一种防治作物黄萎病的解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂

摘要

本发明属于农业生物防治领域，具体公开了一种防治作物黄萎病的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)菌株HMB27684，其保藏编号为CGMCC？No.11456。本发明还公开了利用该菌制备的微生物菌剂，以及它们在防治作物黄萎病上的应用。本发明为防治棉花、茄子等作物黄萎病提供了一个高效的微生物，其对棉花、茄子黄萎病平均防效在70.0％以上，且针对性强；其次，本发明微生物菌剂对人、畜安全，环境污染小；此外，利用本发明防治棉花、茄子黄萎病持效期长，不易产生抗药性；本发明制备方法简单、成本低、使用简单。

说明书

技术领域

本发明属于农业生物防治领域，具体涉及一种防治作物黄萎病的解淀粉芽孢杆菌，以及含有该解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂，还涉及它们在防治作物黄萎病上的应用。

背景技术

由大丽花轮枝菌(Verticilliumdahaliae)引起的棉花、茄子等作物黄萎病是一种危害严重而且难以防治的土传病害。目前该病在我国棉花、茄子主产区危害日趋严重。棉花黄萎病在我国经常性地暴发成灾，每年受其影响的棉花种植面积在4000万亩以上，常年造成棉花减产10％～20％左右，病害发生严重地块造成减产高达60％～70％。黄萎病常引起茄子整株枯萎死亡，几近绝产绝收。

有关棉花、茄子等作物黄萎病的防治方法，由于缺乏稳定有效的抗黄萎病基因，抗病育种的效果不佳；化学防治则存在防效欠佳、污染环境、破坏农田生态平衡等缺点；农业防治措施中较为有效的是多年轮作，但在以往特定的农业环境条件下，人多地少且替代棉花、茄子的高价作物种类匮乏，难以推广应用。生物防治由于具有环境污染小、对人畜安全、专化性强、不易产生抗药性、作用持效期长、能有效保护天敌、生产成本低等优点日益受到人们的青睐。

芽孢杆菌(Bacilliussp)是一种受到广泛关注的生防细菌。以其分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽胞、贮藏期长和使用方便等特点，成为一种理想的生防微生物。因芽孢杆菌能产生内生芽胞，有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，在剂型加工环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。

目前，用于防治作物黄萎病的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、阿萨尔基亚芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌等，取得了显著的防治效果。但是由于病原菌的多样性和同步进化，仍需要寻找新的菌株应用于防治作物黄萎病。

经检索，没有发现有关本发明解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27684的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于防治作物黄萎病的解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、杀菌谱广等优点。

本发明另一目的在于提供利用上述解淀粉芽孢杆菌生产的微生物菌剂。

本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。

本发明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株在防治作物黄萎病上的用途。

本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治作物黄萎病上的用途。

本发明第六目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株的鉴定方法。

本发明第七目的在于提供上述微生物菌剂的鉴定方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株HMB27684，己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.11456。

利用上述解淀粉芽孢杆菌HMB27684生产的微生物菌剂，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌HMB27684菌体。

上述微生物菌剂，其HMB27684的活菌数大于17.0×10⁸cfu/mL。

上述微生物菌剂可以为液体制剂或粉剂。

上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的HMB27684菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃下培养10～16小时，得活化的菌株；

(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mLLB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下培养10～16小时，得种子液；

(3)发酵培养：按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基(pH值为7.0)中，在温度为25～35℃、转速为150～220rpm条件下发酵培养40～50h，得发酵液；

(4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为HMB27684菌株的液体制剂。

所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。

上述制备方法步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基，其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL。

上述制备方法步骤(2)中所述的LB液体培养基，其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。

上述制备方法步骤(3)中所述的所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl0.1～1.0％，MnSO₄·H₂O0.5～1.0％，其余为水。

所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、NaCl和MnSO₄·H₂O混合，再加水，调节pH搅拌均匀即可。

所述的解淀粉芽孢杆菌HMB27684在防治作物黄萎病上的应用。

上述微生物菌剂在防治作物黄萎病上的应用。

上述应用中所述的作物是指棉花或茄子。

上述微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为10⁸cfu/mL，于棉花、茄子播种前将种子浸种半小时；或将上述所得微生物菌剂用碳酸钙吸附，制作成解淀粉芽孢杆菌HMB27684粉剂，于棉花、茄子播种前按照药种比1：10拌种，均可达到预防棉花、茄子黄萎病发生的目的。

