用于植物的重组蛋白的过度表达的具有最佳的5’(5’-UTR)前导区功能的人工DNA序列和产生植物的重组蛋白的方法

摘要

5’-UTR前导区的人工DNA，该人工DNA对增加植物的重组蛋白的表达有效，并且，沿5’→3’方向，包含Inr起始位点和Kozak或Kozak样共有序列，并且，还在所述Inr起始位点和所述Kozak或Kozak样共有序列之间包含多个多聚(CAA)区以及与所述多聚(CAA)区数量相同的多个多聚(CT)区，其中，在5’→3’方向，至少一个，任选每个，多聚(CAA)区是多聚(CT)区的上游，并且，在5’→3’方向，至少一个多聚(CAA)区与多聚(CT)区相邻，其中，所述人工DNA没有提供A/T-富集基序、三核苷酸元件ATT、三核苷酸元件CTG和同聚体片段，即，由超过3个，任选超过4个相同核苷酸组成的序列。

说明书

技术领域

本发明关于用于植物的重组蛋白的过度表达的具有最佳的5’(5’-UTR)前 导区功能的人工DNA序列和产生植物的重组蛋白的方法。

背景技术

为了改善植物的异源基因的表达有多个可以采用的方法。实际上，组成 基因的所有元件对基因表达运用或能够运用控制功能，调节转录和/或翻译过 程。位于mRNA的5’端和3’端的非翻译序列(称作5’-UTR和3’-UTR，这里 UTR代表“非翻译区”)对此没有例外，并且实际上必须被认为是适当修饰的优 先目标，因为，在很大程度上，它们决定mRNA本身的翻译效率和周转 (turn-over)。实际上，丰富的证据证明：

-位于mRNA的5’末端的m7Gppp(5’-帽子)结构对募集能够结合核糖体 40S亚基的eIF4F复合体是必要的(Franks和Likke-Andersen,2008)；

-通过eIF4G部分，eIF4F复合体与位于mRNA的3’末端的多聚腺苷酸 (poly(A))尾反应，允许后者呈现环状结构(Franks和Likke-Andersen,2008)；

-多聚腺苷酸尾和eIF4F复合体减少5’-帽子结构的酶水解，从而防止细 胞质核酸外切酶作用在单磷酸5’末端导致mRNA的快速降解(Franks和 Likke-Andersen,2008)；

-5’-UTR序列可含有能够影响5’-帽子结构的形成、后者与eIF4E因子的 结合、核糖体40S亚基的募集、多核糖体的组成、43S复合体的自发离解速 率、真实翻译起始密码子的识别的元件；

-5’-UTR序列还可含有向特异性转录因子的DNA呈现结合位点的序列， 从而可以修饰启动子上游的转录活性。

因此很明显，5’-UTR，还称为前导区，在植物工程计划中需要被特别考 虑以便增加重组蛋白的表达水平。

但是，由于各种原因，即使对于本领域的技术人员来说，根本不容易设 计出高效前导序列。第一，必须考虑在属于相同基因组或相关基因组的不同 基因的前导区之间看得见的序列中的巨大的变异性。该变异性使识别能够将 改善的特征赋予前导区的潜在片段非常困难，并且尤其是，不可能预测与组 成5’-UTR区的其他元件或序列的可能的相互作用。第二，前导区的总长可 能必须被包含在100-120bp内，优选80bp，以便不增加来自所述区本身的 43S复合体的自发离解的频率。这把实际上将用于前导区片段的结构的成分 的严格挑选强加于其他的损害。第三，所述前导区不应含有回文序列或G/C 富集的核苷酸组成，以便防止通过eIF4A的介入不能分解的转录物的二级结 构的形成。最后，但是无论如何是重要的，序列的小部分(大约10％)不能随 意改变，而是必须含有基本功能元件，如，具体地，Inr起始位点和Kozak 基序或相当的Kozak样基序。

申请WO2008/080954描述了5’-UTR序列内重复的CAA元件和重复的 CT元件的组合可用来增加植物中重组蛋白的表达。此外，还描述了多聚(CAA) 和多聚(CT)与CaMV(即，花椰菜花叶病毒)35S启动子的转录起始位点(Inr) (Guilley等,1982)和/或与来自TMVΩ前导区的ACAATTAC八聚体(Gallie和 Walbot,1992)的共存。实际上，WO2008/080954描述了含有例如所有以上引 用的元件的称为LLTCK的前导序列：

1.用于有效mRNA加帽的CaMV35S基因的Inr位点；

2.与位于TMVΩ前导区的“翻译增强子”相似的多聚(CAA)区(Gallie 和Walbot,1992)；

3.富集CT元件的序列，与某些植物前导区相似(Bolle等,1996)；

4.TMVΩ前导区的八聚体。

使用存在于大量商用载体中的CaMV35S基因的前导作为比较，在组成 型CaMV35S启动子的控制下，测定uidA报告基因(编码酶β-葡糖醛酸糖苷 酶,GUS)的表达水平来用烟草评估WO2008/080954中的LLTCK前导区的作 用。LLTCK前导区测定GUS酶的浓度的增加等于控制前导区的8-12倍。

但是需要进一步增加用于转基因的表达的5’-UTR片段的效率，从而增 加植物的重组蛋白的效率。

尤其是，考虑到LLTCK是已知在遗传信息的转录和翻译过程上起作用 的仅有的合成高效前导区，与现有技术相比，为了进一步增加用于转基因在 植物中的表达的5’-UTR片段的效率，有用的是将该前导区认作介入的模式 或起始点来改善它们。

如我们所说，WO2008/080954提供组合重复的CAA元件与重复的CT 元件并且识别能够使得该组合的优点更明显的一系列因子。

优先申请与各个因子有关。给出由TMVΩ前导区包含的八聚体基序 ACAATTAC的存在的特有的重要性；实际上，根据WO2008/080954，有效 地前导区可源于连接TMVΩ前导区的片段与含有重复的CT基序的区域。

由WO2008/080954已知的Ω前导区中，可见不同类型的重复序列：一 个这样的序列由重复11次的三核苷酸CAA表示，尽管不总是连续地；其他 序列由重复3次的八聚体基序ACAATTAC来表示。

已根据实验证明两种序列可导致基因表达大大增加，作用在转录后水平 上。

尽管所述八聚体含有三核苷酸CAA，但基因表达的增强与整个序列的存 在有联系，而不是与CAA单独的存在有联系。

重要的是强调所述八聚体含有A/T富集的片段，即，依次包含ATT三联 体的AATTA。

作为可能的优先的技术方案，WO2008/080954的发明人指出，即使这里 含有AATTA序列，仍然保留八聚体序列ACAATTAC，由此得出不在经典中 的翻译起始位点ATT。

显然，他们相信，包含上述提及的八聚体基序是更重要的，即使这里需 要A/T富集序列的引入并且其具有推定的翻译起始密码子。必须强调的是， 在WO2008/080954的ID序列n°1(LLTCK)中，其他A/T富集序列被特别注 释，分别放置：

