炭疽毒素受体CMG2与人血清白蛋白的融合蛋白

摘要

本发明公开了一种融合蛋白，所述融合蛋白第一部分为重组炭疽毒素受体CMG2，第二部分为重组人血清白蛋白，所述第一部分与第二部分由连接肽连接，所述融合蛋白在体内半衰期较重组炭疽毒素受体CMG2增加了近20倍，同时还具有很好的体内活性，能够完全保护被攻毒的实验动物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，属于多肽技术领域。

背景技术

炭疽病是由炭疽芽胞杆菌引起的人畜共患烈性传染病。由于炭疽芽 胞杆菌形成的芽胞对外界环境的抵抗力强，因此其是一种潜在的生物战 剂和生物恐怖病原体。炭疽杆菌的两个主要毒力因子为荚膜和外毒素， 其中外毒素被认为是炭疽芽胞杆菌致病的关键因子。外毒素由三种蛋白 组成：保护性抗原(ProtectiveAntigen，PA)、致死因子(LethalFactor， LF)、水肿因子(EdemaFactor，EF)。EF是一种钙离子依赖的腺苷酸环 化酶，能够上调细胞内cAMP水平；LF是一种锌离子依赖的金属酶，可 以阻断MAPKK信号通路；PA与细胞膜上的受体结合是LF和EF进入 细胞发挥生物学作用的关键步骤。细胞膜上有两种炭疽毒素受体： TEM8/ANTXR1受体(TumorEndothelialMarker8/AnthraxToxinReceptor 1)和CMG2/ANTXR2受体(CapillaryMorphogenesisProtein2/Anthrax ToxinReceptor2)，CMG2即毛细管形态发生蛋白2。近期，在条件敲除 小鼠模型中的试验结果提示，CMG2在介导炭疽毒素发挥作用导致宿主 死亡的过程中发挥主要作用，而TEM8在此过程中仅发挥部分作用。 CMG2最初在人类的胎盘组织中被发现，其基因在人类脐带静脉血管的 内皮细胞中特异性上调，在胶原蛋白毛细血管形成中被高水平诱导表达， 并且能够特异性地结合IV型胶原蛋白和层粘连蛋白。CMG2作为炭疽毒 素受体，被命名为ANTXR2；根据结构可将CMG2划分为信号肽、胞外 区、跨膜区、胞内区等区域；而与炭疽毒素结合位点位于胞外区，更明 确的说位于胞外区的vWA结构域(命名为solubleCMG2，sCMG2，即 可溶性CMG2)。虽然两种炭疽毒素受体的氨基酸同源性约为40％，vWA 结构域的氨基酸同源性高达60％，但是二者与PA的亲和力却不尽相同。 有研究显示，SPR法测得与PA的亲和力方面，哺乳动物细胞表达的 sCMG2较sTEM8(可溶性TEM8，solubleTEM8)高1000倍以上，因此 CMG2成为了炭疽受体相关研究的主要分子。类受体(可溶性受体样分 子)作为炭疽特异性治疗药物不仅可以中和野生型PA的作用，而且针对 PA突变体同样能够起到阻断炭疽毒素发挥作用的目的。但是，作为一种 治疗用蛋白药物，sCMG2在体内的半衰期较短，其消除半衰期仅为24 分钟左右。因此，一些研究将sCMG2与抗体Fc段进行融合，通过构建 融合蛋白的方式延长类受体的体内半衰期。有研究报道，将炭疽毒素受 体胞外vWA结构域与人IgG-Fc融合，形成双分子的抗体样结构 (vWA-Fc)，可以提高类受体的半衰期，亲和力可以达到0.2nmol/L；在炭 疽芽胞攻击小鼠模型上，vWA-Fc在50μg/只的剂量下就可以完全保护实 验动物。除了用哺乳动物细胞来表达Fc融合的类受体分子外，有研究报 道利用植物表达系统也同样获得了活性很好的CMG2-Fc蛋白。在炭疽芽 胞攻击家兔模型中，2mg/kg的剂量可以完全保护100×LD₅₀的Ames芽胞 攻击的家兔，同时这种表达系统较哺乳动物表达系统成本低，可以作为 大规模生产的一种方法。另外，研究人员通过计算机辅助设计，将sCMG2 上的117位氨基酸突变后与人IgG-Fc融合，将sCMG2与PA的亲和力提 高了近4倍，该融合蛋白CMG2(E117Q)-Fc与PA摩尔比0.5：1时能 够保护炭疽毒素攻击的Fisher344大鼠。但是也有文献报道，融合Fc的 策略虽然能够延长类受体的体内半衰期，却不能够最终保护实验动物， 仅仅能够延长实验动物的存活时间。研究人员推测因为Fc融合蛋白与PA 结合后，在体内形成稳定的复合物，从而长时间存在于血液循环系统中， 因动态平衡导致PA缓慢释放，造成实验动物最终死亡，在本发明人的试 验中也观察到了类似的现象。同时由于Fc还可能介导ADCC或CDC等 其他效应，对于延长类受体的体内半衰期而言这些功能并不必要，反而 可能引起其他不可控的作用。