HMB27684菌株的筛选分离过程

HMB27684菌株是从湖北省荆州市的棉田土壤中分离得到。2013年4月从湖北省荆州市棉田中五点采集土样，混匀后称取1g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液10mL加入50mL灭菌离心管中，在80℃恒温水浴30分钟，然后取1mL加无菌水9mL，即成10mL10^-3倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10^-4、10^-5、10^-6倍稀释液，取各浓度微生物悬液200μL涂于LB培养基平板上，每个浓度重复3次，在30℃恒温培养1d-3d，进行细菌的分离和纯化。并以棉花、茄子黄萎病为靶标，通过双层平板法、盆栽试验法进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对棉花、茄子黄萎病具有明显防治效果的菌株，定名为HMB27684。

HMB27684菌株的分类鉴定：

(1)形态特征鉴定

在LB培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB27684属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(2)利用16SrDNA序列鉴定分类

以HMB27684的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16SrDNA进行PCR扩增，所述的引物序列为：

F27：5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG3’；(SEQIDNo:1)

R1492：5’GGCTACCTTGTTACGACTT3’；(SEQIDNo:2)

16SrDNA的扩增反应体系为50μL:10×PCRBuffer(Mg²⁺)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL，F27(10μmol/L)1μL，R1492(10μmol/L)1μL；HMB27684的基因组DNA50ng；ddH₂O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得到HMB27684的16SrDNA序列(见SEQIDNo:3)。将所得HMB27684的16SrDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB27684与芽孢杆菌属的16SrDNA同源性达到99％；构建系统发育树(见图1)，HMB27684与芽孢杆菌属聚合到一起，说明HMB27684属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(3)利用gyrB基因序列鉴定分类

以HMB27684基因组DNA为模板，利用芽孢杆菌gyrB基因简并引物gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列为：

gyrB-F：5’TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3’；(SEQIDNo:4)

gyrB-R：5’TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3’；(SEQIDNo:5)

gyrB的PCR扩增反应体系为50μL:10×PCRBuffer(Mg²⁺)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)1μL，gyrB-R(10μmol/L)1μL；HMB27684基因组DNA50ng；ddH₂O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB27684菌株的gyrB基因序列(见SEQIDNo:6)。将获得的HMB27684菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，同时利用MEGA软件(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树。结果发现HMB27684与解淀粉芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高；构建系统发育树(见图2)，HMB27684菌株与解淀粉芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB27684为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且是一个新菌株。

综合以上形态特征、16SrDNA和gyrB基因序列同源性对比分析的结果，可知HMB27684属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且和现有的解淀粉芽孢杆菌菌株不同，是一个新菌株。

上述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27684的鉴定方法，包括以待测菌株的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:3所示的核苷酸序列，即为HMB27684菌株。

上述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27684的鉴定方法，包括以待测菌株的基因组DNA为模板，以gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，即为HMB27684菌株

上述微生物菌剂的鉴定方法，包括以待测菌剂中提取的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:3所示的核苷酸序列，即为HMB27684微生物菌剂。或以待测菌剂中提取的基因组DNA为模板，以gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，即为HMB27684微生物菌剂。

本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明为防治棉花、茄子等作物黄萎病提供了一个高效的微生物，开辟了一个有效防治途径；(2)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花、茄子黄萎病的药效高，平均防效在70.0％以上，且针对性强；(3)本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；(4)利用本发明方法防治棉花、茄子黄萎病不易产生抗药性；(5)本发明制备方法简单、成本低、使用简单。

附图说明

图1为根据16SrDNA序列获得的HMB27684菌株的系统发育树图。

图2为根据gyrB基因序列获得的HMB27684菌株的系统发育树图。

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1HMB27684微生物菌剂的制备

按照如下步骤进行：

(1)菌种活化：将保存于-80℃的解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27684(该菌株己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11456)在LB平板培养基在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃下进行活化，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培养12小时，得活化的菌株；

(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，水1000mL)，在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤(1)中活化的菌株，在30℃、摇床转速190rpm的条件下进行振荡培养12小时，得种子液；

(3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉1.5％，黄豆粉2.0％，NaCl0.5％，MnSO₄·H₂O0.6％加入水中，搅拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃对玉米粉黄豆粉培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；

(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶玉米粉黄豆粉培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃、摇床转速180rpm条件下进行发酵培养36h，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽胞和总菌体数进行计数，并计算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞数/(成熟芽胞数+菌体数)×100)；芽胞率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养48h，得解淀粉芽孢杆菌HMB27684的液体制剂。