1.直接在起始位点的下游(TATTTTTA)；

2.在多聚(CAA)(AATA)片段内部；

3.在该片段末尾，在再次包含八聚体的位点中(ATTA)；

4.恰好在八聚体的下游(TATTT)。

与所述八聚体一样，四个序列中的三个序列含有三联体ATT。

为了比较，我们现将给出，已知的序列LLTCK前导区，突出显示A/T 富集区(画线的)和ATT三联体(较大字体)；以粗体表示与所述八聚体基 序一致的片段ACAATTAC：

ACACGTTTTACAACAATACCAACAACAACAACAACAAACAACGTATTTCTCTCTCTAGA

我们还强调该已知LLTCK序列没有提供任一相邻多聚(CT)区的多聚 (CAA)区。

还在这种情况下，尽管他们意识到在A/T富集区内部的不在经典中的翻 译起始位点的存在，但WO2008/080954的发明人已经提供在有效前导区的 结构如LLTCK中使用所述区。

实际上，不但在TMVΩ前导区中而且在通常用作翻译增强子作为替代 Ω的AMV前导区的核心处发现所述A/T富集序列，具体为上述类型1和4。

以下，为了比较，我们给出突出显示的TMVΩ前导区(a)和AMV前 导区(b)的序列，A/T富集区(画线的)和ATT三联体(较大字体)：

(a)

ACCTCGAGTTTTACAACAACCAACAACAACAAACAACAAACAAC ACAACTTACAACACC

(b)

ACCTCGAGTTTTTTTTATTCTTTCAAATACTTCCATCCC

关于ATT三联体在诱导所述前导区内部的mRNA的不需要的点的翻译 过程的开始方面的实际意义，这里必须注意的是，真正的翻译起始密码子 (ATG)需要足以照此被翻译复合体识别的背景序列；对于本领域的技术人 员来说非常可能的是，为了不在经典中的翻译起始三联体(如ATT和CTG) 的识别，适当的背景必须同样存在。

但是，三联体的识别背景目前是未知的，因此技术人员不能够通过评估 现有技术的状况来证实，某些三联体ATT(或CTG)是否实际表现不在经典 中的翻译起始位点或者某些三联体ATT(或CTG)怎样实际表现不在经典中 的翻译起始位点。

面对这一的证据，在确定使用Ω、AMV或源于此的前导区的选择方面， 实验上证实，在基因表达的水平上包含Ω前导区或AMV前导区的积极作用 是重要的。

但是，技术人员已知，如果前导区内部的ATT或CGT三联体确实被解 释为翻译起始密码子，将产生非计划的不同蛋白质，并且这可以导致功能和 结构生物等效性的问题，在成为意欲治疗应用的蛋白质的情况下尤其严重。

主要在制药领域工作的WO2008/080954的发明人，意识到潜在危险， 并且，通过在相互对应的距离(其通常是3的倍数)上放置所有ATT三联体 并且使框架中的终止密码子(TAG)相对于它们向前导序列的末尾来谨慎地 构建他们的5’-UTR序列。甚至更巧妙地，LLTCK序列的末尾由XbaI的限 制性内切位点(TCTAGA)表示，该限制性内切位点具有三重作用：产生终止 密码子(TAG)，有助于形成多聚(CT)区，使可能的背景有利于直接位于 下游的真正起始密码子的识别，以及在所需编码序列的5’处建立极其有用的 克隆位点。

其他技术人员行为不同，并且在相对A/T富集的序列内部简单舍弃ATT 三联体。

实际上，一般甚至在来自真正阅读框架的分支位置发现具有含ATT三联 体的计划序列的合成前导区。

由以上可以得出的结论是，如同在此描述之前的其他专利或出版物，WO 2008/080954：

1.没有教导从5’-UTR序列中移除A/T富集基序，而是正相反；

2.没有教导从源于Ω或源于AMV的5’-UTR序列中移除ATT三联体， 而是正相反；

3.没有教导如何在没有A/T富集基序的情况下使背景有利于基因表达， 它们是否含有ATT三联体；

4.没有教导如何建立对用于WO2008/080954的实施例的LLTCK前导 区更有效的变异体。

无论明确地还是含蓄地，现有技术的状况决没提出或促进所有这些经过 深思熟虑的移除A/T富集序列和ATT三联体的需要，因此其是对于本领域的 技术人员来说绝不是显而易见的。

此外，因为每个核苷酸置换、缺失或插入可能产生有意外变化的前导区， 并且该移除的作用如任一其他5’-UTR序列的操作一样是对本领域的技术人 员来说绝不是显而易见的。

因此，本发明以新颖的和创造性的方式提出，构成有力的技术方案的以 新元件或新元件组合赋予的5’-UTR变异体的合成，能够修饰并显著改善现 有技术的状况。申请人设计、验证并实施本发明来获得这些和其他的目的与 优势。

除非另有定义，这里和以下使用的所有技术和科学术语与由本发明所属 技术领域内的有普通经验的人员通常所理解的具有相同的意思。即使在本发 明的实践和实验中可以使用与这里描述的相似或相等的方法和材料，以下描 述该方法和材料作为范例。如果发生冲突，本申请，包括它的定义，将优先。 该材料、方法和范例完全为说明目的并且不应限制理解。

发明内容

本发明提出并以独立权利要求为特征，而从属权利要求描述本发明的其 他特征或主要发明构思的变化。

根据以上目的，本说明书涉及植物生物技术的领域，并且尤其涉及，通 过使用根据本说明书适当构建的经人工合成和智力的产物获得的人工前导区 而造成遗传修饰的植物的重组蛋白的生产水平的提高，这是因为在自然界中 没有发现它们。

这里描述的实施方式的某些形式指用于植物的转基因的表达的5’-UTR 前导区的人工DNA。根据本说明书的特征的人工DNA对增加植物的转基因 的表达是有效的，并且，沿5’→3’方向，分别在相应的5’末端和3’末端包含 Inr起始位点和Kozak或Kozak样共有序列。根据本说明书的特征的人工DNA 还在所述Inr起始位点和所述Kozak或Kozak样共有序列之间包含多个多聚 (CAA)或(CAA)_n区，其每个通过由彼此相邻的两个或更多个拷贝的CAA元 件组成的低聚核苷酸来形成，和与所述多聚(CAA)区数量相同的多个多聚(CT) 或(CT)_m区，并且其各自通过由彼此相邻的两个或更多个拷贝的CT元件组成 的低聚核苷酸来形成，其中，在5’→3’方向，至少一个，任选每个，多聚(CAA) 区是多聚(CT)区的上游，即，在5’位置，并且，在5’→3’方向，至少一个多 聚(CAA)区与多聚(CT)区相邻。

在实施方式的一些形式中，所述人工DNA提供无法与A/T-富集基序有 关的序列的存在，即，其提供A/T-富集基序的缺乏。

在实施方式的一些形式中，在根据本说明书的人工DNA中不存在的A/T- 富集基序可以被定义为由超过3个，任选超过4个腺嘌呤核苷酸(A)和/或 胸腺嘧啶核苷酸(T)以彼此任意结合的方式组成的片段或序列。