人血清白蛋白(Humanserumalbumin,HSA)是人体血清中的主要成 分,对维持血浆渗透压和血浆体积发挥至关重要的作用。人血清白蛋白是 分子量为66.5kDa的非糖基化蛋白,，占血浆总蛋白的60％，肾清除率非 常低，半衰期为14-20天。综上所述，治疗性蛋白质药物与人血清白蛋白 形成融合蛋白后，融合蛋白将具有极大的优势，使之可抵御生物体内酶 解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，还可以较高 剂量使用。同时HSA融合蛋白可以通过酵母表达系统来表达，成本低廉。 因此为获得与PA亲和力高，在体内半衰期长、活性好的类受体分子，发 明人意欲选择将类受体与人血清白蛋白(HSA)构建融合蛋白的方式， 即将sCMG2与HSA构建融合蛋白，期望获得的融合蛋白CMG2-HSA能 够具有很好的抑制炭疽毒素的作用，同时又能够有合适的体内半衰期， 在动物模型上达到最终能够完全保护实验动物的效果。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种融合蛋白，所述融合蛋 白第一部分为重组毛细管形态发生蛋白2，即sCMG2，第二部分为重组 人血清白蛋白，所述第一部分与第二部分由连接肽连接，其中，连接肽 为(G₄S)_n，其中n为1-10的整数。

在一个优选的技术方案中，所述第一部分位于融合蛋白的C末端， 第二部分位于融合蛋白的N末端，其中n＝3。

在一个优选的技术方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。相较于sCMG2的野生型序列，SEQIDNO:1在氨基端的第 175位半胱氨酸突变成丙氨酸。

其次，本发明还提供了一种表达上述融合蛋白的核苷酸编码序列， 所述序列如SEQIDNO:2所示。

本发明接着提供了一种含有上述序列的真核表达载体，所述载体为 pMEX9K。pMEX9K载体属于毕赤酵母表达系统。毕赤酵母表达系统是 进行外源蛋白表达很成熟的表达系统之一，生长迅速，培养条件简单， 相关操作技术成熟。本申请人于2005年获得了关于pMEX9K表达载体 的中国发明专利授权(CN02117906.9)，其是一种毕赤酵母分泌外源蛋白 的表达载体。该专利文献被引用至本申请，作为申请内容的一个组成部 分。