实施例2解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎菌孢子萌发的抑制作用

(一)试验时间和地点：2013年6月在生防实验室内进行。

(二)试验方法：

(1)供试棉花黄萎菌来源：棉花黄萎菌WX-1菌株采自河北省邢台市威县棉花黄萎病病株，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定为大丽花轮枝菌(Verticilliumdahaliae)，致病力测定表现为强致病力。

(2)平板测定试验：

首先将棉花黄萎菌WX-1在PDA平板上活化，培养7天后在菌落边缘区域挑取4-5块菌丝块(不规则形，约15mm²)，接入PDB培养液中，在恒温摇床培养4天(25℃，170转/分)。将液体培养物在无菌操作台中用双层无菌纱布过滤，得棉花黄萎菌孢子悬浮液(10⁸个孢子/毫升)。在100mLPDA培养基(45-50℃)中加入2mL棉花黄萎菌孢子悬浮液,，混匀后制作PDA平板。在PDA平板上点接待测芽孢杆菌HMB27684，培养3天后观察抑菌圈透明程度(+++表示完全透明；++表示半透明；+表示不透明)并测量抑菌圈大小。

结果(见表1)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB276384对棉花黄萎菌孢子萌发具有强烈抑制作用，产生透亮的抑菌圈，抑菌圈直径1.8mm。说明解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎菌具有显著的抑制作用，具有防治棉花黄萎病的生防潜力。

表1HMB27684菌株对棉花黄萎菌孢子萌发的抑制作用试验结果

菌株名称透明圈亮度透明圈直径(mm)HMB27684+++1.8

实施例3解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎菌菌丝生长的抑制作用试验

(一)试验时间和地点：2013年7月在生物防治实验室内进行。

(二)试验方法：

(1)供试棉花黄萎菌来源：棉花黄萎菌WX-1菌株采自河北省邢台市威县棉花黄萎病病株，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定为大丽花轮枝菌(Verticilliumdahaliae)，致病力测定表现为强致病力。

(2)平板测定试验：

首先将棉花黄萎菌WX-1在PDA平板上活化，培养7天后在菌落边缘区域，用打孔器()打孔制成菌片，将棉花黄萎菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例1步骤(1)活化的解淀粉芽孢杆菌HMB27684点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照(不点接HMB27684菌株的棉花黄萎菌生长情况)。25℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量棉花黄萎菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种HMB27684后的抑制生长半径)，拮抗作用用抑菌率表示。计算公式：

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100。

结果(见表2)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎菌的抑制率达85.00％；透明的抑菌带宽11.0毫米；说明解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎菌具有明显的抑制作用，具有防治棉花黄萎病的生防潜力。

表2HMB27684菌株对棉花黄萎菌的拮抗作用试验结果

菌株名称对照生长量(mm)处理生长量(mm)抑菌率(％)HMB2768430.04.585.00

实施例4解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎病的防治效果试验

(一)试验处理：

(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27684液体制剂；用水稀释100倍。

(2)药剂对照：10亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(保定市科绿丰生化科技有限公司)；用水稀释100倍。

(3)空白对照：清水

(二)试验方法：本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。棉花品种选用冀丰106，播种前应用实施例1制备的HMB27684液体制剂100倍水稀释液浸种半小时；以“10亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂”稀释100倍浸种半小时作为药剂对照；以清水浸种半小时作为空白对照。播种后正常培养。待棉苗生长至两片真叶时，切根接种棉花黄萎菌WX-1菌株的孢子悬浮液(107个孢子/毫升)。继续培养至空白对照充分发病时调查病情指数，计算防治效果。

表3解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎病防效试验结果

处理病情指数防效(％)HMB2768421.39b74.3010亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂23.69b71.54空白对照83.23a--

结果(见表3)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎病具有很好的防治效果，防效可达74.30％，与正式登记的微生物杀菌剂防治棉花黄萎病的效果(71.54％)相当。说明本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27684及其微生物菌剂对棉花黄萎病具有很好的防治效果。

实施例5解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎病的防治效果试验

(一)试验处理：

(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27684液体制剂；按照1：1比利添加碳酸钙，制备HMB27684粉剂。

(2)药剂对照：10亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(保定市科绿丰生化科技有限公司)。

(3)空白对照：清水

(二)试验方法：本试验在生防实验室内进行。将实施例1制备的HMB27634液体制剂按照1：1比利添加碳酸钙，制备HMB27634粉剂。棉花品种选用冀丰106，播种前应用制备的HMB27634粉剂按照药种比1：10拌种；以“10亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂”按照药种比1：10拌种作为药剂对照；以不处理种子作为空白对照。播种后正常培养。待棉苗生长至两叶一新片真叶时，切根接种棉花黄萎菌WX-1菌株的孢子悬浮液(10⁷个孢子/毫升)。继续培养至空白对照充分发病时调查病情指数，计算防治效果。

