诊断抑郁症和监控治疗效果的新的诊断方法

摘要

本发明涉及用于诊断情感障碍、优选抑郁症，或监控所述情感障碍的疗法的效果的新的生物标记物和新的成套生物标记物。

说明书

技术领域

本发明涉及诊断学领域，更具体涉及通过测定一套神经病标记物进行感情障碍的诊断，更具体进行抑郁症的诊断。本发明进一步涉及一种监控抗抑郁疗法的效果的方法，其中抗抑郁疗法为药物疗法、心理疗法或两者的组合。

背景技术

情感障碍常常被称为感情障碍，因为感情是内在感受到的情感或情绪的外在表现。情感障碍被定义为组合成综合征的多种症状的混合症。这些综合征是为美国精神病学协会(AmericanPsychiatricAssociation)的精神障碍诊断与统计(DiagnosticandStatisticalManualofMentalDisorders，DSM)撰写精神障碍的疾病分类学的委员会的共识声明(表1)。

在临床实践和临床研究中的诊断都基于这些套具体的病症和症状。这些标准帮助区分不同的情感障碍，而这些不同的情感障碍可能具有不同的起因并且确实需要不同的临床管理。因为单次发作或反复发作，最常见且容易识别的情感障碍是重性抑郁症。情绪恶劣是严重程度较小，但常常是持续时间更长形式的抑郁，即持续超过两年并且常常是不间断的。另一种类型的情感障碍是双相疾病(bipolardisease)，双相疾病的特点是除了抑郁之外，还出现躁狂发作。

尽管这是研究的活跃领域，但是针对抑郁症还没有能确定诊断的标记物(DuffyA.,2000,Can.J.Psychiatr.,45:340-348)。

^*适应性改写自《精神障碍的诊断与统计手册(DiagnositicandStatisticalManualofMentaldisorder)》(第4版)³

与没有这样的疾病的同事相比，患抑郁病的工作人员在疾病之前的一个月中，病假数量增加了3倍，从而表明抑郁障碍与糟糕的工作效率相关联(Parikh,S.V.etal.,1996,J.Affect.Disord.38:57-65；Kessler,R.C.etal.,1999,HealthAff.18:163-171)。

抑郁疾病还影响家庭成员和照顾者(Denihan,A.etal.,1998,Int.J.Geriatr.Psychiatr.13:691-694)，并且越来越多的证据表明患抑郁症女性的孩子在学校内及行为上出现问题的比率增加，并且社交能力和自尊心比他们的同学(这些同学的母亲没有抑郁症)低(Goodman,S.H.andGotlib,I.H.,1999,Psychol.Rev.106:458-490)。抑郁症是在18岁至44岁的人中引起残疾和早逝的主要原因，并且预期到2020年之前，将成为在所有年龄段的人中引起残疾的第二主要原因(Murray,C.J.andLopez,A.D.,1997,TheLancet349:1498-1504；Gredon,J.F.,2001,J.Clin.Psychiatr.62:26-31)。

抑郁性疾病还示出与心血管疾病的死亡和残疾比率增加相关(例如Pratt,L.A.etal.,1996,Circulation94:3123-3129,Bush,D.E.etal.,2001,Am.J.Cardiol.88:337-341)。在没有心脏病史的1551位研究受试者(跟踪13年)中，急性心肌梗死的优势比(oddsratio)在具有重性抑郁发作的受试者中比在没有抑郁发作的人中高4.5倍。在因为急性心肌梗死连续不断地入院的患者中，使用标准的抑郁量表测量他们的情感，发现即使具有抑郁症的最小症状的患者也表现出，在他们发生心肌梗死之后和接下来的4个月中出现死亡的较高的后续风险。这种风险不依赖于其它的主要风险因素(包括年龄、心室射血分数和糖尿病的存在)。

令人惊奇地是，对于这样的常见疾病，却对年龄和发作之间的联系上几乎没有共识。这是因为如下事实：研究受阻于没有针对诊断标准组的清楚且普遍共识；以及，很多研究包括已经处于医疗保健体系中的患者这一事实。公知的是，很多满足抑郁症的诊断标准的人并不寻去治疗。

除了它的高患病率之外，所有患抑郁症的患者中仅三分之一接受足够的治疗(Judd,L.L.etal.,1996,Am.J.Psychiatry153:1411-1417)。下面是4种常见的临床错误，导致与抑郁障碍相关的诊断或治疗失败：

