烘烤30min后备用；用0.22 μm微孔滤膜过滤TE溶液；1×WashBuffer：吸取1mLWashBuffer至50mL 蓝盖瓶中，加入18mLddH₂O，21mL无水乙醇，彻底混匀；

2.4.2.3第一条链cDNA合成

冰浴中加入1μL5R-A-GSP1(10μM)，12.5μLTotalRNA，用DEPC treatedddH₂O补至15.5uL，混匀；70℃温浴10min使RNA变性，冰浴1min， 加入2.5μL10×PCRBuffer，2.5μLMgCl₂(25mM)，1μLdNTPMixture(10 mM)，2.5μL0.1MDTT，1μLRNAInhibitor；混匀，短暂离心后42℃温浴 1min；加入1μLSuperScript^TMIIRT，轻轻混匀，42℃温浴40min；70℃温 浴15min终止反应，离心20s并置于37℃；加入1μLRNasemix，混匀， 37℃温浴30min；短暂离心后至于冰上备用；

2.4.2.4cDNA纯化

室温平衡结合液；室温下分别向cDNA中加入120μL结合液(6M NaI)；将混合液转移至S.N.A.P.纯化柱中，13000g离心20s；将滤芯放回 一干净的1.5mL离心管中；向滤芯中加入0.4mL遇冷的1×WashBuffer， 13000g离心20s，弃去废液，此步骤重复三次；用400μL遇冷的70％乙 醇漂洗滤芯两次，13000g离心1min，弃去废液，将滤芯放回一干净的1.5mL 离心管中；加入50μL65℃预热的DEPCtreatedddH₂O，13000g离心1 min，洗脱cDNA；

2.4.2.5制备dC-cDNA

(1)冰浴中加入6.5μLDEPCtreatedddH₂O，5μL5×TailingBuffer，2.5 μLdCTP(2mM)，10μLS.N.A.P.纯化的cDNA；94℃温浴2min，冰浴1 min，短暂离心后置于冰上；加入1μLTdT末端转移酶，轻轻混匀37℃温 浴10min；65℃温浴10min终止反应，短暂离心后置于冰上备用；

(2)dC-tailedcDNAPCR

冰浴中加入5μL10×PCRBuffer，3μLMgCl₂(25mM)，1μLdNTP Mixture(10mM)，2μL5R-A-GSP2，2μLAbridgedAnchorPrimer(10μM)， 5μLdC-tailedcDNA，用DEPCtreatedddH₂O补至49.5μL，混匀前立即加 入0.5μLTaqDNA聚合酶(5u/μL)；混匀，短暂离心后按以下程序进行PCR 反应；

反应结束后，吸取5μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余反 应液－20℃保存备用。

2.4.2.6套式PCR

将上述PCR产物用TE缓冲液稀释100倍；然后冰浴中加入5μL10× PCRBuffer，3μLMgCl₂(25mM)，1μLdNTPMixture(10mM)，1μL 5R-A-GSP3，1μLAUAP(10μM)，5μLdC-tailedcDNAPCR产物，用DEPC treatedddH₂O补至49.5μL，立即加入0.5μLTaqDNA聚合酶(5u/μL)；混 匀，短暂离心后按以下程序进行PCR反应；

反应结束后，吸取5μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余反 应液－20℃保存备用。

2.4.2.75’RACE产物纯化后克隆测序

2.4.3可口革囊星虫纤溶酶cDNA序列拼接及全长基因克隆

分别将可口革囊星虫纤溶酶基因特异性片段、3’RACE产物、5’RACE 产物测序结果拼接得到纤溶酶全长基因(如SEQIDNO：1所示)，并克隆 测序验证结果。

通过蛋白表达系统对所述可口革囊星虫纤溶酶基因进行重组蛋白诱导 表达即利用基因工程表达，得到所述可口革囊星虫重组纤溶酶，所述可口革 囊星虫重组纤溶酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。在本发明中所述可 口革囊星虫重组纤溶酶是采用大肠杆菌-乳糖诱导表达系统和毕赤酵母-甲 醇诱导表达系统表达出来的。

