一种调控猪AEBP1的启动子及构建方法、转染载体及构建方法、应用

摘要

本发明公开了一种调控猪AEBP1的启动子及构建方法、转染载体及构建方法、应用，该启动子为猪AEBP1基因启动子的缺失片段。本发明首次对猪AEBP1的启动子进行研究，通过缺失该基因启动子的不同片段，得到3种具有较强活性的新的启动子。本发明的新的启动子能够调控猪AEBP1基因的表达，为猪遗传改良提供了新的工具和选择。生物学实验表明，本发明构建的3个缺失载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3在猪肾脏细胞PK-15中均有较强活性，其中pGL3-basic-Q1的活性最高。本发明的结果最终获得1483bp的启动子片段(-337bp到-1819bp)，即本发明构建的缺失载体pGL3-basic-Q1中包含的启动子片段，具备独立的启动功能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种调控猪AEBP1的启动子及启动子的构建方法，含有启动子的转染载体及转染载体的构建方法和应用，属于动物基因工程技术领域。

背景技术

高等生物基因的表达受到细胞内外环境的精细调控，因而具有严格的时间及空间有序性。基因的表达调控由多阶段调控水平共同完成，它是一个复杂且有序的过程，主要包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平，其中转录水平调控最为关键。启动子是转录水平上的重要调控元件，它位于DNA结构基因5′端上游区，通过与转录因子互作来调控基因的表达(武力，1999)。因此，通过对启动子的结构、功能、作用模式等方面的研究，有助于更好地了解基因如何发挥其功能。

aP2是脂肪细胞分化的标志基因，它的启动子区域存在脂肪细胞分化过程中已知的两个重要因子C/EBPa和PPARγ的结合位点，为上调表达。近年来，在aP2基因启动子邻近增强子区域AE-1发现了另外一个重要的转录因子-脂肪细胞增强子结合蛋白(AEBP1)。

AEBP1是一种转录抑制物，兼具蛋白酶和DNA结合活性(Heetal.,1995)，是调节性B样(regulatoryB-like)羧肽酶家族的一员(MuiseandRo,1999)，因此，AEBP1具有羧肽酶(carboxypeptidase，CP)活性，在脂肪生成中表达下调。AEBP1中CP区突变后造成CP活性缺失，使得AEBP1失去抑制转录活性，反之若AEBP1具有CP活性就能够抑制转录，因此AEBP1的CP活性对于其行使转录调控功能极其重要(Heetal.,1995)。关于AEBP1调节转录抑制功能的具体机制尚不清楚，可能是通过剪切一般性转录因子而实现。研究发现，利用酵母双杂交系统，显示AEBP1与G蛋白异源三聚体γ5亚基有蛋白互作。AEBP1的转录抑制功能由Gγ5调节，而Gγ5的抑制活性由脂肪生成刺激调节，因此，AEBP1在脂肪生成过程中可以作为信号因子Gγ5的效应器(Parketal.,1999)。此外，研究还表明AEBP1能调节丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)的活性。

AEBP1在脂肪细胞分化过程中具有非常重要的生物学作用。在小鼠3T3-L1细胞系中，AEBP1的表达量在细胞分化初期最高，随着分化时期的增加逐渐降低，在分化末期未见表达(Heetal.,1995)。AEBP1在人体的表达与之相似，研究显示，在人的初代培养造骨细胞中能分离到AEBP1基因cDNA，但最后的硬化期则关闭表达(Ohnoetal.,1996)。

