一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用。检测试剂盒包括引物、内参基因和阴性对照；所述引物的正向引物的碱基序列如SEQ？ID？No.42～82所示中的至少一种，反向引物的碱基序列如SEQ？ID？No.83所示。本发明发现SEQ？ID？No.1～41所示的miRNA分子在肺癌组织、癌旁组织以及正常组织中均存在差异性表达，且差异性表达显著，可用作肺癌诊断标记物，并针对miRNA分子设计了相应的引物以及含有该引物的试剂盒，通过对样品进行实时荧光定量PCR，检测该样品中是否存在差异性表达miRNA，即可对该样品所属个体是否患有肺癌进行初步判断，为临床诊断和预后提供参考。

说明书

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种肺癌差异性表达microRNA 的检测试剂盒及其应用。

背景技术

肺癌已成为世界范围内最主要的肿瘤死亡原因，大约31％与癌症相关 的死亡是由肺癌造成的。早期诊断是降低癌症患者死亡率的关键因素。目 前的临床诊断手段对发现早期肺癌并不十分有效，3/4的病人在确诊时肺 癌已发生转移。另外，由于肺癌的多样性和复杂性，许多肺癌患者的发展 和治疗结果与临床分期极不相符，导致同期的癌症患者在接受相同的治疗 措施后，预后效果却差异很大。因此寻找早期肺癌诊断以及分子分型的临 床分子标记物成为当务之急，是急需解决的重大科学问题。

现有的临床诊断技术远不能满足早期诊断的需要。早期的X光仅能发 现直径在1cm以上的瘤块，CT扫描及B超检查，可检出直径在0.5cm左 右的肿瘤，MRI和PET检查，可以发现更小的肿瘤组织，但其特异性低， 仍需要病理活检的辅助才能明确诊断。支气管镜、胃镜、膀胱镜等内窥镜 的使用，极大地提高了肺癌、消化系统肿瘤及膀胱癌等的诊断率，但均为 介入性检查，对患者的损伤和痛苦大，且对操作者技术要求高，价格昂贵， 不适用于大规模的人群筛选普查。因此，寻找正确、可靠的、无创伤的肿 瘤早期诊断方法成为当务之急。早期诊断肿瘤最快速的方法是通过检测和 分析血液中的肿瘤标记物。这些分子标记物并不局限于原发肿瘤所处的位 置，而且较易采集，在肿瘤的早期诊断和预后等方面发挥着重要作用。

目前，人类发现的血清标记物已有百余种，但由于肿瘤的多样性和复 杂性，特异性强、具有明确诊断作用的标记物并不多。临床常用的仅20 多种，能用于大规模人群普查的肿瘤标记物更少。美国食品医药管理局 (FDA)批准的生物指标如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列 腺特异抗原(PSA)等，对肝癌、结肠癌及前列腺癌诊断的特异性和敏感 性都较低，无法达到诊断肿瘤的指标，只能作为诊断的辅助指标或者与其 他临床参数一起作为判断患者预后的参考指标。

研究发现，循环miRNA不仅能有效区分正常个体和肿瘤病人，而且 能正确评估肿瘤的恶性程度。血浆miR-92用于结直肠癌的分子诊断，其 灵敏度可达89％，特异度达到70％，肿瘤切除后血浆miR-92的表达水 平较术前显著降低。血清miR-21的浓度不仅能区分乳腺癌病人和健康个 体，而且能区分乳腺癌早期和晚期病例。

近几年来，随着对miRNA研究的深入，人们发现循环miRNA不仅 具有良好的稳定性，而且具有显著的肿瘤相关性和组织特异性，这些研究 奠定了循环miRNA作为肿瘤生物标记物的理论基础。细胞中miRNA能 在转录后水平调控靶基因表达和蛋白质翻译，广泛参与各种正常的生命过 程，其功能失调与肿瘤的发生、发展密切相关。然而多数循环miRNA的 生成机制、生物学功能以及与相关肿瘤的关系目前尚不明确。

发明内容

本发明提供了一类用作肺癌诊断标记物的miRNA，该miRNA在肺癌 组织中存在差异表达。

本发明利用miRNA基因芯片(TaqManMicroRNAArray(humanA+B 板3.0)技术对临床收集的正常肺组织和肺癌组织标本进行分析，筛选出 在肺癌组织中表达均异常且有明显上升趋势的118种miRNA分子。然后 利用实时荧光定量PCR对筛选得到的118种miRNA分子进行验证和进一 步筛选，从中得到了41种miRNA分子。