在实施方式的一些形式中，所述人工DNA提供无法与三核苷酸元件ATT 有关的序列的存在，即，其提供三核苷酸元件ATT的缺乏。

在实施方式的一些形式中，所述人工DNA提供无法与三核苷酸元件 CTG有关的序列的存在，即，其提供三核苷酸元件CTG的缺乏。

在实施方式的一些形式中，所述人工DNA提供同聚体片段(即，由超 过3个，任选超过4个相同核苷酸组成的序列)的缺乏。

在实施方式的一些形式中，对于多聚(CAA)区可以选择相同的n值，或 对于各种多聚(CAA)区可以自主地选择n值，即，相对于一个或多个其他多 聚(CAA)区，对于多聚(CAA)区的至少一个可以选择不同的n值。

在实施方式的一些形式中，n是大于或等于2，任选地被包含在3至9 之间，任选在4至8之间，任选在5至7之间的整数。

在实施方式的一些形式中，对于至少一个多聚(CAA)区来说，n等于7， 例如，对于至少两个多聚(CAA)区来说，n等于7。

在实施方式的一些形式中，对于多聚(CT)区可以选择相同的m值，或对 于各种多聚(CT)区可以自主地选择m值，即，相对于一个或多个其他多聚(CT) 区，对于多聚(CT)区的至少一个可以选择不同的m值。

在实施方式的一些形式中，m是大于或等于2，任选地被包含在3至5 之间的整数。根据一些方面，对于至少一个多聚(CT)区来说，m等于5，根 据另一些方面，对于至少一个多聚(CT)区来说，m等于3。在可能的实施中， 对于一个多聚(CT)区来说，m等于5，并且对于另一个多聚(CT)区来说，m 等于3。

在实施方式的一些形式中，所述人工DNA含有两个多聚(CAA)区和两个 多聚(CT)区，它的一个多聚(CAA)区可以相邻一个多聚(CT)区，而且也许另 一个多聚(CAA)区与另一个多聚(CT)区可以不相邻。

在实施方式的一些形式中，第一多聚(CAA)区是第一多聚(CT)区的上游， 即，在5’位置，并且第二多聚(CAA)区是所述第一多聚(CT)区的下游和第二 多聚(CT)区的上游，即，在5’位置。

在实施方式的一些形式中，所述第一多聚(CAA)区与所述第一多聚(CT) 区相邻。

在实施方式的另一些形式中，所述第一多聚(CAA)区与所述第一多聚(CT) 区不相邻。

在实施方式的一些形式中，所述第二多聚(CAA)区与所述第一多聚(CT) 区相邻。

在实施方式的另一些形式中，所述第二多聚(CAA)区与所述第一多聚(CT) 区不相邻。

在实施方式的一些形式中，所述第二多聚(CAA)区与所述第二多聚(CT) 区相邻。

在实施方式的另一些形式中，所述第二多聚(CAA)区与所述第二多聚(CT) 区不相邻。

在实施方式的一些形式中，对于所述第一多聚(CAA)区来说，n的值等 于7，即，其包含7个拷贝的CAA三联体。

在实施方式的一些形式中，对于所述第二多聚(CAA)区来说，n的值等 于7，即，其包含7个拷贝的CAA三联体。

在实施方式的一些形式中，对于所述第一多聚(CT)区来说，m的值等于 5，即，其包含5个拷贝的CT二核苷酸。

在实施方式的一些形式中，对于所述第二多聚(CT)区来说，m的值等于 3，即，其包含3个拷贝的CT二核苷酸。

在实施方式的一些形式中，在所述第二多聚(CAA)区和所述第二多聚(CT) 区之间，有AG序列。在实施方式的一些形式中，在所述第二多聚(CAA)区 和所述第二多聚(CT)区之间，只有AG序列。

在实施方式的一些形式中，所述InrI起始位点是CaMV35S转录的起始 位点，或者它是具有共有序列5’-YYANWYY-3’的Inr起始位点，其中：

Y＝C,T；

N＝A,C,G,T；

W＝A,T。

在实施方式可能的范例形式中，所述Inr起始位点是5’-TCACATC-3’。

在实施方式的一些形式中，在所述Inr起始位点和所述第一多聚(CAA) 区之间沿5’→3’方向有AAGTTTC序列。在实施方式的一些形式中，在所述 Inr起始位点和所述第一多聚(CAA)区之间沿5’→3’方向只有AAGTTTC序 列。

在实施方式的一些形式中，所述人工DNA的长度包含在40至150bp 之间。

在实施方式的一些形式中，所述人工DNA具有小于50％的GC含量。

在实施方式的一些形式中，所述人工DNA包含在SEQIDNO:1中显示 的序列，或在SEQIDNO:2中显示的序列，两者都包括在所附序列表中。

在实施方式的一些形式中，所述Kozak或Kozak样共有序列是需要在-3 位置(即，位于翻译起始密码子上游的第三位置)是嘌呤的元件R的存在的 序列。

在实施方式的一些形式中，根据本发明的人工DNA不包含八聚体 ACAATTAC。

这里描述的实施方式的一些形式涉及表达载体，其包含根据这里描述的 实施方式的对增加植物的重组蛋白的表达有效的5’-UTR前导区的形式的人 工DNA，尤其是，例如，人类蛋白。

在实施方式的一些形式中，所述表达载体包含：

i)编码蛋白质的成熟形式的天然或人工来源的核苷酸序列的天然或人工 来源上游(即，在5’位置)的胚乳特异性启动子。

ii)如这里描述的对增加植物的重组蛋白的表达有效的5’-UTR前导区的 人工DNA；

iii)编码靶向在构成胚乳的组织从而促成它的组织堆积的细胞的内质网 腔内部的重组蛋白的信号肽的天然或人工来源的核苷酸序列；

iv)编码目的蛋白质的成熟形式的天然或人工来源的核苷酸序列；

v)天然或人工来源的3’-UTR区。

在实施方式的一些形式中，所述启动子i)是水稻的谷蛋白4基因(GluB4) 的启动子。

在实施方式的一些形式中，元件iii)的核苷酸序列是编码用于水稻中来 转运在内质网内部的谷蛋白4的前体的信号肽的序列PSGluB4。

在实施方式的一些形式中，元件iv)的核苷酸序列是编码β-葡萄糖苷酸 酶(enzymeacidbeta-glucosidase)的成熟人类形式的序列。

在实施方式的一些形式中，元件v)的3’-UTR区是NOS终止子或基因 GluB4的终止子。

这里描述的实施方式的一些形式涉及包含含有如这里所述的人工DNA 序列的质粒的菌株，尤其是，例如，从包含大肠杆菌(Escherichiacoli)、根 癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)物种的组中选择的。

不考虑寄主微生物的类型，这里描述的实施方式的某些形式涉及含有如 这里所述的根据实施方式的人工DNA序列的工程菌株。

在包含组成型启动子、组织特异性启动子并且尤其例如种子特异性的、 诱导型启动子、具有相依赖转录活性的启动子、作用于叶绿体的启动子和作 用于线粒体的启动子的控制下，这里描述的实施方式的某些形式涉及具有含 如这里所述的人工DNA序列的表达载体的转化的植物细胞。

这里描述的实施方式的一些形式涉及以信使RNA含有这里所述的人工 DNA序列的任何蛋白的瞬时表达为特征的植物；以瞬时表达我们指通过病毒 载体、农杆菌注射渗透、微粒体的轰击、电穿孔产生该蛋白质。