AEBP1有两种不同的转录本，分别编码2种不同的蛋白质，即AEBP1和主动脉羧肽酶类样蛋白(Aorticcarboxypeptidase-likeprotein,ACLP)，而ACLP是AEBP1的非核内同形异构体，该蛋白的N端与AEBP1相比多了380个氨基酸。两种同形异构体分别由AEBP1基因通过选择性剪切机制产生的两种mRNA所编码，其功能也完全不同(Roetal.,2001)。原位杂交显示ACLP在主动脉平滑肌细胞内表达，而骨骼肌细胞内不表达，在血管平滑肌细胞分化中表达上调(Layneetal.,1998)，而AEBP1在脂肪细胞分化中则表达下调(Heetal.,1995；Kimetal.,2001)。AEBP1在脑中表达最高，次之的是白色脂肪组织，肾和心脏，在棕色脂肪组织、骨骼肌、小肠、肺、脾及睾丸均有表达(Roetal.,2001)。Western杂交显示ACLP主要分布于成年鼠主动脉平滑肌细胞内，而动脉外膜、心、肝、骨骼肌或肾中则不表达(Layneetal.,1998)。因此，对AEBP1基因，尤其是对AEBP1启动子的研究具有重要意义。截止目前，尚见到研究猪AEBP1基因启动子功能的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种调控猪AEBP1的启动子及启动子的构建方法，含有启动子的转染载体及转染载体的构建方法和应用，该启动子活性较强，具备独立的启动功能。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种调控猪AEBP1的启动子，所述启动子为SEQIDNO.10、SEQIDNO.11或SEQIDNO.12所示的核苷酸序列。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种调控猪AEBP1的启动子的构建方法，包括以下步骤：

(1)以GenBank登录号：CU928907的核苷酸序列为模板，设计正反向引物F/R，PCR扩增，选择扩增片段第一外显子ATG上游2000bp序列作为启动子候选片段；

(2)以启动子候选片段为模板，设计3个缺失片段P1、P2、P3的正反向引物P1F/R、P2F/R、P3F/R，分别进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为调控猪AEBP1的启动子。

所述正反向引物F/R为：

正向引物F：5’-GTGGCTGCCTGTTCATCATCG-3’

反向引物R：5’-CTTTGCGGACTGGAAGTGTG-3’。

所述正反向引物P1F/R为：

正向引物P1F：5’-CTAGCTAGCCGAGAAGCCTTATGGAAACA-3’

反向引物P1R：5’-CCCAAGCTTCGAACCGCCTTCTCCAAA-3’。

所述正反向引物P2F/R为：

正向引物P2F：5’-CTAGCTAGCTGGCTTCGTCTGAGGCTAT-3’

反向引物P2R：5’-CCCAAGCTTCGAACCGCCTTCTCCAAA-3’。

所述正反向引物P3F/R为：

正向引物P3F：5’-CTAGCTAGCTCCACGCCCGGCTCCTCCTC-3’

反向引物P3R：5’-CCCAAGCTTCGAACCGCCTTCTCCAAA-3’。

步骤(1)中PCR反应体系为：模板DNA50ng、10×Buffer2.5μL、dNTPs浓度为200μmo1/L、每条引物浓度为0.4μmol/L、1UTaqDNA聚合酶，加去离子水至总体积25μl；

PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性50s，60℃退火50s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min；

步骤(2)中PCR反应体系为：模板DNA50ng、10×Buffer2.5μL、dNTPs浓度为200μmo1/L、每条引物浓度为0.4μmol/L、1UTaqDNA聚合酶，加去离子水至总体积25μl；

PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性50s，58或60℃退火50s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种含调控猪AEBP1的启动子的转染载体，所述转染的载体为pGL3-basic。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种含调控猪AEBP1的启动子的转染载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)将猪AEBP1启动子的缺失片段与pMD-18T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在LB平板上培养，挑选阳性单克隆进行测序鉴定，测序结果正确的阳性克隆进行质粒抽提，命名为重组质粒TA-Q，进行NheⅠ和HindⅢ双酶切；

(2)对载体pGL3-basic进行NheⅠ和HindⅢ双酶切；

(3)将步骤(1)和步骤(2)的酶切产物连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在Amp⁺/LB平板上培养，挑选阳性单克隆进行测序鉴定，测序结果正确的阳性克隆扩大培养，并进行质粒抽提，命名为缺失载体pGL3-basic-Q。