3可口革囊星虫纤溶酶基因表达

3.1可口革囊星虫纤溶酶基因原核表达

大肠杆菌表达系统具有蛋白表达快，产率高，操作简单，价廉等优点， 有利于经济、大量地获得PFE，为后续研究提供大量原料，但对于真核生物 蛋白修饰程度低，活性很低，需要摸索复性条件。

3.1.1PFE原核表达载体构建

利用重组克隆试剂盒(南京金斯瑞)对可口革囊星虫纤溶酶 基因进行pET-22b(+)原核表达载体构建：

3.1.1.1表达载体引物设计

重组表达载体引物如下：

pET-22b-PFE2-F：5’-GCCCAGCCGGCGATGGCCATTGTAGGGGGTCGC-3’(如SEQID NO：14所示)

pET-22b-PFE2-R1：5’-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGTTGATCTATCCACC-3’(如SEQ IDNO：15所示)

pET-22b-PFE2-R2：

5’-GACGGAGCTCGAATTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGTTGATC-3’(如SEQ IDNO：16所示)

3.1.1.2PFE-pET-22b(+)表达载体构建

(1)可口革囊星虫纤溶酶目的片段扩增；

冰浴中加入45.5μLpfxMix，2μLpET-22b-PFE1-F，2μLpET-22b- PFE1-R1，0.5μLPfxDNA聚合酶，用ddH₂O补至50ul，混匀，短暂离心后， 按以下程序进行PCR反应；

待程序运行完成后，吸取5μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测， 剩余反应液－20℃保存备用；以上述PCR产物为模板，冰浴中加入45.5μL pfxMix，2μLpET-22b-PFE1-F，2μLpET-22b-PFE1-R2，0.5μLPfxDNA 聚合酶，用ddH₂O补至50ul，混匀，短暂离心后，按以下程序进行PCR反 应；

反应结束后，吸取5μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余反 应液－20℃保存备用。

(2)用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)凝胶回收PCR 产物；

(3)pET-22b(+)载体线性化；

冰浴中加入5μL10×FastDigestBuffer，30μLpET-22b(+)，1.5μLFast DigestNcoI，1.5μLFastDigestBamHI质粒，ddH₂O补至50μL建立双酶切 体系；37℃温浴30min进行酶切反应；切胶纯化上述反应液保存备用。

(4)可口革囊星虫纤溶酶DNA与pET-22b(+)载体的重组

将10μL线性化载体，6μL纯化的PCR产物，2μL10×CloneEZBuffer, 2μLCloneEZEnzyme,ddH₂O20μL混合物加到0.5mlPCR管的管底；22℃ 孵育，30min，在冰上保持5min，并立即进行转化BL21(DE3)感受态细胞； 挑取阳性克隆测序，并保存工程菌PFE1。

3.1.2活化工程菌PFE-1与蛋白检测；

3.1.2.1活化工程菌PFE-1

按1:1000的接种量将活化好的工程菌PFE-1接种于装有600mLFML 培养基(含100μg/mL)的三角瓶中，每种菌种接种3瓶；室温下180rpm 振荡培养16h，待OD₆₀₀达到0.4～0.6时，停止培养。分别取1mL培养后的 菌液置于干净的1.5mL离心管中，离心弃去上清液，加入150μL1×PBS缓 冲液，轻轻吹打混匀，其余菌液4℃保存备用；向上述混合液中加入PMSF， 使终浓度达到1mg/mL，反复冻融5次；将反复冻融的菌液离心，分别收集 上清和沉淀，并向沉淀中加入150μL1×PBS缓冲液，轻轻吹打混匀；