询问不充分。尽管基于其患病率应是怀疑的高指数，但当没有询问患者可能引发情感障碍的症状的问题时，会出现诊断失败。记忆性“SIGECAPS”(睡眠、兴趣、内疚、活力、专注力、食欲、心理运动、自杀)(表1)可能是有用的临床辅助物(即，针对重性抑郁症的4种或更多的SIGECAPS，针对情绪恶劣的2种或3种SIGECAPS)。

咨询家庭成员失败。由于与该疾病相关的认知扭曲，患者最小化或夸大他们的症状是不寻常的。因此，在对其实践相对新的患者中，在没有从亲属(诸如配偶或父母)获得附加信息的情况下，作出(或排除)抑郁症的诊断的风险很大。

尽管缺乏诊断标准(例如，在仅存在“抑郁情感”且没有伴随的精神和身体症状[即SIGECAPS]时，开始治疗抑郁症)，但接受情感障碍的诊断。

排除抑郁症的诊断或开始治疗抑郁症失败，尽管有相关的症状复合体(例如，“当然你是抑郁的。如果这些事件存在于他们的生活中，谁不会是抑郁的？”换句话说，“解释”诊断，而不是考虑治疗选择)。

这些临床错误，与精神状况相关的羞耻感(stigma)相结合(Sirey,J.A.etal.,2001,Psychiatr.Serv.52:1615-1620)，导致未能对重性情感障碍作出全面性诊断。

目前，在心理疗法领域中的另一主要假说是：识别和治疗单相抑郁症和双相抑郁症，较长时间地减轻所有症状，这样可防止疾病发展成更困难的状态，从而强调了早期识别情感障碍亚型是非常重要的。

将所有这些数据合起来，清楚得知，存在如下的重要需求：对抑郁症的可靠诊断，或可在SIGECAPS标准的基础上证实诊断的测定法。

发明内容

如上所述，很多因素似乎在情感障碍的发展中起作用或有助于情感障碍的发展，该情感障碍特别是抑郁症，更具体是重性抑郁障碍(MDD)。本发明现在存在于对诊断和监控抑郁症的生物标记物组进行选择，其中，该组包括对于它们在抑郁症的个体发生中起的(假定)作用互补的生物标记物，从而反映了上述抑郁症的不同假说。

在本发明的组中，可包括反映下组的标记物：

-反映矿物质体内平衡假说的标记物：PTH、AVP及其受体(V1a、V1b)、cAMP、地高辛、TRPM7、TRPM6、RACK-1、17β雌二醇、REA、端粒酶、P物质及其受体NK1、EGF及其受体ERBB1-4、醛固酮及其受体(MRC)，和已知影响醛固酮排泄的所有物质，如血管紧张素I和II及它们的受体(AT1、AT2)、ACTH及其受体(MC2)、钾和凝乳酶。

-反映内皮素功能障碍和氧化应激的标记物，选自：oxLDL及其受体LOX-1、F2-异前列腺素、硝基酪氨酸、内皮素-1及其受体(Eta、ETb)、弹性蛋白/锁链素。

-反映紧密连接&肠漏假说的标记物：连蛋白和闭锁小带毒素(zot)；LIGHT和淋巴毒素β受体(LTβR)。

-反映促炎性假说的标记物，选自：所有磷脂酶A2酶、PAF/PLAF；和，花生四烯酸以及双高-γ-亚麻酸途径的所有下游组分，如但并不限于PGA2、PGE2及其受体、凝血噁烷(Tromboxane)B2及其受体TP、环前列腺素、PGF2和PGD2；下游5-HPETE和其它HPETE衍生物，如但并不限于5-HETE、LTB4及其受体(BLT1、BLT2等)、LTC4、LTD4LTE4；1型半胱氨酰白细胞三烯受体、脂氧素(LXA4、LXB4)、脂氧素A4受体、PGE1、PGA1、PGH_1-15OH三烯。

-反映免疫-炎症假说的标记物，选自：脂质运载蛋白-2、TNFα、TNFβ、1+2型TNFα受体、HVEM、钙卫蛋白、il-6及其受体、il-1及其受体、髓过氧化物酶、半乳糖凝集素-8和新蝶呤。