步骤(1)和(2)中双酶切的反应体系为：10×Buffer2.5-5μL、NheI0.5-1μL、HindⅢ0.5-1μL、质粒载体5μL，加ddH₂O至25μL；反应条件为：37℃反应2h。

步骤(3)中连接的反应体系为：10×T₄DNALigaseBuffer1μL、T₄DNALigase1μL、pGL3-basic酶切产物0.5μL、猪AEBP1基因启动子缺失片段7.5μL，总体积10μL；反应条件为：16℃连接12h。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种调控猪AEBP1的启动子在调控猪AEBP1表达中的应用。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种调控猪AEBP1的启动子在猪遗传改良中的应用。

本发明有益效果

(1)本发明首次对猪AEBP1的启动子进行研究，通过缺失该基因启动子的不同片段，得到3种具有较强活性的新的启动子。本发明的新的启动子能够调控猪AEBP1基因的表达，为猪遗传改良提供了新的工具和选择。

(2)生物学实验表明，本发明构建的3个缺失载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3在猪肾脏细胞PK-15中均有较强活性，其中pGL3-basic-Q1的活性最高。本发明的结果最终获得1483bp的启动子片段(-337bp到-1819bp)，即本发明构建的重组表达载体pGL3-basic-Q1中包含的启动子片段，具备独立的启动功能。

附图说明

以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为大白猪DNA电泳检测结果，图中，

1泳道为大白猪DNA，2泳道为DL2000标准分子量。

图2为载体pGL3-basic的结构示意图。

图3为载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3双酶切鉴定结果，图中，

a、b、c分别为载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3双酶切鉴定结果，1泳道为对应载体的双酶切产物，2泳道为DL2000标准分子量。

图4为双荧光素酶活性检测结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1猪AEBP1基因启动子相应缺失片段的获得

1、大白猪DNA的提取

1.1、DNA提取

采集大白猪(常规报道的品种)新鲜血液，加入0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂(血液量：EDTA体积比为5：1)，摇匀。

白细胞分离：

(1)于4℃6000rpm离心10min，弃上层血清。

(2)加入1.5倍体积双蒸水，轻轻摇匀10min。

(3)4℃5000rpm离心10min，去上层。

(4)加入质量分数0.9％NaCl溶液洗涤沉淀，轻轻摇匀10min。

(5)4℃5000rpm离心10min，去上清，获得沉淀即为白细胞。

1.2、总DNA提取：

(1)在白细胞沉淀中，加入等体积1×SET缓冲液，蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度100μg/mL，质量浓度10％十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度0.5％，摇匀，55℃水浴摇床中温育过夜消化。

(2)加入等体积Tris饱和酚，轻轻摇匀15min，于4℃11000rpm离心10min，吸取上清液转移至新离心管。

(3)加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇混合液(体积比25：24：1)，轻轻摇晃离心管10min，4℃11000rpm离心10min，将上清吸取至新离心管。

(4)加入等体积氯仿/异戊醇(体积比24：1)，轻轻摇晃离心管10min，4℃11000rpm离心10min，吸取上清液至新离心管。

(5)加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，轻轻摇动离心管，小心混匀后可见白色絮状DNA沉淀。

(6)用吸头吸出絮状DNA于一1.5ml的离心管中，用70％乙醇洗涤一次，3000rpm离心5min，弃上层乙醇，干燥DNA。

(7)测定DNA浓度与纯度，并通过浓度1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下检测DNA条带大小(见图1)。

2、猪AEBP1基因启动子的获得

2.1、设计引物

利用NCBI上的猪AEBP1基因的DNA序列(GenBank登录号：DQ464432)为探针序列，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，获得目的片段(GenBank登录号：CU928907)，根据目的片段设计PCR引物，进行PCR扩增该段序列，所述引物如下：