3.1.2.2SDS-PAGE电泳检测；

配制5％浓缩胶和12％分离胶；将立即混匀的12％分离胶用移液器加入到凝 胶模具中，用ddH₂O覆盖胶面；待分离胶聚合凝固后，倒出覆盖在胶面上 的ddH₂O，并用滤纸吸取残留液体，将刚配制好的5％浓缩胶用移液器加入 到凝胶模具中，插入样品梳，待分离胶聚合凝固后，在电泳槽中加入电泳缓 冲液，拔出样品梳。分别取细菌裂解液上清和沉淀各20μL，加入5μL 5×SDS-PAGELoadingBuffer，99℃温浴3min，迅速转入至冰浴2min。短 暂离心后吸取处理好的样品缓慢加入到上样孔中；连接正负极并接通电源， 电压80V约20min，使样品进入浓缩胶并到达浓缩胶与分离胶的界面。将 电压升高至120V，继续电泳，待溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源，从电 泳装置上卸下玻璃板，取出凝胶，在凝胶下缘切角标记位置。将上述凝胶转 移至装有考马斯亮蓝R-250染色液的培养皿中，使染色液刚好没过凝胶表 面，用保鲜膜封口，微波炉中加热2min，在脱色摇床上染色30min；将染 好色的凝胶转移至装有考马斯亮蓝脱色液的烧杯中用保鲜膜封口，微波炉中 加热2min，在脱色摇床上脱色色30min，取出后检测拍照。所述可口革囊 星虫重组纤溶酶经SDS-PAGE电泳图谱呈单一蛋白条带，SDS-PAGE法测 其相对分子质量为27kDa左右。

3.1.2.3Western-Blot检测重组蛋白

将PFE-1细菌裂解液沉淀进行SDS-PAGE；打开eBlot^TM蛋白转印系统， 将黄色的eBlot^TM阳极垫放在阳极板上；将凝胶取下，切下需转印的部分并 浸在ddH₂O中，用eBlot^TMEquilibrationBuffer处理已裁好的与凝胶同样大 小的PVDF膜1min；将处理好的PVDF膜放到阳极垫上；将凝胶置于PVDF 膜上，用设备提供的小铲子轻轻移去气泡；将白色的eBlot^TM阴极垫放到凝 胶上，盖好盖子，设置程序时间为7min，执行程序。

转印结束后，将PVDF膜从eBlot^TM蛋白转印系统中取出，TBST缓冲 液稍加漂洗，浸没在封闭液(5％脱脂奶粉)中，室温下置于脱色摇床上缓 慢振荡1h进行封闭；用封闭液稀释一抗(StabilizedPeroxidaseConjugated GoatAnti-mouse)，稀释比例为1:1000，将一抗稀释液和处理好的PVDF膜 转移至平皿中，用保鲜膜封口，4℃摇动过夜；用TBST缓冲液漂洗3次， 每次10min；结合二抗：根据一抗来源选择二抗(His-tag(27E8)Mouse mAb)，用TBST缓冲液按1:5000的比例稀释，将PVDF膜浸没在二抗溶液 中，室温下缓慢摇动(70rpm)1～2h；用TBST缓冲液漂洗3次，每次10min， 最后用PBS缓冲液洗膜1～3次；吸取SuperWestPicoTrialKit中的 A、B液各200μL，充分混匀；将漂洗过的PVDF膜正面朝上放在保鲜膜上， 并将混合后的A/B液均匀的涂在PVDF膜表面；用化学发光成像系统进行 成像拍照，实验结果见图3。

3.3.3可口革囊星虫重组纤溶酶纯化及活性初步鉴定

3.3.3.1菌体破碎

本发明采用超声裂解法破碎细胞。将工程菌菌液分装在50mL离心管 中，4℃，8000rpm离心15min，收集菌体沉淀，留上清备用；用4倍体积 的20mMTris-HCl重悬菌体沉淀，4℃，8000rpm离心15min，弃去上清； 用2倍体积的超声破菌缓冲液重悬菌体沉淀并置于冰浴中进行超声破碎，其 条件为：功率300W，破碎时间5s，间隔5s超声120次，总用时约20min； 4℃，12000rpm离心15min，弃去上清，收集沉淀；用包涵体洗涤缓冲液 重悬沉淀，搅拌洗涤30min，4℃，12000rpm离心15min，重复洗涤一次， 用50mMTris-HCl漂洗一次，4℃，12000rpm离心15min，弃去上清，收 集沉淀；用包涵体溶解缓冲液重悬沉淀，室温搅拌6h，4℃，12000rpm离 心15min，收集上清，SDS-PAGE检测。