这里描述的实施方式的一些形式涉及用含有根据这里所述的实施方式的 形式的人工DNA序列的表达载体稳定转化的双子叶植物。

在实施方式的一些形式中，所述双子叶植物包含属于茄科(Solanaceae)、 蝶形花亚科(Papilonaceae)和/或十字花科(Cruciferae)的一种或多种物种。

这里描述的实施方式的一些形式涉及以上双子叶植物的子代。

这里描述的实施方式的一些形式涉及用含有根据这里描述的实施方式的 形式的人工DNA的表达载体转化的单子叶植物。

在实施方式的一些形式中，所述单子叶植物包含属于禾本科 (Graminaceae(Poaceae))(如，例如栽培稻(OryzasativaL.)、玉米(Zeamays L.)、大麦(HordeumvulgareL.)和/或小麦(Triticumspp.))的一种或多种物种。

这里描述的实施方式的某些形式涉及以上单子叶植物的子代。

实施方式的某些形式涉及为了使用从组中选择的根据这里描述的实施方 式的形式的人工DNA，该组包含：

-用于分子的生物技术产品；

-用于重组蛋白的合成，尤其是，例如，意欲诱导对于病毒、细菌或真菌 病原体的抗性，或意欲诱导对于灭草剂的抗性，或用于获得原材料的脂肪酸 中和由此得到的产物中的改变的组合物，或用于获得原材料和由此获得的产 物的改变的营养值，或用于染料、橡胶和/或生物塑料的制造。

-用于工业酶类和商业蛋白质类的合成；

-用于制药蛋白质的合成；

-用于从组中选择的疫苗的合成，该组包含：意欲用于人类或动物的经口 施用的疫苗、意欲用于人类或动物的可注射的疫苗、患者特异性可注射疫苗、 优选用于治疗淋巴系统的癌症的个体基因型特异性的。

-用于参与次级代谢产物的产生的蛋白质的合成；

-用于在转化细胞的鉴定和/或选择中可直接或间接作为因子使用的蛋白 质的合成。

这里描述的实施方式的一些形式涉及为含有根据这里描述的实施方式的 形式的表达载体的人类蛋白(尤其是，例如人溶酶体酶)的表达而转化的植 物的种子。

这里描述的实施方式的一些形式涉及以上用于治疗处理的种子，尤其是 例如，用于酶替代疗法，甚至尤其是例如，用在以下疾病中：高歇氏病，糖 原贮积病II型或庞佩氏病，法布里氏病，尼曼-皮克病B型，黏多糖贮积病I、 II、III型。

实施方式的一些形式涉及产生植物的重组蛋白的方法，其包括使用如这 里描述的表达载体进行的植物的转化。

在实施方式的一些形式中，植物的转化对实现蛋白质在胚乳中的约束空 间而不被胚吸收有效，并且允许种子的胚乳中大量蛋白质的存在不会对种子 发育能力和发芽速度引起反作用。

在实施方式的一些形式中，所述方法提供在植物种子的胚乳内部堆积蛋 白质，尤其是例如，在蛋白储藏空泡(PSV)或蛋白质体(PB)内部的胚乳中堆积 蛋白质。

在实施方式的一些形式中，将所述表达载体引入到直接或间接用于植物 转化的菌株中，其中所述菌株可以从包含大肠杆菌(Escherichiacoli)、根癌 土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)物种的组中选择。

在实施方式的一些形式中，所述转化的植物是谷类植物。

在实施方式的一些形式中，所述菌株用于胚胎发生的水稻愈伤组织(水稻 (Oryzasativassp).日本产植物)的转化。

在实施方式的一些形式中，所述重组蛋白是溶酶体酶，尤其是例如，人 β-葡萄糖苷酸酶，或例如人α-葡萄糖苷酸酶(acidalpha-glucosidase)。

在实施方式的一些形式中，所述方法包括植物种子的产业加工。

在实施方式的一些形式中，植物种子的产业加工提供去壳并磨光由转化 的谷类植物收集的成熟种子，以便移除纤维性部分、胚芽和含有蛋白污染物 的糊粉层。

在实施方式的一些形式中，所述方法包括所获得的蛋白质的提纯。

在实施方式的一些形式中，所述提纯按顺序提供，具有疏水性相互作用 的色谱法、具有离子交换的色谱法和凝胶过滤。

在实施方式的一些形式中，所述提纯提供应用在化学组成和/或结构和/ 或功能方面相似的色谱树脂，部分修改洗脱参数，并且重复在柱中再填装洗 脱馏分的经过。

附图说明

本发明的这些和其他特征将从以下实施方式的一些形式的描述中变得明 显可见，参考附图作为非限制性实施例给出，其中：

-图1显示在用pSTART和pSTART-STE转化的烟草植物中使用4-MUG 测定获得的值的分布；

-图2显示在包含LLTCK前导区和STE前导区的植物中，使用 DAS-ELISA测定评估的并以μgGCasi每克米粉表示的GCasi蛋白质含量的 分布；

-图3A显示烟草pSTART-STE中的表达载体的示意图，其中：

RBR:右边重复序列

LBR:左边重复序列

35SCaMV:花椰菜花叶病毒的启动子35S

GUS:报告蛋白

NOSter:根癌土壤杆菌的胭脂碱合酶的终止子

-图3B显示含有CaMV35S启动子的一部分(从ScaI位点开始)和STE 前导区的人工合成片段；

-图4A显示水稻表达载体 pCAMBIA1300/PMI/GluB4-LLTCK/STE::GCasi::GluB4ter的示意图；其中：

RBR:右边重复序列

LBR:左边重复序列

GluB4-LLTCK:水稻的谷蛋白4启动子和LLTCK前导区

GluB4-STE:水稻的谷蛋白4启动子和STE前导区

GCasi:人β-葡萄糖苷酸酶(hGCasi)的基因编码

GluB4ter:水稻的谷蛋白4终止子

35Spro:CaMV35S启动子

PMI:磷酸甘露糖异构酶的基因编码(转化植物的选择标记)

35Ster:CaMV35S终止子

-图4B和4C分别表示含有GluB4启动子的最终部分(从BfrI位点开始) 和前导区LLTCK和STE的人工合成的片段。

具体实施方式

现在我们将对本发明的实施方式的各种形式详细说明，以下描述其一种 或多种实施例。各实施例以本发明的说明形式供给，并且将不被理解为它的 限制。例如，所显示或描述的特征，由于它们是实施方式的一种形式的部分， 可以被采用或与实施方式的其他形式联合来产生实施方式的另一种形式。应 当理解的是本发明将包括所有这样的修改和改变。

与现有技术的状况相比，在企图进一步增加用于植物的转基因的表达的 5’-UTR片段的效率的情况下，已经设计出人工DNA序列，以下称为STE、 STE序列或STE前导区，其含有如WO2008/080954所公开的重复的CAA 三核苷酸元件和重复的CT二核苷酸元件，将该STE序列优化用于植物的重 组蛋白的过度表达。