正向引物F：5’-GTGGCTGCCTGTTCATCATCG-3’(SEQIDNO.1)

反向引物R：5’-CTTTGCGGACTGGAAGTGTG-3’(SEQIDNO.2)

2.2、PCR扩增

PCR反应体系为：模板DNA50ng、10×Buffer2.5μL、dNTPs浓度为200μmo1/L、每条引物浓度0.4μmol/L，1UTaqDNA聚合酶，加去离子水至总体积25μl。

PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性50s，60℃退火50s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

3、猪AEBP1基因启动子缺失片段的获得

3.1、设计引物

将PCR产物进行测序，选择第一外显子ATG上游2000bp序列作为启动子候选片段，如下：

GATTTTCCCACCTGGGCCCAACCCTCACAGACCACGTTGGCTCAGGACTGACCGCTGCCAGACTTGGCCCGTGGACTCCAGATGTGCTTTTTCTTGCTTCCTCATTCCTTCAAGGAGGAATGTTCTGGGAACTCTGGCCTTAGGTGTCATGCCTATTTGGAACCAGCCAGCATTTGCCCTTCGAGAAGCCTTATGGAAACACCAGGCACACGTGGCATAGCTCCCTATGCCAGCACCCATGGCAGACATCACTAATCGATCCTGGGATTCTCTGACTACCCACTCTCCCTGTGCCCAGGGCCCATGTGGTAGCTGGAGTTATTGTAAAGACAATTTTTAAAAACTGGGTTCTGGTCAGAGGAAGGAGAGGAATGGCTCTTTGCCCTTGTTGGGGTCTCAGCTGGTGGGAAAGCAGTAGCCTTAGAGGTGAAGCCATGTTCATCACGGGAAATAGTAAAGGAAACTCTAGGGGAGGGGACCTGACCCCCCCACATCTGTGGCTCCTGTTTGGGTGGGGAGTAAACCGTTCCCAGAGCAGATCCCGGCACACAGCTTCCTTGGGTTGAAGGCACCCATCCTCTCTCCCCAGCCGATCCATGTCCTCAGGGGTGCTGTGTGACCCCCTATGCCTTTGTGGCCCCTCCATCTTCCACACAGAGCTGGGCACACACACACTGCCCCTAAGATATTCCCATGACTTGACCTGGCTTCGTCTGAGGCTATGTCACCAGCTAGAGACAGGCCAGGTAAGTGGGCTGCTGCCCACCATCTCCTTGCTGGGGATCTTACCTGGGATCCCCTCTCCTGCTGCTGGGAGCACAGGGGTGGGCCAGAAGCCCCCGAACTTGTACGGAAATCGCTGCGTGAATGCCGAGTCCCTCCCCACTTGTGACAGTCCATTCCTATGAATGACACATACCAGTTGATAAAACATGAAATCCCCTCCCTCCCTGCTCCAACGCTGACCCCGCTCCAAACCTGGCCTTGTGCATCAGGACCTTGCGGGTGTGGGGGTCTCCTGCCCTGAGTGAGACCAGCTGTGCACCTGCCCCTTACTAGACAGTGAATTCCCAAAATGTGGTCCCTCCCTGGGGCCAACACAGGGCCCCGGGCTCTTCATGGACCTCAGAGGTTAGCTGGTTGCCTGAAGGATGGCTGGTGACTGCCGAGCTGCCAGGGCAAGGCTCCAGAGAGAGGAAAGCATGGGTTGGCCCTCAAGGTCCTTCTGAGATGGGGATGGTCCCCAAGGCCACCGTCCCTGGCTTGGCTCTGCTCTCAGGGTTCCCTGGTCGCCTCCAGGTTGCCGTCGGGCTTGGGAGCGTGCCACAGAGTGAGTGAGACAGGGGCGTGGGGGCGCTGAGACCCACGCTTTGGGGTCCCCCTGCATCCTCTCCCACCCTCCCTCCTACAGGCCTTCCTTCCCAGGCGACCACCCCCCCGCCCCCGCCCCCGCCAGCCCGGGGACACCGCCCGCAGTTCCCACTTCGGGAAATGCCAAGCGCGCGGCGCCGCCGGGACAGCTCAGCAGCCCCGCAGCCCCTCCGTCCACGCCCGGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTTCCCCGGGGGTGGGGGGAGCCGGCTCCGGAAGCCCCGGCGCCCCCGCCCGGGCCGCCACTGGCGCTTTGGAGAAGGCGGTTCGCGTGCCACGCGGGACCTGAGCTCCCAGCCGCCGCCAGCTCCTTAGGAACCCCCTGACCCCTTCGGAACCCCCACCGACTCCCGAGCCACTGCCCGGCCCGGAGCTAGCTCCCCGCGCCCCACCCCGGAGTCCCCTGCTACCCCAGATCTCCCCCTCCGCCCCCACCCCTCCCAAGAGCCCACCCCGATCCCCTCCGCCCGCCCCTCCCCGGACCTCCCCACCCACCCCCGATCCTCCCACCCACCCCTCCCAGGAACCCCTACCCCCGCTCCCAGGACCCCGCGGCACCCCTTCCCCGGAGCCCCCCGCGCTCCTGGCCCGGTGCGCGCCGCGGCC(SEQIDNO.3)