3.3.3.2可口革囊星虫重组纤溶酶纯化

采用NiSepharose^TM6FastFlow进行重组纤溶酶的纯化。

3.3.3.3可口革囊星虫纤溶酶复性

将透析袋剪成10cm左右的小段，用含1mMEDTA的2％(w/v)NaHCO₃溶液煮沸10min，用ddH₂O冲洗并浸泡在ddH₂O中，4℃保存备用；将纯 化得到的蛋白转入透析袋中，夹好，转移至装有透析液的1L烧杯中，4℃ 搅拌，透析8h；倒出一半体积的透析液，加ddH₂O至原体积继续透析；待 尿素浓度达到1M时，换用1×PBS透析，每4h换液一次，共透析20h：将 透析袋中液体转移至10kDa超滤管中，4℃，5000rpm离心1h，收集超滤 管中的液体，SDS-PAGE检测。

3.3.3.3可口革囊星虫纤溶酶活性初步鉴定

称取1.0g琼脂糖于200mL蓝盖瓶中，加入10mM的Tris-HCl(pH＝7.8) 缓冲液，配成2％琼脂糖溶液，微波加热至融化，待溶液冷却至50℃左右时， 置于55℃温水浴中备用；加入2.5mL的含有50mg纤维蛋白原的10mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.8)，边加边缓慢摇动，以防白色絮状沉淀产生；同 时1mL凝血酶(100u/mL)稀释到1.5mL的生理盐水中，将凝血酶稀释液 转移至已灭菌的培养皿中备用；将55℃温水浴中的琼脂糖加入到培养皿 中，边加入边缓慢摇动，室温冷却形成凝胶，用0.5cm打孔器打孔；将蛋 白样品和阳性对照(尿激酶)加入孔中，37℃温浴18h后观察透明圈。

3.4可口革囊星虫纤溶酶基因真核表达

毕赤酵母表达系统具有表达蛋白活性高、纯化复性简单等优点。

3.4.1真核表达载体引物设计

根据载体Ppic9图谱，在目的基因C端和N端加上相应的限制酶位点，利 用限制性内切酶进行酶切、T4DNA连接酶连接的方法将目的基因克隆入载 体，在目的基因上加上蛋白标签His-Tag。据此设计引物，设计结果如下：

B-Ppic9-PT-F:5’-ccCTCGAGaaaagaATTGTAGGGGGTCGCGA-3’[XhoI](如SEQ IDNO：17所示)

B-Ppic9-PT-R:5'-GTGGTGGTGCTGTTGATCTATCCACC-3'(如SEQIDNO：18所 示)

B-Ppic9-PT-R1:5'-ggAATTCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGTTGATC-3'[EcoRI] (如SEQIDNO：19所示)

3.4.3PFE-Ppic9表达载体构建

3.4.3.1PFE目的片段扩增

冰浴上依次加A-Ppic9-PT-F1.5μL，A-Ppic9-PT-R1.5μL，目的基因片段 1μL，Pfumix45μL，PfuDNA聚合酶1μL于200μLep管中；混匀，低速 离心，进行PCR反应；

反应完毕，吸取5μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余反应 液－20℃保存备用；将上述PCR产物作为模板，依次加入下列试剂于200 PE管中：A-Ppic9-PT-F1.5μL，A-Ppic9-PT-R11.5μL，PCR产物1μL，Pfu mix45μL，PfuDNA聚合酶1μL；混匀，低速离心；