应当注意的是，新发明的STE序列已经给出两个不相关的植物物种的基 因表达的增加并且与不同启动子、终止子和编码序列联合。

从如上所讨论的现有技术的状况开始，申请人进行其他实验意欲开发根 据本说明书的新型的前导区。

尤其是，申请人考虑许多攻击植物的病毒产生没有5’-帽子(并且在许多 情况下还没有多聚腺苷酸尾)的信使。这个证据让申请人假设在这些病毒中， 5’(5’-UTR)和3’(3’-UTR)包含序列(harborsequence)中的未翻译区能够在功 能上分别代替5’-帽子结构和多聚腺苷酸尾。这些序列，在病毒的信使中是必 不可少的，但是，在真核基因的前导区的内部可能是不重要的，并且特别是 植物基因，因为它们产生的信使通常具有5’-帽子(除了极少例外)和多聚腺 苷酸尾。

尤其是，申请人假设对病毒前导区是必需的而对真核基因前导区不是必 需的序列与一种或多种A/T富集序列一致，像例如，先前由LLTCK内部的 数字1-4表示的那些或它们的一部分。因此，设计活动以获得完全没有A/T 富集序列从而没有Ω八聚体区和ATT三联体的合成前导序列的意图开始； 在新的前导区形成的情况下，还决定排除三核苷酸CTG和由任意核苷酸的重 复形成的同聚体片段。为保持前导区的长度相对于WO2008/080954实质上 不变，所述A/T富集区由重复的CAA和CT基序代替。在不同背景中，将所 得序列，称为STE，与WO2008/080954的seq.IDno.1比较。

获得的结果得到证实，与基于技术人员可用的现有技术的状况所预期的 不同，根据申请人的假设，排除A/T富集元件并用重复的CAA和CT元件代 替它们总是导致用于前导区之间的对比实验的报告基因表达的显著增加，即 使将所述A/T富集元件保留在通常用作翻译增强子的病毒前导区内部。与 WO2008/080954中的LLTCK相比，根据本说明书的新型5’-UTR表现出工 业领域中对解决与异源蛋白的有效生产、提取和提纯有关的问题的有用的更 好的技术方案。

因此，这里描述的实施方式的形式提供对增加植物的重组蛋白的表达有 效的5’-UTR前导区的人工DNA，该人工DNA，沿5’→3’方向，包含多个多 聚(CAA)或(CAA)_n区，和与所述多聚(CAA)区数量相同的多个多聚(CT)或 (CT)_m区

在实施方式的一些形式中，各多聚(CAA)区通过由彼此相邻的两个或更 多个拷贝的CAA元件组成的低聚核苷酸来形成。

在实施方式的一些形式中，各多聚(CT)区通过由彼此相邻的两个或更多 个拷贝的CT元件组成的低聚核苷酸来形成。

在实施方式的一些形式中，在5’→3’方向，至少一个(任选每个)多聚 (CAA)区是多聚(CT)区的上游，即，在5’位置。

在实施方式的一些形式中，在5’→3’方向，至少一个多聚(CAA)区与多 聚(CT)区相邻。

在实施方式的一些形式中，n为整数，其在所述多聚(CAA)区之中可以 选择相等或不同，大于或等于2，任选地被包含在3至9之间，任选地在4 至8之间、任选地在5至7之间。例如，对于所述多聚(CAA)区来说，n值 可以相同，并且可以例如等于7。

在实施方式的一些形式中，m为整数，其在所述多聚(CT)区之中可以选 择相等或不同，大于或等于2，任选地被包含在3至5之间。例如，对于所 述多聚(CT)区来说，m值可以不同，并且可以例如等于3或5。

尽管通常可以选择n和m的值彼此不同，但可以提供选择n和m的值 彼此相同的实施方式的一些形式。

在可能的实施中，可以设置两个多聚(CAA)区和两个多聚(CT)区。沿 5’→3’方向，可以设置第一多聚(CAA)区，随后的第一多聚(CT)区，与在先的 第一多聚(CAA)区相邻，相继的第二多聚(CAA)区，与在先的第一多聚(CT) 区相邻，以及相继的第二多聚(CT)区，与第二多聚(CAA)区不相邻。

在实施方式的一些形式中，STE序列可以以与WO2008/080954相比改 善的方面为特征，并且参考以下特征的一种或多种，意欲使STE序列与真核 表达系统更相容：

1.A/T-富集基序(即，由超过3个，任选超过4个腺嘌呤核苷酸(A) 和/或胸腺嘧啶核苷酸(T)以其任意结合的方式组成的序列)的缺乏；

2.三核苷酸元件ATT的缺乏；

3.三核苷酸元件CTG的缺乏；

4.同聚体片段(即，由超过3个，任选超过4个相同的核苷酸组成的序 列)的缺乏。

换句话说，根据本说明书的人工DNA不含有以下成分的任意一种：A/T- 富集元件、三核苷酸元件ATT、三核苷酸元件CTG和同聚体片段，即，由 超过3个，任选超过4个相同的核苷酸组成的序列。

在实施方式的一些形式中，这里描述的人工DNA序列可含有Inr位点。 所述Inr位点可具有带有如上第1点(A/T-富集基序的缺乏)和第2点(三 核苷酸元件ATT的缺乏)的限制的5’-YYANWYY-3’序列，其中，Y＝C,T；N＝A, C,G,T；W＝A,T；或者，所述Inr位点可具有5’-ACACG-3’序列(CaMV的35S 的转录起始位点)。

在实施方式的一些形式中，在3’端，所述前导区还可含有有利于真正的 ATG翻译起始密码子的识别的核苷酸背景(Kozak或Kozak样基序或共有序 列)。Kozak或Kozak样基序或共有序列需要翻译起始密码子的上游第3位是 嘌呤(腺嘌呤“A”或鸟嘌呤“G”)的R元件的存在，来鉴定对识别真正的翻译起 始密码子来说适合的背景。就在起始密码子的上游第3位(或第-3位)而言， 我们指通常被指定为第+1位的ATG密码子的元件“A”的上游第3位的核苷 酸。Kozak或Kozak样序列可以与例如如上所述的第二多聚(CT)区相继并 相邻。

此外，在实施方式的一些形式中，这里描述的STE前导序列的长度可以 包含在40至150bp之间，并且可任选地具有小于50％的GC含量。

根据实施方式的一些形式的被称为SEQIDNo:1的前导序列的一个范例 是：

(1)5’-ACACGAAGTTTCCAACAACAACAACAACAACAACTCTCTCTCT CAACAACAACAACAACAACAAAGCTCTCTAGA-3’

根据实施方式的一些形式的被称为SEQIDNo:2的前导序列的另一个范 例是：

(2)5’-CACATCAAGTTTCCAACAACAACAACAACAACAACTCTCTCTCT CAACAACAACAACAACAACAAAGCTCTCTAGA-3’

在实施方式的一些形式中，这里描述的前导序列，像例如SEQIDNo:1 和SEQIDNo:2，可在5’上具有Inr起始位点，如CaMV35S的转录起始位 点(SEQIDNo:1,变异体1)或具有真核基因特有的共有序列的Inr位点， 5’-YYA⁺¹NWYY-3’，其中，A⁺¹表示被转录的第一个核苷酸，Y＝C,T；N＝A,C, G,T；W＝A,T(SEQIDNo:2的TCACATC,变异体2)。起始位点的下游，延 伸并且多聚(CAA)或多聚(CT)的交替嵌段接着，重复例如两次。如我们 所说，此外，为了促进ATG起始密码子的识别，Kozak或Kozak样序列可以 存在于3’末端(例如在两种变异体中，其可以被包括在TCTAGA中，对应 于XbaI的限制性位点)。