另外，本发明又提供了一种含有上述载体的宿主细胞，所述宿主细 胞为毕赤酵母菌GS115。

最后，本发明提供了一种表达上述融合蛋白的方法，所述方法包括 以下步骤：

(1)以PCR重叠扩增法构建所述融合蛋白的表达载体；

(2)将步骤(1)获得的载体转化入宿主细胞；

(3)诱导步骤(2)获得的被转化的宿主细胞表达所述融合蛋白；

(4)收集和纯化所述融合蛋白。

在一个优选的技术方案中，步骤(1)所述的表达载体是在pMEX9K 的基础上构建的。

在另一个优选的技术方案中，所述宿主细胞为毕赤酵母菌GS115。

在又一个优选的技术方案中，步骤(4)所述的纯化为亲合层析柱 Blue-Sepharose和Q-HP柱(GE)的两级纯化。

CMG2(作为炭疽毒素受体，被命名为ANTXR2)具有信号肽、胞 外区、跨膜区、胞内区等区域；而与炭疽毒素结合位点位于胞外区，更 明确的说位于胞外区的vWA结构域。CMG2胞外区包括7个半胱氨酸残 基，能够形成二硫键，这给表达以及后续的蛋白纯化带来了很大的困难， 因此，本发明人针对与炭疽毒素作用最为直接的vWA结构域作为研究的 对象，设计炭疽毒素抑制剂。在vWA结构域中，仍然有3个半胱氨酸位 点，分别位于39、175、218号氨基酸残基，而半胱氨酸形成的二硫键是 影响蛋白热稳定性的关键因素之一，因此如何能够保留半胱氨酸又能够 保证表达的sCMG2能够形成正确的结构，具有很好的生物学活性是研究 的内容之一。在分析了CMG2的晶体结构后，发明人发现其氨基端第175 位的半胱氨酸位于一段β片层中，处于分子的内部，将该半胱氨酸突变 成丙氨酸后，一方面有利于39位和218位的半胱氨酸形成链内二硫键， 避免175位形成分子间二硫键，又能保护β折叠片层不被破坏。这一推 测通过试验得到了验证，对sCMG2在毕赤酵母中进行表达，通过 SDS-PAGE分析可以发现其分子量为预测值的两倍，而将175位半胱氨 酸突变成丙氨酸后，其分子量就与预测值吻合，本发明提供的sCMG2均 为C175A这个突变体形式。

本发明提供的CMG2-HSA融合蛋白与炭疽PA抗原具有较高的亲和 力，可达到nmol/L级别。其在体内的半衰期较sCMG2增加了近20倍。 发明人采用MTT法在J774A.1细胞模型上对类受体CMG2-HSA进行了 IC₅₀的测定，为了能够更好的反映CMG2-HSA在细胞模型上的活性，测 定还加入了sCMG2、CMG2-Fc(sCMG2与hIgG1Fc的融合蛋白)作为 参考蛋白。结果显示CMG2-HSA、sCMG2、CMG2-Fc的IC₅₀分别为 1.82nmol/L、2.03nmol/L、1.42nmol/L，三者之间没有显著性差异，反映 出CMG2-HSA保持了sCMG2在细胞模型上较好的生物学活性。在体内 毒素攻击试验中，本发明的融合蛋白对被攻毒的实验动物提供了100％的 保护率。总之，本发明提供的融合蛋白不仅具有在延长了类受体体内半 衰期的特性，同时具有很好的体内活性，能够完全保护实验动物。

附图说明

图1.CMG2的半胱氨酸分布及二硫键形成示意图；

图2.真核表达载体pMEX9K结构示意图；

图3.融合蛋白CMG2-HSA的SDS-PAGE凝胶电泳图谱；

图4.融合蛋白CMG2-HSA的WesternBlotting图谱；

图5.类受体与PA的亲和力的SPR法检测图谱，CMG2-HSA(图5A)、 sCMG2(图5B)；

图6.融合蛋白CMG2-HSA的在大鼠体内的药物动力学图示；

图7.融合蛋白CMG2-HSA的IC₅₀曲线；

图8.动物被攻毒后的经各种类受体治疗后存活时间对照图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将 会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的 保护范围构成任何限制。

实施例1：融合蛋白(CMG2-HSA)的制备

1、表达载体构建

CMG2与白蛋白的融合蛋白(CMG2-HSA)表达序列分三步构建：

第一步：用引物H-1F和H-1R通过PCR方法从含有HSA编码序列 cDNA的质粒(例如，本实验室保存的T-HSA质粒)扩增HSA片段，同 时分别在其5’端和3’端添加XhoI酶切位点和一部分连接肽序列(linker)： GGTGGAGGCGGTTCAGGCGG。用引物CMG2-F和CMG2-R通过PCR 方法由含有sCMG2编码序列的质粒(例如，本实验室保存的 PQE30-sCMG2)扩增sCMG2片段，同时分别在其5’端和3’端添加另一 部分linker序列(GTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG)和NotI酶切位点。 上述步骤也可以通过人工合成核苷酸序列完成。相较于sCMG2的野生型 序列，本发明中sCMG2在氨基端的第175位半胱氨酸突变成丙氨酸(SEQ IDNO:1所示序列的第175位)。这是因为，在vWA结构域中，有3个半 胱氨酸位点，分别位于39、175、218号氨基酸残基，而半胱氨酸形成的 二硫键是影响蛋白热稳定性的关键因素之一。由于自氨基端的第175位 半胱氨酸位于一段β片层中，处于分子的内部，将该半胱氨酸突变成丙 氨酸后，一方面有利于39位和218位的半胱氨酸形成链内二硫键，避免 175位形成分子间二硫键，又能保护β折叠片层不被破坏。CMG2的半胱 氨酸分布及二硫键形成请参见图1.