PCR反应程序进行反应

反应完毕，吸取5μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余反应 液－20℃保存备用。

3.4.3.2Ppic9载体线性化和基因片段双酶切

冰上依次将5μL10xFastDigestBuffer，35μLPlasmid(Ppic9)，1.5μL EcoRI，1.5μLXhoI，去离子水7μL加至200μLPCR管中；冰上依次将3μL 10xFastDigestBuffer，15μL目的基因纯化片段，1μLEcoRI，1μLXhoI， 10μL去离子水加至200μLPCR管中；37℃水浴1.5h。分别吸取3μL酶 切反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全；利用SanPrep柱式PCR 产物纯化试剂盒(上海生工)对酶切产物进行纯化。

3.4.3.2PFE基因片段与Ppic9载体的基因重组

将10xRapidLigationBuffer2μL，线性化载体(Ppic9)2μL，双酶切目 的基因片段7μL，T4Ligase1μL，去离子水8μL，于200μLPCR管；混匀 25℃孵育2h，并立即进行转化Dh5α感受态细胞；测序并保存菌种，命名 为菌PFE-Ppic9。

3.4.4毕赤酵母表达重组蛋白与重组蛋白的检测

3.4.4.1制备毕赤酵母感受态

在YPD平板上划线培养GS115，28℃培养两天；挑单菌落至含5mL YPD培养基的玻璃试管中，250rpm，28℃过夜培养；取50μL过夜菌液接 种至含50mLYPD培养基的三角瓶中，30℃，250rpm，培养至菌液 OD＝1.0～2.0；菌液转入50mL离心管中，1500g，4℃离心5min，弃上清； 50mL冷无菌水重悬，1500g，4℃离心5min，弃上清；25mL冷无菌水重悬， 1500g，4℃离心5min，弃上清；5mL冷1M山梨醇重悬，1500g，4℃离心 5min，弃上清；400μL1M冰山梨醇重悬，分装，每管80μL，保存在-80℃。

3.4.4.2重组质粒线性化

将10xFastDigestBuffer3μL，Plasimid(PFE-Ppic9-1,Ppic9)15μL，BgLII 2μL，去离子水10μL加到200μLPCR管的管底，37℃孵育1.5h；分别吸 取3μL酶切反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。

3.4.4.3电转

将制备好的溶解在水中的10μL线性化质粒与80μL酵母感受态细胞混 匀，转至0.2cm的预冷的电转化杯中，电转化杯冰浴5min；电压1.5KV， 电容25μF，电阻200Ω，电击时间4-10mse；加入1mL冰预冷的1M山梨 醇溶液，转至1.5mL离心管中；30℃，250rpm培养约1h；待菌体液完全 吸收后，将平板在28℃培养箱倒置2-3d，直到有单菌落出现。

3.4.4.4筛选重组子和分泌表达

挑取单菌落，同时划于MD板、MM板上，30℃放置24h；挑取MM 平板中生长较好，对应MD板上的菌落，进行菌落PCR鉴定；挑取阳性 克隆置于装有5mLYPD培养基的50mL摇瓶中，30℃，280rpm培养至 OD＝2-6；部分保留菌种，取1mL于装有40mLBMG培养基的250mL摇 瓶中，280rpm培养至OD＝2-6；1500g离心5min，用15mLBMMY重悬 菌体，所得菌液置于250mL摇瓶中，30℃，280rpm的摇床上继续生长； 每24h向培养瓶基中添加100％甲醇，至终浓度为0.5％；按时间点取样菌 液样品，取样量为1mL，置于1.5mL离心管中，最大转速离心3min分别 收集上清和菌体沉淀，分析目的蛋白的表达量和菌液收获时间，取样时间点 为：0h,6h,12h,24h,36,48h,60h,72h,96h。

3.4.4.5SDS-PAGE，Western-Blot蛋白检测及纤维平板活性实验检测

同3.1.2.1—3.1.2.3，3.3.3.3。

4可口革囊星虫纤溶酶溶栓动物实验

为考察可口革囊星虫纤溶酶基因对血栓性疾病的溶栓作用，将由毕赤酵 母表达系统表达的可口革囊星虫重组纤溶酶进行纤维平板法检测纤溶活性， 体外对小鼠全血凝块溶解率实验即体外溶栓实验，以及角叉菜胶致小鼠尾部 血栓模型实验。