申请人发现，这41种miRNA分子在肺癌组织、癌旁组织以及正常组 织中均存在差异性表达，且差异性表达显著，因此可作为肺癌诊断标记物， 用于判断受检个体是否有肺癌风险。

因此，本发明提供了miRNA作为标记物在制备用于诊断肺癌的试剂 盒中的应用，所述miRNA为碱基序列如SEQIDNo.1～41所示核苷酸中的 一种或多种。

利用该试剂盒进行肺癌诊断时，如所述试剂盒检测出样品中所述 miRNA的表达量与阴性对照相比具有显著差异，则诊断为有患癌风险。 所述样品优选为血清。

作为优选，所述试剂盒为逆转录实时荧光定量PCR试剂盒。利用该 试剂盒进行肺癌诊断的方法，可按以下步骤进行：

(1)提取样品中的miRNA，并将miRNA反转录为cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用引物进行实时荧光定量PCR，检测相应 miRNA的相对表达量并与阴性对照进行比较，判断该miRNA是否存在差 异性表达。

作为优选，采用2^-△△CT法比较样品与阴性对照中miRNA的相对表达 量；然后通过T检验比较两者的相对表达量是否存在显著差异(p<0.05)。 若碱基序列如SEQIDNo.1～41所示的miRNA分子中的任一种存在差异性 表达，则将该样品所属个体诊断为有患癌风险。

本发明还提供了一种用于检测肺癌差异性表达microRNA的引物，可 用于扩增所述miRNA分子，其中，正向引物为碱基序列如SEQID No.42～82所示核苷酸中的至少一种，反向引物为碱基序列如SEQIDNo.83 所示的核苷酸。

碱基序列如SEQIDNo.42～82所示的正向引物是与碱基序列如SEQ IDNo.1～41所示的miRNA分子一一对应的特异性扩增引物，碱基序列如 SEQIDNo.83所示的反向引物是通用引物。

鉴于所述引物能够特异性扩增上述的miRNA分子，因此本发明还提 供了所述引物在制备用于检测肺癌差异性表达microRNA的试剂盒中的应 用。

进一步地，本发明还提供了一种肺癌差异性表达microRNA的检测试 剂盒，包括所述引物，以及内参基因和阴性对照。

本发明中，所述内参基因为hsa-miR-16-5p。其碱基序列如SEQID No.84所示。用于扩增该内参基因的引物，其正向引物的碱基序列如SEQ IDNo.85所示，反向引物的碱基序列如SEQIDNo.83所示。

阴性对照即为从正常个体组织中提取的miRNA。

进一步地，本发明还提供了所述的检测试剂盒在诊断肺癌中的应用； 如所述试剂盒检测出样品中所述miRNA的表达量与阴性对照相比具有显 著差异，则诊断为有患癌风险。

进一步地，本发明还提供了所述的检测试剂盒在判断肺癌预后中的应 用；如所述试剂盒检测出样品中所述miRNA的表达量与阴性对照相比具 有显著差异，则判断为预后不良；反之则判断为预后良好。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明发现了碱基序列如SEQIDNo.1～41所示的miRNA分子在肺癌 组织、癌旁组织以及正常组织中均存在差异性表达，且差异性表达显著， 可用作肺癌诊断标记物，并针对miRNA分子设计了相应的PCR引物，通 过对样品进行实时荧光定量PCR，检测该样品中是否存在本发明所述的差 异性表达miRNA，即可对该样品所属个体是否患有肺癌进行初步判断， 为临床诊断和预后提供参考。

附图说明

图1为本发明差异性表达miRNA的筛选流程图。

具体实施方式

1基因芯片筛选差异性表达miRNA分子

临床收集15份人正常肺组织(正常组)和15份人肺癌组织(肿瘤组)， 利用基因芯片技术分析各样本中的miRNA表达谱。

(1)基因芯片筛选肺癌组织中差异性表达的miRNA

1)总RNA提取[试剂盒mirVanamiRNAIsolationKit(Ambion)]

①称取约50ng组织，在液氮中研磨。

②将研磨好的组织粉末加入含300μL裂解液的EP管中，充分混匀后 再加入300μL裂解液，分成2管。

③每管加入300μL变性剂，充分混匀后置于冰上5min。

④加入600μL酚：氯仿：异戊醇，涡旋1min充分混匀，室温离心 10000g，5min。

⑤小心吸取上层水相至另一干净的EP管中，加入1.25倍体积的无水 乙醇，充分混匀。

⑥将混匀的溶液加入过滤柱中，室温离心10000g，15s。

⑦弃废液，用700μL洗液1洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃 滤液。

⑧用500μL洗液2/3洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤液；

⑨再次用500μL洗液2/3洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤 液；

⑩加入适量95℃预热的RNasefreewater于过滤柱的柱心上，室温放 置5min后离心，10000g，1min，滤液即是包含总RNA的溶液。

2)反转录[试剂盒(TaqManMicroRNAReverseTranscriptionKit)]