第二步：在第一步扩增HSA的基础上，利用H-1F和H-2R，以第一 轮HSA扩增的核酸片段为模版扩增第二轮HSA，通过PCR法在其3’端 将linker剩下部分(AGGTGGCTCTGGCGGTG)添加到HSA片段上；

利用引物C-2F和CMG2-R，以第一轮获得的sCMG2核酸片段为模 板，通过PCR法在其5’端加入linker的一部分(TCAGGCGGAG)。

第三步：将第二步获得的两个片段：HSA和sCMG2共同作为模板， 此时HSA的3’端和sCMG2的5’端之间linker部分有部分重叠，因此利 用H-3F和C-3R这对引物进行重叠延伸PCR，最终获得目的片段 XhoI/HSA-linker-sCMG2/NotI(序列如SEQIDNO:2所示)。

CMG2-HSA表达序列通过XhoI和NotI酶切位点连入到酵母表达载 体pMEX9K中，最终获得的CMG2-HSA表达载体经测序确认序列与预 期一致。pMEX9K由毕赤酵母蛋白表达专用载体pPIC9K(Invitrogen^TM， K1750-01)改构而来，此载体是融合表达载体，可以将目的基因克隆至 载体的MCS(多克隆位点)处，通过AOX1启动子启动蛋白表达，并利 用载体上的α因子信号肽序列诱导蛋白分泌至胞外(见图2)。引物序列 见表1。

表1.构建CMG2-HSA融合质粒所使用的引物

2、蛋白表达与纯化

将构建好的CMG2-HSA质粒用SalI线性化后，通过电穿孔系统 (BIO-RAD，GenePulserXcell^TM)转化到GS115毕赤酵母感受态细胞中 (Invitrogen)，涂布于MD平板上，30℃培养48-72小时。挑取重组 GS115/CMG2-HSA单克隆接种至含25mlBMGY培养基的250ml摇瓶中， 28-30℃，250rpm培养至OD₆₀₀＝2-6(约16-18h)，然后将过夜培养物接种 至含1LBMGY培养基的5L摇瓶中，28-30℃，250rpm继续培养至对数 生长期(OD₆₀₀＝2-6)。收集培养物，室温1500-3000g离心5min收集细胞， 去除原培养基，用1LBMMY培养基重悬酵母细胞，28℃，250rpm开始 诱导表达，每隔24h，添加甲醇至终浓度为0.5％，诱导表达72h后，室 温8000g离心20min收集酵母表达上清。使用超滤系统(WaterSep，WA 01005EXP24S0，Marborough，MA，USA)对酵母表达上清进行超滤浓 缩换液，使终体积浓缩至原体积的1/10，同时将缓冲液置换成20mmol/L PB(磷酸盐缓冲液)，PH7.4。使用亲合层析柱Blue-Sepharose(GE， Healthcare)进行粗纯化，在中性pH值上样，样品使用20mmol/L PB+2mol/LNacl洗脱；将洗脱峰回收合并，超滤换液至20mmol/LPB， 在中性PH下上样Q-HP柱(GE，Healthcare)，使用20mmol/LPB+1mol/L Nacl洗脱，收集洗脱峰回收合并，置换到PBS中保存样品。通过BCA ProteinAssay(Pierce,23227，USA)对样品进行蛋白含量测定，通过12％ 丙烯酰胺的SDS-PAGE凝胶电泳和WesternBlotting对CMG2-HSA蛋白 进行鉴定。

CMG2-HSA蛋白大小与预期较为一致，约为89kDa(见图3)，通过 anti-CMG2抗体也检测到相应条带(见图4)。

实施例2.SPR法检测类受体与PA的亲和力

采用BiacoreT200(GE)，于25℃完成。偶联、结合、再生等所用试 剂均来自BIAcore。反应用缓冲液为HBS-P+5mMMgCl₂(10mMHepes， 0.15MNaCl，0.005％P20,PH＝7.4)。在PH＝4.0时，通过氨基偶联的方式 将30μgPA固定在CM5芯片上。1个通道作为参比通道，仅用HBS-P+5mM MgCl₂作为流动相。再生缓冲液为10mM四硼酸钠，1mol/LNaCl，PH＝8.5， 所有数据分析采用BiacoreT200evaluationsoftware。

如图5所示，CMG2-HSA(图5A)、sCMG2(图5B)与PA的亲和 力分别为3.9nmol/L和1.915nmol/L，尽管从绝对数值上看CMG2-HSA较 sCMG2略有降低，但仍处在较高亲和力水平，可达到nmol/L级别。