与WO2008/080954中描述的前导区的类型相比，这里描述的人工DNA 序列可由此提供制造人工5’-UTR的新规范。在WO2008/080954中没有提供 的该规范可反映到前导区的精确的组成和结构的修改中以及新的优先申请 中。

变化的实体可以例如通过比较WO2008/080954中描述的LLTCK序列和 上述的STE前导区的变异体范例推断。后者没有可定义为A/T富集元件(AU- 富集元件,AREs)的任何序列，相反也没有固有地存在于Inr位点的LLTCK 下游和TMVΩ前导区的八聚体的侧方的ATT三联体。

为了说明新STE前导区的更大效率，在它和WO2008/080954中描述的 LLTCK序列之间做比较，分析在无关联的植物物种(如烟草(Nicotiana tabacumL.)和水稻(OryzasativaL.))中的两个报告基因的表达水平。

在烟草中，考虑的基因是uidA(GUS)，并且用于遗传转化的结构(即， 35S-LLTCK::uidA::NOSter(pSTART)和35S-STE::uidA::NOSter (pSTART-STE))分别由LLTCK和STE替代存在于pBI121(Clontech)中的前 导序列来获得(实施例1)。更精确地，将序列pBI121被替代并且操作，包含 在CaMV的Inr35S区(ACACG)(对两种结构保持共有)和限制性位点XbaI (TCTAGA)之间。报告基因的表达水平利用使用荧光计的4-MUG测定来评估 (Jefferson等,1987)，其以相当大的灵敏性、精确性、速度和实行的容易度为 特征。尤其是，为了定量评估转化的植物中的GUS基因的表达，对来源于挤 压三个完全扩张的嫩叶的粗蛋白提取物进行使用荧光计的测定法。以每mg 的蛋白质产生的4-MU的毫摩尔表示的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的比活度的 值归一化为与使用Bradford测定法计算的总蛋白浓度有关。图1表示以降低 顺序在具有两个结构的转化植物上获得的数据(三个叶子的提取物记录的值 的平均数)。

在图1中显示的数据上进行统计学分析，在这种情况下，方差的单相分 析(ANOVA)的结果在下表1中显示。

表1：在具有结构35S-LLTCK:::uidA::NOSter和35S-STE::uidA::NOSter的 转化植物中获得的平均值数据上进行ANOVA。

汇总

方差分析

分析显示在分析的两个群体(pSTART和pSTART-STE)间统计上的显著性 差异(P<0.05)的存在。从表1和图1的共同检验中可以断言STE前导区导致 uidA的表达水平的无边界增加。尤其是，如果在转化的植物的两个群体中考 虑获得的平均值，STE前导区导致报告基因GUS的表达水平与LLTCK相比 增加大约2.8倍。

为证实在烟草(双子叶植物类的模式物种)中看到的，还在广泛用于生 物技术领域的谷物水稻上进行实验。与第一物种一样，完全像其他元件，用 两个表达结构进行比较。尤其是，比较一下载体：

pCAMBIA1300/PMI/GluB4-LLTCK::GCasi::GluB4ter；

pCAMBIA1300/PMI/GluB4-STE::GCasi::GluB4ter。

但是，我们必须强调在水稻中使用不同控制元件在种子特异性表达背景 中测定不同类型的前导区的效果。更精确地，使用水稻的谷蛋白4的启动子 (GluB4)，和对应的终止子(GluB4ter)。作为报告基因，选择hGCasi，即，编 码人β-葡萄糖苷酸酶的序列；重组蛋白的检测可以通过免疫学测定 (DAS-ELISA)以相当大的灵敏性和精确性进行。关于前导序列，在两个载体 中使用GluB4的Inr位点，因为它在真核共有序列YYANWYY的范围内。 此外，CaMV35S启动子的转录起始位点似乎不太适当，因为这个病毒仅攻 击双子叶植物。

使用用于水稻变种CRW3(Oryzasativa,var.CRW3)的转化的电穿孔 将各载体插入到根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中(Hiei等,1994)。 获得转基因植物的两个群体，各由50个单独的植物组成。收集各植物的成熟 的种子，并且用于总蛋白提取。在DAS-ELISA中分析获得的蛋白质提取物 来评估GCasi含量。图2显示所获得的数据的分布。

方差的单向分析得以证实，被考虑的在水稻的两个群体之间发现的报告 基因的表达的差异是统计上显著的(表2)。

表2：在具有结构pCAMBIA1300/PMI/GluB4-LLTCK::GCasi::GluB4ter 和pCAMBIA1300/PMI/GluB4-STE::GCasi::GluB4ter的转化的植物中获得的 数据上进行ANOVA。

汇总

方差的分析

从表2和以上显示的图2中的图表明白的是STE前导区给出的表达水平 的确大于LLTCK前导区。尤其是，STE前导区导致报告GCasi基因的表达 水平增加了LLTCK前导区的大约3.5倍。

实施例

实施例1：烟草pSTART-STE的表达载体的产生

载体pSTART-STE的产生的起点是在先前的工作(DeAmicis等,2007)中 获得的表达载体pSTART。依次从原始载体pBI121(Clontech)的修饰获得的最 终载体具有由具有LLTCK前导区的CaMV35S启动子、编码GUS蛋白的报 告基因和NOS终止子组成的表达盒。为获得pSTART-STE(图3A)，pSTART 中的LLTCK前导区由STE前导区代替。为了这个目的，人工合成与部分35S 启动子(从ScaI位点开始)对应的序列，向其中加入STE前导区的序列，在这种 情况下在实施例中形成SEQIDNo:1。合成的片段(702bp,图3B)通过用限制性 内切酶ScaI和XbaI消化、载体回收和新合成的序列用DNA连接酶连接来在 pSTART中进行替换。

实施例2：具有启动子GluB4和前导区LLTCK和STE的表达载体的产生

人工合成前导序列LLTCK和STE。尤其是，在两种情况下，合成的片 段对应于包含在存在于水稻的谷蛋白4启动子(GluB4)的末端部分的位点Bfr I和存在于前导区自身的3’末端的位点XbaI之间的序列(图4B和4C)。更精 确地，所得该片段对于LLTCK来说等于328bp(图1B)，而对于STE来说 等于315bp(图4C)。

为了生产最终表达载体，对于两个前导区平行进行一系列的中间亚克隆 步骤，这使得表达盒的最终装配。在最初的步骤中，自然存在的GluB4启动 子的下游的前导区由合成前导区LLTCK和STE代替。起始点是含有与天然 前导区(GenBankacc.n°AY427571)融合的谷蛋白4的启动子的载体 pGEM-T/GluB4-NAT。GluB4启动子的末端片段(从位点BfrI开始)和天然前 导区通过用酶BfrI和XbaI消化来移除并由新的合成的序列来代替。这样， 产生两个中间载体，pGEM-T/GluB4-LLTCK和pGEM-T/GluB4-STE，随后通 过PCR分析、酶的消化和测序来验证。