设计3个缺失片段(P1、P2、P3)扩增引物P1F/R、P2F/R、P3F/R(SEQIDNO.4-SEQIDNO.9)，依次代表构建的3个5^’端缺失载体的正向引物和反向引物，其中，在正向引物前添加NheⅠ酶切位点(GCTAGC，以下划线表示)，同时加上保护性碱基CTA(阴影表示)；反向引物添加HindⅢ酶切位点(AAGCTT，以下划线表示)，同时加上保护性碱基CCC(阴影表示)，引物序列见表1。

表1启动子缺失载体引物的设计

3.2、PCR扩增

对启动子候选片段进行PCR扩增。

PCR反应体系为：模板DNA50ng、10×Buffer2.5μL、dNTPs浓度为200μmo1/L、每条引物浓度0.4μmol/L，1UTaqDNA聚合酶，加去离子水至总体积25μl。

PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性50s，58或60℃(如表1所示)退火50s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增引物P1F/R、P2F/R、P3F/R对应的PCR扩增片段如下。

P1F/R：

CGAGAAGCCTTATGGAAACACCAGGCACACGTGGCATAGCTCCCTATGCCAGCACCCATGGCAGACATCACTAATCGATCCTGGGATTCTCTGACTACCCACTCTCCCTGTGCCCAGGGCCCATGTGGTAGCTGGAGTTATTGTAAAGACAATTTTTAAAAACTGGGTTCTGGTCAGAGGAAGGAGAGGAATGGCTCTTTGCCCTTGTTGGGGTCTCAGCTGGTGGGAAAGCAGTAGCCTTAGAGGTGAAGCCATGTTCATCACGGGAAATAGTAAAGGAAACTCTAGGGGAGGGGACCTGACCCCCCCACATCTGTGGCTCCTGTTTGGGTGGGGAGTAAACCGTTCCCAGAGCAGATCCCGGCACACAGCTTCCTTGGGTTGAAGGCACCCATCCTCTCTCCCCAGCCGATCCATGTCCTCAGGGGTGCTGTGTGACCCCCTATGCCTTTGTGGCCCCTCCATCTTCCACACAGAGCTGGGCACACACACACTGCCCCTAAGATATTCCCATGACTTGACCTGGCTTCGTCTGAGGCTATGTCACCAGCTAGAGACAGGCCAGGTAAGTGGGCTGCTGCCCACCATCTCCTTGCTGGGGATCTTACCTGGGATCCCCTCTCCTGCTGCTGGGAGCACAGGGGTGGGCCAGAAGCCCCCGAACTTGTACGGAAATCGCTGCGTGAATGCCGAGTCCCTCCCCACTTGTGACAGTCCATTCCTATGAATGACACATACCAGTTGATAAAACATGAAATCCCCTCCCTCCCTGCTCCAACGCTGACCCCGCTCCAAACCTGGCCTTGTGCATCAGGACCTTGCGGGTGTGGGGGTCTCCTGCCCTGAGTGAGACCAGCTGTGCACCTGCCCCTTACTAGACAGTGAATTCCCAAAATGTGGTCCCTCCCTGGGGCCAACACAGGGCCCCGGGCTCTTCATGGACCTCAGAGGTTAGCTGGTTGCCTGAAGGATGGCTGGTGACTGCCGAGCTGCCAGGGCAAGGCTCCAGAGAGAGGAAAGCATGGGTTGGCCCTCAAGGTCCTTCTGAGATGGGGATGGTCCCCAAGGCCACCGTCCCTGGCTTGGCTCTGCTCTCAGGGTTCCCTGGTCGCCTCCAGGTTGCCGTCGGGCTTGGGAGCGTGCCACAGAGTGAGTGAGACAGGGGCGTGGGGGCGCTGAGACCCACGCTTTGGGGTCCCCCTGCATCCTCTCCCACCCTCCCTCCTACAGGCCTTCCTTCCCAGGCGACCACCCCCCCGCCCCCGCCCCCGCCAGCCCGGGGACACCGCCCGCAGTTCCCACTTCGGGAAATGCCAAGCGCGCGGCGCCGCCGGGACAGCTCAGCAGCCCCGCAGCCCCTCCGTCCACGCCCGGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTTCCCCGGGGGTGGGGGGAGCCGGCTCCGGAAGCCCCGGCGCCCCCGCCCGGGCCGCCACTGGCGCTTTGGAGAAGGCGGTTCG(SEQIDNO.10)

P2F/R：

TGGCTTCGTCTGAGGCTATGTCACCAGCTAGAGACAGGCCAGGTAAGTGGGCTGCTGCCCACCATCTCCTTGCTGGGGATCTTACCTGGGATCCCCTCTCCTGCTGCTGGGAGCACAGGGGTGGGCCAGAAGCCCCCGAACTTGTACGGAAATCGCTGCGTGAATGCCGAGTCCCTCCCCACTTGTGACAGTCCATTCCTATGAATGACACATACCAGTTGATAAAACATGAAATCCCCTCCCTCCCTGCTCCAACGCTGACCCCGCTCCAAACCTGGCCTTGTGCATCAGGACCTTGCGGGTGTGGGGGTCTCCTGCCCTGAGTGAGACCAGCTGTGCACCTGCCCCTTACTAGACAGTGAATTCCCAAAATGTGGTCCCTCCCTGGGGCCAACACAGGGCCCCGGGCTCTTCATGGACCTCAGAGGTTAGCTGGTTGCCTGAAGGATGGCTGGTGACTGCCGAGCTGCCAGGGCAAGGCTCCAGAGAGAGGAAAGCATGGGTTGGCCCTCAAGGTCCTTCTGAGATGGGGATGGTCCCCAAGGCCACCGTCCCTGGCTTGGCTCTGCTCTCAGGGTTCCCTGGTCGCCTCCAGGTTGCCGTCGGGCTTGGGAGCGTGCCACAGAGTGAGTGAGACAGGGGCGTGGGGGCGCTGAGACCCACGCTTTGGGGTCCCCCTGCATCCTCTCCCACCCTCCCTCCTACAGGCCTTCCTTCCCAGGCGACCACCCCCCCGCCCCCGCCCCCGCCAGCCCGGGGACACCGCCCGCAGTTCCCACTTCGGGAAATGCCAAGCGCGCGGCGCCGCCGGGACAGCTCAGCAGCCCCGCAGCCCCTCCGTCCACGCCCGGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTTCCCCGGGGGTGGGGGGAGCCGGCTCCGGAAGCCCCGGCGCCCCCGCCCGGGCCGCCACTGGCGCTTTGGAGAAGGCGGTTCG(SEQIDNO.11)