实施例3.CMG2-HSA在大鼠体内的代谢情况

采用雄性SD大鼠2只(190-210g，SCXK(京)2012-0001)，通过 尾静脉注射经PBS稀释的CMG2-HSA100μg。在注射前以及注射后的不 同时间点采血至注射后6天，共采血8次。样品收集在用肝素处理的EP 管中置于冰上，于4℃，4000×g离心15分钟，分离血浆，-20℃冻存待 用。采用双抗夹心ELISA法测样品中CMG2-HSA的含量，以此推算出 CMG2-HSA在体内的消除半衰期，PBS包被4μg/mL的anti-HSA单抗 (lifespanbiosciences，LS-C51816)于4℃过夜，次日用PBST(含0.2％ 吐温-20)洗涤4次，每次5分钟；然后2％BSA于37℃封闭1h，重复洗 涤步骤；按照5％体积的比例向96孔板中加入稀释后的待测样品，37℃ 孵育1h，重复洗涤步骤；按照1：100的浓度加入CMG2多抗，37℃孵 育1h，洗涤；加入1：10000稀释的HRP-anti-Rabbit(CST,#7074)37℃ 孵育1h后加入TMB(solarbio)单组份显色液显色，在450/630nm下读 取OD值。

如图6所示，纵坐标表示测得的PA浓度取以2为底的对数值，横坐 标为时间。

表2.CMG2-HSA在大鼠体内的半衰期

表2中斜率负倒数即为CMG2-HSA在大鼠体内的消除半衰期(min)，显 示出CMG2-HSA体内半衰期较sCMG2增加了近20倍。

实施例4：作为类受体的融合蛋白CMG2-HSAIC₅₀的测定

炭疽保护性抗原(PA)和致死因子(LF)可形成炭疽致死毒素，对 小鼠巨噬细胞J774A.1产生致死效应。类受体能够通过结合PA从而阻断 炭疽致死毒素发挥保护细胞的作用。噻唑蓝(MTT)可被活细胞线粒体 中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝色结晶，并沉积在细胞中，而死 细胞无此功能，因此可通过蓝色反应来测定类受体IC₅₀。

实验前一天以3.5×10⁴/孔的密度,100μL/孔铺至96孔细胞培养板中 (培养基为10％FBS的MEM培养基)，孵育17-19h(36.5±0.5℃，5％CO₂)， 次日弃培养基，加入含有炭疽致死毒素(rPA+rLF，本实验室制备，终浓 度50ng/mL和40ng/mL)和CMG2-HSA融合蛋白(经过一系列浓度梯度 稀释)的含2％FBS的MEM培养基。37℃培养箱培养4h(观察到仅加炭 疽致死毒素的孔内细胞基本死亡)，每孔加入25μLMTT(Merck)工作 液(5mg/mL)，继续孵育1h(36.5℃±0.5℃，5％CO₂)。弃去上述细胞孔 中液体，每孔加入100μLMTT溶解液，室温放置15min。酶标仪上于 570nm/630nm读数，以sCMG2和CMG2-Fc(sCMG2与hIgG1Fc的融合 蛋白)作为对照(见图7)。

结果显示CMG2-HSA、sCMG2、CMG2-Fc的IC₅₀分别为1.82nmol/L、 2.03nmol/L、1.44nmol/L，三者之间没有显著性差异，反映出CMG2-HSA 保持了sCMG2和CMG2-Fc在细胞模型上较好的生物学活性。

实施例5：体内毒素攻击试验

为了验证CMG2-HSA在动物体内的保护效果，采用雄性Fisher344 大鼠(200-220g/只，维通利华)，将混合不同类受体，不同摩尔浓度的 LeTx(10μgrPA+5μgrLF)通过尾静脉注射，观察实验动物死亡情况，详 细数据见表3和图8。结果显示，LeTx(生理盐水组)和HSA-IFN(HSA 融合蛋白阴性对照组)动物均在80-90分钟左右死亡；在继续观察至96h 后，注射CMG2-HSA的两个实验组实验动物均存活，注射sCMG2组只 有2:1组的动物存活，其余各组实验动物均死亡。CMG2-Fc组与文献报 道类似，两组的平均存活时间为46.50小时和12.37小时，最终并不能够 保护实验动物，这一结果也显示CMG2-HSA在延长了类受体体内半衰期 的同时具有很好的体内活性，能够完全保护实验动物。

表3.体内毒素攻击试验结果

1.(log-rankMantel-Cox方法)