从载体pUC18/GluB4ter开始装配最终表达盒。该载体经过用于分别插入 复合体GluB4-LLTCK(或GluB4-STE)和报告基因的两个连续的亚克隆步骤。 尤其是，在第一亚克隆中，将pUC18/GluB4ter用限制性内切酶SphI和XbaI 消化以便分别连接从载体pGEM-T/GluB4-LLTCK和pGEM-T/GluB4-STE中 提取的片段GluB4-LLTCK和GluB4-STE。在第二亚克隆中，中间载体 pUC18/GluB4-LLTCK::GluB4ter和pUC18/GluB4-STE::GLUB4ter通过用Xba I和SacI消化来打开以便插入使用相同酶从载体pMS/hGCasi中依次提取的 报告基因(hGCasi)。这样，获得两个含有表达盒全部装配的载体pUC18，即， pUC18/GluB4-LLTCK::GCasi::GluB4ter和pUC18/GluB4-STE::GCasi::GluB4 ter。

为了生产最终载体，(例如通过用EcoRI从各自的pUC18开始双消化) 来分别提取两个表达盒GluB4-LLTCK::GCasi::GluB4ter和 GluB4-STE::GCasi::GluB4ter，并在最终表达载体pCAMBIA1300/PMI中克隆， 以便构成(图4A)：

pCAMBIA1300/PMI/GluB4-LLTCK::GCasi::GluB4ter和

pCAMBIA1300/PMI/GluB4-STE::GCasi::GluB4ter。

实施例3：由根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的烟草(Nicotianatabacum)的遗传转化

对于由根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)介导的烟草(Nicotianatabacum,cv. Xanthi)的遗传转化来说，可使用Horsch等(1985)的方案。我们将简单描述整 个过程的主要步骤。

种子的消毒

为制备用于转化的烟草种子，根据以下方案首先进行消毒：

在无菌的2mL试管中放入少量种子。加入大约1mL95％的乙醇。保持 2分钟并剧烈搅动。使用吸液管移除乙醇。加入1mL2％的氯化氢。静置孵 育20分钟，搅动，移除并加入1mL无菌水；以此方式漂洗种子5次。在试 管中留下最后一次漂洗的水。使用末端在无菌情况下被移除的棒，移除一定 量的种子和水，并且将其放置在平底广口瓶或小广口瓶中的MS10培养基上。

使用弯成L形的细菌学环或巴斯德吸液管，轻柔地分散种子。

将平板放置在28℃气候室的内部的光照中直到发芽。

用根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)转化

使用根癌土壤杆菌进行烟草(N.tabacum)的叶子原料的转化在以下步 骤中完成：

·在通风橱下，用1.8mL无菌LB肉汤填充4-5个x2mL的试管。接 种根癌土壤杆菌，用无菌牙签挑取在平板上生长的小而可见量的细菌菌落， 并在试管中稀释它，剧烈搅动；

·(从大约1个月大的植物中)取烟草叶，并使用无菌打孔器，由叶片 制成直径7mm的圆片；使用镊子，在MS10培养基的平板上放置叶子圆片； 每个平板放置30个圆片。对于各细菌菌株来说获得总计至少200个圆片。准 备两个放置未被感染的圆片并将一直保持MS10培养基上的对照平板；

·使用根癌土壤杆菌感染圆片；将恰好在用细菌前接种的试管的内含物 倒在含有圆片的平板上。以旋转运动温和搅动，以便弄湿所有圆片，然后用 吸液管移除过量液体。使用镊子整齐地排列圆片；

·在生长室中在28℃的温度下在恒定光照下孵育平板一夜；

·转移叶子圆片至MS10头孢噻肟(Cefotaxime)500mg/L的培养基上；

·在24℃的温度和恒定光照下孵育平板6天；

·转化开始后8天，为选择转化的愈伤组织转移叶子圆片至MS10头孢 噻肟500mg/L-卡那霉素200mg/L的培养基上。在相同条件下孵育14天；

·切割由至少两个不嵌合并有正常外观的叶子组成的苗。转移它们至用 于生根的培养基(有头孢噻肟500mg/L-卡那霉素200mg/L-IBA2mg/L的 MS0)上；

·为了生长转移生根的植物至盆装的泥炭或无土栽培培养系统，用水柔 和地从根部清洁培养基。将植物排列在有16小时光照和8小时黑暗的光周期 的保持26-30℃的温度的气候室中。

实施例4：由根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的水稻(Oryzasativa)的遗传转化

对于水稻变种CRW3的转化，使用Hiei等(1994)的方案直到获得转化的 愈伤组织，如Hog(水稻研究组,植物科学研究院,莱顿大学)和Guiderdoni (Biotropprogram,Cirad,蒙彼利埃,法国)所改进的。为了随后的选择步骤使 用Datta和Datta(2006)的方案。我们将简单描述整个过程的主要步骤。

由水稻盾片来制备和发育胚性愈伤组织

使用源自盾片的胚性愈伤组织完成水稻的转化。

为了诱导来自盾片组织的愈伤组织的增殖，使用以下操作方案：

·剥去水稻种子的壳(颖片的移除)；

·为了移除能够干扰愈伤组织产生的潜在污染病原体和腐生物，将无颖 片的颖果消毒；

a.在第一消毒处理中，剥去壳的种子在70％的乙醇溶液中停留2分钟；

b.在乙醇处理后，将种子转移至有2滴Tween20洗涤剂的5％的氢氯化 钠(sodiumhydrochloride)溶液中，并且保持缓慢搅拌30分钟；

c.为了移除可抑制盾片中的愈伤组织的诱导的所有微量氢氯化钠，在无 菌水中进行一系列的清洗，每次持续15分钟；

·最后一次清洗后，在无菌吸水纸上干燥种子；

·将每个平板12个种子放在用来诱导愈伤组织的培养基(CIM,愈伤组 织诱导培养基)的表面上，培养基以25mL的体积分布在陪替氏培养皿( mm)内部；

·在28℃的温度下，在黑暗中孵育以此获得的平板21天；孵育1周后， 移除胚乳和支根来促进来自盾片的愈伤组织的发育(所述盾片由其部分包括 在黄色的胚乳中的致密团块来识别)；

·孵育3周后，愈伤组织转移至新鲜CIM培养基上，然后在没有使用解 剖刀的情况下，愈伤组织团块破裂，接着断裂线自然地存在于愈伤组织中；

·继续次培养又一个10天以便使胚性愈伤组织发育，并使其适合于转 化。

愈伤组织与根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)EHA105的共培养

1.为获得足够量的用于转化的根癌土壤杆菌，在LB-琼脂中，在30℃下 孵育包含上述质粒载体的菌株(实施例2)3天；

2.当土壤杆菌生长时，刮去细菌细胞层并悬浮在共培养培养液(CCML) 中，直到获得大约1.0的O.D.₆₀₀，相当于3-5·10⁹个细胞/mL；

3.最佳愈伤组织，即，直径大约2mm、致密并且颜色发白的那些，被转 移至含有35mL细菌悬浮液的培养皿中，并且保持浸入15分钟，搅拌；

4.然后使用无菌吸水纸干燥愈伤组织；

5.每个含有用于共培养的半固体培养基(CCMS,固体化的共培养培养基) 的高边培养皿转移20个愈伤组织的最大数量；

6.然后在25℃的温度下，在黑暗环境中孵育愈伤组织3天。

基于PMI标记系统选择愈伤组织

在胚性水稻愈伤组织和根癌土壤杆菌的共培养后，使用基于PMI(磷酸 甘露糖异构酶)作为可选标记且甘露糖作为选择试剂的选择系统选择转化的 组织。该方法提供使用含有增加甘露糖浓度和降低蔗糖浓度的培养基。