-反映神经发生假说的标记物，选自：BDNF及其受体TrkB和LNGFR、中期因子及其受体RPTPζ、bFGF及其受体HVEM和PEDF。

-反映能量状态(的变化)的标记物：瘦素及其受体(LEP-R)、脂联素及其受体(ADIPOR1、ADIPOR2和CDH13)。

-其它标记物，选自：维生素D及其受体(VDR)、皮质醇及其受体(GCR)、膜联蛋白-1、孕烯醇酮及其受体(GCR)、活化素/抑制素及其受体、GABA、VILIP-1、神经肽Y、MMP-1、BCL-2、钙网蛋白、cGMP，和来自NO-cGMP途径的化合物，包括已知影响cGMP的排泄的所有试剂，如心房钠尿肽、脑钠尿肽和c型钠尿肽；血管活性肠肽和降钙素基因相关肽、一氧化氮合成酶(内皮NOS、eNOS，神经元NOS、nNOS)和l-精氨酸。

根据本发明，可用于在测定中诊断感情障碍，优选MDD、双相抑郁症或焦虑症的一套标记物可以是选自上述组中的两种标记物的一套，这一套可补充有来自上述组的任意标记物。对于在尿液中的测试，优选一套两种标记物选自包括如下32种标记物的组：活化素、cAMP、醛固酮、地高辛、脂质运载蛋白、新蝶呤、LTB4、TNFα受体2、HVEM、PGE2、凝血噁烷B2、LOX-1、硝基酪氨酸、F2-异前列腺素、中期因子、IGF、内皮素-1、c-GMP、GABA、维生素D、皮质醇、孕烯醇酮、P物质、EGF、钙卫蛋白、瘦素、髓过氧化物酶、神经肽Y、CCK、sVEGFR1、AVP和脂联素。对于在血清中的测试，优选一套两种标记物选自包括如下38种标记物的组：活化素、cAMP、醛固酮、脂质运载蛋白、TNFα受体2、HVEM、半乳糖凝集素-8、PGE2、凝血噁烷B2、LOX-1、硝基酪氨酸、F2-异前列腺素、BDNF、PEDF、中期因子、内皮素-1、c-GMP、GABA、维生素D、孕烯醇酮、P物质、EGF、连蛋白、钙卫蛋白、VILIP、瘦素、AVP(加压素)、神经肽Y、MMP-1、bFGF、地高辛、BCL-2、钙网蛋白、髓过氧化物酶、LTB4、PLAF、sVEGFR1和脂联素。

相应地，本发明包括一种诊断情感障碍的方法，包括：

采集受试者的体液样品；

测量所述样品中一种或多种上述生物标记物的含量；以及

将测量的浓度与在对照受试者中的一种或多种生物标记物的浓度进行对比；以及

如果所述浓度偏离对照健康受试者中的浓度，则诊断为情感障碍。

优选地，所述情感障碍选自抑郁症、精神分裂症、精神病(psychosis)和焦虑症，更优选所述情感障碍是抑郁症，选自精神抑郁症、内源性抑郁症、反应性抑郁症、轻度抑郁症、重性抑郁症、精神病性抑郁症、神经性抑郁症、单相抑郁症和双相抑郁，最优选重性抑郁症。

进一步地，本发明包括一种确定抗抑郁疗法(antidepressanttherapy)(药物疗法、心理疗法或两者的组合)在受试者中的影响的方法，包括：

采集受试者的体液样品，并且测量如本文所述的一种或多种生物标记物的含量；

在所述治疗的过程中，以规则间隔重复步骤a)；以及

记录体液中测量的一种或多种生物标记物的浓度上的所有差异。

另外，本发明包括一种监控受试者中的情感障碍的发展的方法，包括进行本发明的方法。进一步，本发明还涉及生物标记物组在诊断和监控情感障碍的发展中的应用，该情感障碍尤其是抑郁症，更具体是MDD。

附图说明

图1：ω-6&ω-3途径。

图2：细胞膜磷脂的代谢物。

图3：GLA、DGLA和AA途径。

图4、可用于血清样品的标记物列表和提出的几套标记物。

图5、可用于尿液样品的标记物列表和提出的几套标记物。

具体实施方式

重性抑郁障碍(MDD)被认为是异种且多因素的疾病。这暗示MDD的潜在病理可能相当不同，这与已经提出的相当大量不同的MDD假说一致。这些假说中的少数几个如下。

单胺假说

单胺能系统(血清素、去甲肾上腺素和多巴胺)的功能障碍可能与MDD具有因果关系(Ruheetal.,2007；Nuttetal.,2008)。根据单胺理论，MDD由受损的单胺能神经传递引起，导致细胞外去甲肾上腺素(NE)和/或血清素(5-HT)水平降低(Schildkraut,1965；Dorisetal.,1999)。已经证明，在脑脊液(etal.,1984)和抑郁患者死亡的脑组织(Cheethmanetal.,1989)中，血清素及其代谢物浓度的减少。