①如下配制反应体系：

颠倒6次混匀，稍离心。

②加3μL(350～1000ng)TotalRNA到反应管，颠倒6次混匀，稍离 心，冰上放5min。

③PCR仪上设如下反应程序并反应：

反应完成后，将反转录产物置于冰水上备用。

(2)miRNA基因芯片筛选肺癌组织中的差异性表达miRNA

①配制PCRreactionmix，在1.5ml离心管加入下列试剂：

颠倒6次混匀，稍离心。

②TaqManMicroRNAArray(A+B)上样。

每个上样点加100μLPCRreactionmix，1200rpm离心2次，每次1min。 上机反应。

③将正常组数据与肿瘤组的数据进行比较，利用随机方差模型(RVM) 进行差异性表达miRNA位点筛选(以大于1.5，或小于0.5倍为界)。分 析工具为TwoClassDif，筛选出118个差异性表达miRNA。具体如下：

2实时荧光定量PCR筛选差异性表达miRNA

(1)正常肺组织、肺癌组织和癌旁正常组织的miRNA抽提及其反 转录

临床收集25份人正常肺组织(正常组)、24份人肺癌组织(肿瘤组) 和19份人肺癌旁组织(癌旁组)，从实施例1筛选获得的miRNA分子中 挑选预期差异最大的41个miRNA，利用实时荧光定量PCR技术分析样 本中相应miRNA的表达谱，进行验证。这41个miRNA具体如下：

1)miRNA提取

①称取约50ng组织，在液氮中研磨。

②将研磨好的组织粉末加入含300μL裂解液的EP管中，充分混匀后 再加入300μL裂解液，分成2管。

③每管加入300μL变性剂，充分混匀后置于冰上5min。

④加入600μL酚：氯仿：异戊醇，涡旋1min充分混匀，室温离心 10000g，5min。

⑤小心吸取上清于另一干净EP管中，加入1/3上清体积量的无水乙 醇，混匀后加入过滤管上层，室温离心10000g，30s。

⑥弃过滤柱，在滤液中加入其2/3体积的无水乙醇，混匀后加入过滤 管上层，室温离心10000g，30s，弃滤液。

⑦用700μL洗液1洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤液。

⑧用500μL洗液2/3洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤液。

⑨再次用500μL洗液2/3洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤 液。

⑩加入适量95℃预热的RNasefreewater于过滤柱的柱心上，室温放 置5min后离心，10000g，1min，弃去过滤柱，测定滤液中miRNA浓度。

2)反转录[试剂盒miRNAcDNASynthesisKit(OriGene)]

①根据microRNA浓度计算500ngmicroRNA所需的体积XμL，并配 制以下反转录体系：

总体积10μL。

②将上述溶液加入EP管中，混匀后短暂离心，37℃水浴2h。

③管子中加入1μLoligodT，混匀离心后70℃水浴5min。

④将水浴完成的管子迅速置于冰上2min。

⑤向管子中加入：

5xMMLVbuffer4μL

MMLV1μL

RNasefreewater5μL；

混匀离心后，42℃水浴1h。

⑥95℃水浴5min。

⑦管子中加入180μLRNasefreewater，混匀离心，50μL每管分装后 于-80℃保存。

(2)荧光实时定量PCR鉴定肺癌组织中的差异性表达miRNA

(1)实时荧光定量PCR检测

①PCR反应体系：

总体积25μL。

②PCR反应程序：

③数据统计和分析

采用2^-△△CT法计算各样品中118种miRNA分子的cDNA扩增产物的 荧光强度，用于表示各miRNA分子的起始模板量(相对表达量)：

ΔCT＝CT(目的基因)-CT(内参基因)；

ΔΔCT＝ΔCT-ΔCT的中位值

2^-ΔΔCT＝power(2，-ΔΔCT)。

并通过T检验对正常组、肿瘤组、癌旁组中同一种miRNA的2^-ΔΔCT值进行两两比较，检验该miRNA在三种组织中的表达否存在显著差异。

通过分析验证可知，这41种miRNA在肺癌组织和健康组织中确实存 在差异性表达，可用作肺癌诊断标记物。