结果(见表4)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎病具有很好的防治效果，防效可达68.30％，与正式登记的微生物杀菌剂防治棉花黄萎病的效果(69.67％)相当。说明本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27684及其微生物菌剂对棉花黄萎病具有很好的防治效果。

表4解淀粉芽孢杆菌HMB27684对棉花黄萎病防效试验结果

处理病情指数防效(％)HMB2768420.13b68.3010亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂19.26b69.67空白对照63.51a--

实施例6解淀粉芽孢杆菌HMB27684对茄子黄萎病的防治效果试验

(一)试验处理：

(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27684液体制剂；用水稀释100倍。

(2)药剂对照：10亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(保定市科绿丰生化科技有限公司)；用水稀释100倍。

(3)空白对照：清水

(二)试验方法：

(1)供试茄子黄萎菌来源：茄子黄萎菌RY-1菌株采自河北省衡水市饶阳县茄子黄萎病病株，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定为大丽花轮枝菌(Verticilliumdahaliae)，致病力测定表现为强致病力。

(2)盆栽试验：本试验在生防实验室内进行。茄子品种选用韩育黑长茄，播种前应用实施例1制备的HMB27684液体制剂100倍水稀释液浸种半小时；以“10亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂”稀释100倍浸种半小时作为药剂对照；以清水浸种半小时作为空白对照。播种后正常培养。待棉苗生长出第5片真叶时，切根接种茄子黄萎菌RY-1菌株的孢子悬浮液(10⁷个孢子/毫升)。继续培养至空白对照充分发病时调查病情指数，计算防治效果。

结果(见表5)解淀粉芽孢杆菌HMB27684对茄子黄萎病具有很好的防治效果，防效可达72.23％，优于正式登记的微生物杀菌剂防治茄子黄萎病的效果(68.08％)。说明本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27684及其微生物菌剂对茄子黄萎病具有很好的防治效果。

表5解淀粉芽孢杆菌HMB27684对茄子黄萎病防效试验结果

处理病情指数防效(％)HMB2768416.88b72.2310亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂19.38b68.08空白对照60.83a--

实施例7解淀粉芽孢杆菌HMB27684对茄子黄萎病的防治效果试验

(一)试验处理：

(1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27684液体制剂；按照1：1比利添加碳酸钙，制备HMB27684粉剂。

(2)药剂对照：10亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(保定市科绿丰生化科技有限公司)。

(3)空白对照：未处理

(二)试验方法：

(1)供试茄子黄萎菌来源：茄子黄萎菌RY-1菌株采自河北省衡水市饶阳县茄子黄萎病病株，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定为大丽花轮枝菌(Verticilliumdahaliae)，致病力测定表现为强致病力。

(2)盆栽试验：本试验在生防实验室内进行。将实施例1制备的HMB27634液体制剂按照1：1比利添加碳酸钙，制备HMB27634粉剂。茄子品种选用韩育黑长茄。选用富养基质育苗土，高压蒸汽灭菌2小时，以铺满育苗土的育苗盘作为底盘，育苗盘内每穴定植1株茄苗，培养至3-4片真叶时备用。将茄子黄萎菌菌丝块接种在PDB培养液中，在28℃，170转/分培养4天，过滤菌丝得到分生孢子，接入无菌育苗基质中，混匀，使得土壤中黄萎菌分生孢子含量达到10⁶个/克土壤。将带菌土壤装入直径15厘米的花盆，在花盆中定植茄苗的位置施入制备的HMB27634粉剂1.5克，每盆中定植一株茄苗。移栽时托起锥形育苗盘使茄苗根梢断掉以利于病原菌侵染。然后覆盖带菌土壤。以穴施10亿芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1.5克为药剂对照，以不穴施药剂直接移栽茄苗作为空白对照。移栽后正常培养，至空白对照充分发病时调查病情指数，计算防治效果。

结果(见表6)解淀粉芽孢杆菌HMB27684对茄子黄萎病具有很好的防治效果，防效可达75.02％，与正式登记的微生物杀菌剂防治茄子黄萎病的效果(78.33％)相当。说明本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27684及其微生物菌剂对茄子黄萎病具有很好的防治效果。

表6解淀粉芽孢杆菌HMB27684对茄子黄萎病防效试验结果

处理病情指数防效(％)HMB2768418.3b75.0210亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂15.8b78.33空白对照73.3a---