可口革囊星虫重组纤溶酶体外对小鼠全血凝块溶解率实验结果

注：

PFE表示血块未经处理的可口革囊星虫重组纤溶酶组；

PFE(加热)表示血块经80℃加热30min处理，灭活了血液中内源性溶栓因子后 的可口革囊星虫重组纤溶酶组；

尿激酶表示血块未经处理的尿激酶组；

尿激酶(加热)表示血块经80℃加热30min处理，灭活了血液中内源性溶栓因子 后的尿激酶组

由上表的体外溶栓实验结果可知，1mL的可口革囊星虫重组纤溶酶 (PFE)(20000U/mL)作用在小鼠全血凝血块(100mg)4h后血块完全溶解； 加热灭活血块中的凝血因子，20000U的可口革囊星虫重组纤溶酶作用血块 4h后，其溶解率达91％。可口革囊星虫重组纤溶酶溶解血块的效果优于同 样效价的阳性对照尿激酶，由实验结果可知，可口革囊星虫重组纤溶酶具有 直接溶解血块中纤维蛋白的能力。

由体外溶栓实验结果表明，所述可口革囊星虫纤溶酶基因和可口革囊星 虫重组纤溶酶可用于制备溶栓药物，以及可用于治疗血栓性疾病。所述可口 革囊星虫重组纤溶酶具有直接溶解血块中纤维蛋白的能力，降解纤维蛋白 时，首先降解α链，然后降解β链，最后降解γ链，为α-纤溶酶，并且对 肿瘤细胞有一定的抑制作用。

4.1、角叉菜胶致小鼠尾部血栓的实验

4.1.1、实验材料两种方法

4.1.1.1、仪器

高速冷冻离心机；磁力搅拌器；精密pH计；电泳仪；电子天平；微量 移液，取样器；蛋白电泳仪；恒温摇床；冻干机FDU-1200；制冰机IMS-40； 恒温水浴锅DK-S24；恒温干燥箱；酶标仪；核酸蛋白检测系统；N3000色 谱工作站；恒流泵；蛋白质电泳仪；数码照相机；分光光度计；磁力搅拌 器；

4.1.1.2、药物与试剂

凝血酶；牛纤维蛋白原；注射用尿激酶(10万单位)；BCA蛋白浓度测 定试剂盒；溴酚兰(BPB)；考马斯亮蓝R-250；低分子量标准蛋白 (2KDa-220KDa)；BlueProteinMarker；三羟基氨基甲烷(Tris)美国陶氏分装 丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；甘氨酸(氨基乙酸)；过硫酸铵；十二烷基磺酸 钠(SDS)；β-巯基乙醇；TEMED；甲醇；氯化钠。

4.1.1.3、实验动物与溶液配制

雄性昆明种小鼠40只，体重25±2g，购自福州大学吴氏动物中心，饲 养温度25℃，实验前适应环境一周，饲料为鼠繁殖料。麻醉剂：2％戊巴比 妥钠(注射用生理盐水溶解)，按8mL/kg腹腔注射麻醉小鼠。

1％角叉菜胶溶液的配制：称取0.5g角叉菜胶溶于50mL的生理盐水中， 沸水浴至完全溶解，37℃恒温水浴备用。

可口革囊星虫重组纤溶酶溶液配制：实验用可口革囊星虫重组纤溶酶的 比活力为1368.38U/mg，取5mg可口革囊星虫重组纤溶酶冻干粉溶于10mL 生理盐水中，配制成0.5mg/mL的可口革囊星虫重组纤溶酶溶液。另取25mg 可口革囊星虫重组纤溶酶冻干粉溶于10mL生理盐水中，配制成2.5mg/mL 的可口革囊星虫重组纤溶酶溶液。