P3F/R：

TCCACGCCCGGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTTCCCCGGGGGTGGGGGGAGCCGGCTCCGGAAGCCCCGGCGCCCCCGCCCGGGCCGCCACTGGCGCTTTGGAGAAGGCGGTTCG(SEQIDNO.12)

实施例2猪AEBP1基因的启动子相应缺失片段的转染载体构建

1、重组质粒TA-Q的构建

将实施例1获得的3个猪AEBP1基因缺失片段PCR产物回收(参照上海莱枫公司回收试剂盒说明书)，分别连接至pMD-18T载体(参照TAKARA公司pMD-18T载体使用说明书)，连接产物转化大肠杆菌DH5α，步骤如下：

(1)吸取5μL的连接产物于100μL感受态细胞，混匀，冰上放置30min。

(2)置入42℃水浴锅，热击90s。

(3)迅速将管取出置于冰块上，冷却3-4min。

(4)将400μL无氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基加入管里，37℃复苏1h。

(5)于4500rpm离心5min，将部分上清液吸出，余下部分混匀，转移到LB培养基平板上(含IPTG和X-gal)，铺平，待液体被吸收后，37℃倒置培养12-16h。

挑选阳性单克隆进行测序鉴定。测序结果正确的阳性克隆，进行质粒抽提，命名为重组质粒TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3。

2、缺失载体pGL3-basic-Q的构建

将重组质粒TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3分别用相应的限制性内切酶NheⅠ和HindⅢ双酶切。载体pGL3-basic(购自普洛麦格北京生物技术有限公司)也进行限制性内切酶NheⅠ和HindⅢ双酶切，载体pGL3-basic的结构见图2。酶切体系如表2所示：

表2酶切反应体系

10×Buffer2.5-5μL

NheI0.5-1μLHindⅢ0.5-1μL质粒载体5μL加ddH₂O至25μL

37℃酶切2h后，回收目的片段(参照上海莱枫生物基因技术有限责任公司的胶回收试剂盒说明书操作)，置于-20℃冰箱保存。

将酶切回收的猪AEBP1基因启动子缺失片段连接到pGL3-basic载体酶切产物上。

连接体系如表3所示：

表3连接反应体系

10×T₄>1μLT₄>1μLpGL3-basic酶切产物0.5μL猪AEBP1基因启动子缺失片段7.5μL总体积10μL

连接反应条件为16℃水浴12h。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在Amp⁺/LB平板上(即含Amp的LB平板)培养，挑选阳性单克隆进行测序鉴定。将测序正确的阳性克隆扩大培养，进行质粒抽提(按OMEGA公司质粒小量抽提试剂盒D6950-01说明书操作)，分别命名为缺失载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3。用NheⅠ和HindⅢ双酶切鉴定质粒(结果见图3)，酶切体系同表2。测定质粒的浓度(美国Beckman公司核酸-蛋白质浓度测定仪)，置于-20℃冰箱备用。

实施例3脂质体介导的细胞转染

脂质体介导的细胞转染具体步骤参照Lipofectamine^TM2000(invitrogen公司)说明书，转染用24孔细胞培养皿进行，使用的细胞为猪肾细胞PK-15。为消除实验误差，每个缺失载体(pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3)进行三轮独立试验，每次试验三个复孔。每孔使用1μg缺失载体，3μL脂质体。转染细胞48h后收集细胞裂解液后，通过双荧光素酶检测系统进行缺失启动子的活性分析。