使用的程序如下：

·将愈伤组织从与根癌土壤杆菌的共培养中转移至没有甘露糖并含有 3％蔗糖的PSM(预选培养基)培养基上；在28℃的温度下，在黑暗中孵育1 周；

·将愈伤组织转移至含有2％蔗糖和1.5％甘露糖的SMI(选择培养基I) 培养基上，并且在28℃的温度下，在黑暗中孵育2周；

·将愈伤组织转移至含有1％蔗糖和2％甘露糖的SMII(选择培养基II) 培养基上，并且在28℃的温度下，在黑暗中孵育2周；

·接着再生。

由转化的愈伤组织再生水稻植株

推定转化发生的植物的再生归功于转化的愈伤组织的适当的激素刺激， 跟随这里报告的步骤：

1.将选择的胚性水稻愈伤组织转移至包含含有0.5％蔗糖和2.5％甘露糖 的PRM培养基(预再生培养基)的高边培养皿上，并且在28℃的温度下在 黑暗中孵育2周；

2.在PRM培养基上传代后，将愈伤组织转移至无甘露糖的RM培养基上 (再生培养基)，直到每高边培养皿最大数量8-10个单位。所述植物在28℃ 下在光照下生长3-4周。

3.当所述植物充分生长至从愈伤组织分离出来时(≥3cm高)，将他们转 移至含有25mL的生根培养基(rm)的培养试管中；

4.连续大约3周的试管内部的次培养通常在大约28℃在光照下；

5.在再生过程的最后，将所述植物转移至泥炭，并且在温室条件下生长。

实施例5：从经4-MUG测定转化的烟草的叶组织中提取总蛋白

现在描述的步骤允许产生并保存烟草的叶子提取物，长时间保持GUS 蛋白的酶活性。

·在1.5mL试管中，称重15mgPVP(聚乙烯吡咯烷酮，MW>40000 g/mol)并加入200μL的提取缓冲液(见表3)，涡旋搅拌并在4℃下孵育至 少30分钟；

·使用Meku压榨机提取叶子汁液；

·移出100μL的汁液并且将其加入至缓冲液-PVP混合物中，保持其全 部在冰中；

·在4℃下以11500xg离心分离15分钟；

·移出上清液(～200μL)并且将其非常快速地转移至新试管中；

·使用液氮立即冷冻并保存在-80℃下。

表3：提取缓冲液的成分

在对经过荧光分析的所有样本没有区别的情况下应用步骤。使用自存在 于植物的顶部的3片叶子中取得的提取物(高级扩增阶段)将各个转化的植 物进行三重分析。

实施例6：使用荧光计的4-MUG测定

为了评估从转化的植物中获得的蛋白叶子提取物中的GUS酶的含量，进 行特异性使用荧光计的测定。使用的底物是4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸 (MUG)，其在GUS酶存在的情况下产生荧光化合物4-甲基伞形酮(4-MU)。 以下方案源于由Jefferson(1987)指出的标准程序，并且适合于在平板中进行 测定。

·在96孔平板中(低结合,Sarstedt)加入10μL的叶子提取物至130μL 的MUG溶液中(表4)；

·在37℃下孵育1小时；

·移出20μL的反应溶液，并且将其快速加入至在具有96孔的不透光的 平板中的230μL的Na₂CO₃0.2M(终止溶液)(每个样本重复至少两次)；

·在不透光的平板中用4-MU完成校准曲线(1mM并且对于总的4-5点 以1:2连续稀释)；

·使用平板荧光计读取值；

·使用曲线拟合数据分析(Promega)软件处理结果。

表4：4-MUG溶液的成分

成分 每100mL的量 MUG(MW 352.3)1.2mM 0.042g 提取缓冲液GUS(表3) 100mL

实施例7：从转化的水稻种子中提取总蛋白

为获得使用DAS-ELISA测定的总蛋白提取物，开发包括以下步骤的提 取方案。

·从各个体中取得成熟的穗；

·将所述穗在干燥通风的地方干燥大约3天直到获得14％的种子的相对 湿度；

·为每排随即抽样40个种子；

·用人工水道脱壳机使种子脱壳；

·用MM2(Retsch)振动式微磨机以20Hz的速度研磨样本2分钟，并且 取出所获得的70mg的面粉；

·面粉均匀分布在具有1mL的提取缓冲液(Tris-HCl50mM,NaCl0.5M, pH＝7.0)的研钵中；

·随后用另外7mL的相同缓冲液稀释；

·孵育同时在4℃下连续搅拌1小时；

·移出1mL并且在4℃下以20000xg离心分离40分钟；

·回收含有蛋白质的液相，并且保存在20℃下。

实施例8：DAS-ELISA测定

使用基于双重免疫识别的DAS-ELISA测定来评估单个蛋白质提取物的 GCasi含量。为了分析，1:30稀释的样本。现在我们将报告测定的主要步骤：

·在各个孔中分配在涂布溶液(1:5稀释的PBS，叠氮化钠(0.01％))中以 2ng/μL稀释的100μL的非共轭的多克隆抗体抗GCasi；

·在4℃下孵育平板过夜；

·移除抗体；

·在各孔中分配250-300μL的封闭液(PBS+BSA2.5％+叠氮化钠 0.01％)；

·在25℃下孵育平板20分钟；

·移除封闭液；

·分配50μL/孔的被分析的各个样本的各标准稀释液和由稀释液组成的 (PBS+Tween200.1％+BSA1％)对照样本的各标准稀释液(200,100,50和25 pg/μL商用伊米苷酶；Sanofi-Genzyme)；

·在37℃孵育平板30分钟同时搅拌；

·用300μL/孔的洗涤液(PBS+Tween200.1％)清洗孔3次；

·分配50μL/孔的与辣根过氧化物酶结合的多克隆抗体抗-GCasi，以0.4 ng/μL稀释液稀释；

·在37℃孵育平板30分钟同时搅拌；

·用300μL/孔的洗涤液(PBS+Tween200.1％)清洗孔3次；

·分配100μL/孔的TMB溶液；

·在25℃下孵育平板大约10分钟；

·用100μL/孔的终止溶液(盐酸1M)终止反应；

·在450nm下用酶标仪(platereader)ModulusII(Promega)读取平板；

·使用曲线拟合数据分析软件(Promega)处理数据，确定已知的标准浓度 值。样本的浓度值使用具有四个参数的线性曲线获得，考虑采用的稀释因数 以便获得真实的提取物浓度。

参考文献

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