尿激酶的配制：将一瓶10万单位的注射用尿激酶溶于200mL的生理 盐水中，则得到500U/mL的尿激酶。

4.1.2、实验方法

4.1.2.1、动物模型的制备

40只小鼠，随机分为5组，即正常对照组(6只)、高剂量可口革囊星虫 重组纤溶酶给药组(8只)、低剂量可口革囊星虫重组纤溶酶给药组(8只)、尿 激酶阳性对照组(8只)和血栓模型组(10只)。除了正常对照组以外，其他各 组均在小鼠背部皮下注射1％角叉菜胶溶液，注射剂量为200μL/10g。正常 对照组的小鼠在其背部皮下注射生理盐水，注射剂量为200μL/10g。注射生 理盐水或角叉菜胶后，小鼠饲养于20±2℃条件下。48h后，观察小鼠尾 部出现淤血、变黑，造模完成。

4.1.2.2、分组给药

角叉菜胶注射48h后，低剂量可口革囊星虫重组纤溶酶给药组，注射 可口革囊星虫重组纤溶酶剂量为4mg/kg；高剂量可口革囊星虫重组纤溶酶 给药组，注射可口革囊星虫重组纤溶酶剂量为20mg/kg；尿激酶阳性对照 组，注射尿激酶的剂量为100U/25g；血栓模型组，注射生理盐水的量为8 mL/kg。除正常组外，其余各组每日给药，腹腔注射一次，连续注射三天。

4.1.2.3、小鼠凝血时间测定

给药后72h后，各组注射2％戊巴比妥钠，注射剂量为8mL/kg，待小 鼠麻醉后，用毛细玻璃管法测定各组小鼠的凝血时间。具体的实验步骤为： 剪断小鼠尾部滴2滴血在玻璃片上，立即将血吸入毛细玻璃管(内径 0.03mm，长10cm)内，平放于桌面后开始计时，2min后每隔30s折断一端 毛细管约0.5cm，并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝，至血凝丝 出现为止，所历时间即为凝血时间。

数据的统计分析

实验数据用均数±标准差表示，统计方法为单因素方差分析，用 SPSS16.0统计软件处理。

实验结果表明：在各组小鼠给药72h后，用毛细玻璃管法测定凝血时 间。其他各组与正常组相比，注射了1％角叉菜胶后使得小鼠的凝血时间 明显缩短(*P<0.01)。高剂量可口革囊星虫重组纤溶酶给药组、低剂量可口革 囊星虫重组纤溶酶给药组和尿激酶阳性对照组与模型组比较凝血时间差异 不显著(*△P>0.05)。

可口革囊星虫重组纤溶酶对角叉菜胶引起的小鼠黑尾发生率的影响

在角叉菜胶致小鼠尾部血栓的实验中，观察各组在给药72h的变化： 血栓模型组，注射生理盐水8mL/kg，黑尾发生率为100％；可口革囊星虫 重组纤溶酶低剂量给药组，给药剂量为可口革囊星虫重组纤溶酶4mg/kg， 黑尾发生率为71.4％；可口革囊星虫重组纤溶酶高剂量给药组，给药剂量 为可口革囊星虫重组纤溶酶20mg/kg，黑尾发生率为40％；尿激酶阳性对 照组，给药剂量为尿激酶100U/25g，黑尾发生率为28.6％。

由上述实验结果可知，可口革囊星虫重组纤溶酶具有直接溶栓的作用， 且具有体内外溶栓作用，因此具有重要的临床开发价值。

4.2、可口革囊星虫重组纤溶酶利用纤维平板法进行纤溶活性实验

图4为可口革囊星虫重组纤溶酶利用纤维平板法进行纤溶活性的检测 结果示意图，其中，0：尿激酶；1：PFE1(毕赤酵母表达)；2：PFE2(毕 赤酵母表达)；3：大肠杆菌裂解液(空质粒)；4：毕赤酵母菌液上清；5PFE1 (大肠杆菌表达)；6：PFE2(大肠杆菌表达)。