本发明中涉及猪肾细胞PK-15的培养、转染的步骤及相关试剂的配制如下所述：

(1)相关试剂的配制

a)细胞培养液(胎牛血清浓度为10％的培养基，以20mL体积为例)：胎牛血清FBS(购自GIBCO公司)于4℃冰箱融化，胎牛血清2mL，青霉素浓度为100U/mL、链霉素浓度为100μg/mL，DMEM/F12培养基(购自invitrogen公司)定容至20mL，于4℃备用。

b)细胞消化液：购于GIBCO公司，消毒后置于4℃备用。

c)平衡盐溶液PBS：购于GIBCO公司，消毒后置于4℃备用。

(2)细胞培养(猪肾细胞PK-15)

a)每两天更换细胞培养液，如细胞培养液变黄时应及时更换。

b)当细胞汇合度达80％后传代，弃去旧培养基，用1×PBS(购自invitrogen公司)洗两次。

c)将预热37℃的0.25％胰蛋白酶溶液1mL加入50cm²细胞培养瓶(购于invitrogen公司)，保证胰蛋白酶覆盖所有细胞，置于37℃培养箱中约1-2min，及时观察细胞状态。

d)细胞松动并从培养皿表明脱落时，加入10％FBS的细胞生长液(购自GIBCO公司)终止胰蛋白酶的作用。

e)反复吹打让细胞充分脱落并形成均匀的细胞悬液。

f)按照1:3进行传代，并加入细胞生长液至终体积为4mL。

(3)细胞转染

a)传代：在转染前一天，取一瓶生长状况良好的细胞，胰蛋白酶消化后加入2mL无抗生素细胞培养液(10％的FBS)，吹散为均匀的细胞悬液，取10μL通过细胞计数板进行计数。取适量细胞，补充不含抗生素细胞生长培养液(10％的FBS)至12mL，混匀后每孔分装500μL，24孔细胞培养板每孔细胞数目约为0.5-2×10⁵，摇匀置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h。

b)转染：取1μg缺失载体与50μLOPTI-MEM培养液(购自invitrogen公司，按该试剂的说明书操作)混匀后静置5min；3μL的Lipofectamine^TM2000与50μLOPTI-MEM培养液(载体质量：Lipofectamine^TM2000体积量为1μg:3μL)，混合均匀后室温静置5min。

c)在30min内，将步骤b)中的两混合液混合均匀，室温静置20min。

d)弃步骤a)中细胞原培养液，用1×PBS清洗细胞两次后弃掉。

e)向每孔细胞中加入步骤c)的混合液100μL，再使用OPTI-MEM培养液补至总体积为500μL，摇匀。

f)细胞培养箱培养(37℃，5％CO₂)6h，更换成不含抗生素的细胞生长培养液(10％FBS)。

实施例4猪AEBP1基因启动子3个缺失片段双荧光素酶活性检测

对猪AEBP1基因启动子3个缺失片段双荧光素酶活性进行检测，设置阴性对照载体pGL3-basic，阳性对照质粒pGL3-control，内参质粒(用以校正转染效率)使用海肾荧光素酶报告基因PRL-TK[普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司]，转染试剂使用Lipofectamine^TM2000。24孔细胞培养皿按每孔载体质量：脂质体体积比1μg：3μL，以空转染(载体pGL3-basic)做对照，将构建的3个缺失载体分别瞬时转染猪肾细胞PK-15，待48h后收集细胞裂解液，通过双荧光素酶报告基因检测系统对猪AEBP1基因启动子3个缺失片段进行活性分析，以确定高活性区段(结果见图4)。结果表明：与阴性对照pGL3-basic相比，构建的3个缺失载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3在PK-15细胞中均有较强活性，其中pGL3-basic-Q1的活性最高。本发明的结果最终获得1483bp的启动子片段(即本发明构建的缺失载体pGL3-basic-Q1，SEQIDNO.10)具备独立的启动功能。