还有一些报道，称在脑(Arangoetal.,1992)和血小板(Bakishetal.,1997)中都存在改变的血小板5-HT转运蛋白的功能(Nemeroffetal.,1994)和改变的5-HT₂受体功能。调查患MDD的患者的脑脊液、血液或尿液中的NE和5-HT的研究，以及死亡研究似乎支持MDD的单胺假说(BelmakerandAgam,2008；PryorandSulser,1991)。也已经报道了MDD与编码酶单胺氧化酶A(MAO-A)的基因中功能多态性的关系(ChenandRidd,1999；Fanetal.,2010)，该单胺氧化酶A(MAO-A)降解脑中的单胺(WildandBenzel,1994WildandBenzel,1994)。但是，在过去的二十年中，调查已经揭示了单胺假说的几种限制(Hirschfeldetal,2000)，因此渗入研究没能发现令人信服的证据来证明患MDD的患者中的一种具体单胺系统的原发性功能障碍(Delgadoetal,2000)。可争辩的是，单胺系统自身不是功能障碍的，但是它们可能在需要增加神经递质的可用性的特定条件下受到挑战，例如在炎症和慢性应激过程中。

矿物质体内平衡假说

当需要一方面维持骨基质密度的内平衡并且另一方面维持血钙和磷酸盐离子水平的能力时，通过调整复杂的负反馈过程，矿物质被释放到血液中，从而调节矿物质从消化道的吸收、骨骼系统中的矿物质沉淀/溶解以及通过肾脏进行的矿物质排泄；矿物质体内平衡的内分泌控制通过来自甲状旁腺的甲状旁腺激素(PTH)和来自甲状腺的(甲)降钙素的对抗性相互作用来实现，甲状旁腺激素(PTH)倾向于通过刺激破骨细胞增加血钙水平，(甲)降钙素倾向于通过抑制破骨细胞减少血钙水平。已经示出，抑郁状态与具有减少的血清25(OH)D水平和增加的血清PTH水平的严重性的关系。血清PTH水平与尿液cAMP浓度密切相关(Lukert,1976)。

急性应激导致儿茶酚胺和皮质醇增加，这导致在细胞内水平上，镁离子与钙离子交换增加。

在培养细胞中的研究已经示出，细胞内的钙可受到很多神经递质的受体和其它神经活性物质的控制，也可能受到阿片样物质的内源性配体和苯二氮受体的控制(Verkhratskyetal.,1998)，其中该其它神经活性物质诸如谷氨酸盐、ATP、肾上腺素、去甲肾上腺素、GABA、乙酰胆碱、组胺、P物质、缓激肽、内皮素、血清素、催产素、精氨酸-加压素、神经肽Y、补体片段、血小板活化因子、前列腺素、血管紧张素II、凝血酶。在大部分真核细胞中，增加细胞cAMP的激素或试剂引发Mg²⁺被显著挤出到细胞外空间或循环中(vormanandgunther,1987；Romaniandscarpa,1990a；Romaniandscarpa,1990b)。在所有的细胞模型中，Mg²⁺的挤出是快速过程，从施加刺激物开始最长8分钟内实现。令人惊奇的是，我们证明了情感障碍与血液和尿液中增加的cAMP浓度有关。

镁离子经由通道或通道样机制进入和离开细胞。

TRPM7(Nadleretal.,2001)和TRPM6(Schlingmannetal.,2002)是首先被鉴定为能将Mg²⁺转运至哺乳动物细胞内的通道。

TRPM7在神经元功能中起到重要的功能作用，并且增加了在缺氧或缺血再灌注条件下的存活率。由于它的转运Ca²⁺或Mg²⁺的能力，TRPM7显示出在渗透阳离子基础上的自相矛盾的作用。在通过活性氧/氮类活化和持久的氧和葡萄糖剥夺之后，TRPM7有利于Ca²⁺的流动，从而产生对神经元有毒的事件(Aartsetal.2003)。相反，通道的Mg²⁺渗入增强了抗凋亡和细胞存活基质，防止神经元的缺氧死亡(Clarketal.2006)。TRPM7在检测细胞外二价阳离子中的重要作用受到Weietal.,(2007)的最近的研究的支持，该研究指出通过低细胞外二价阳离子而发生通道的活化对于细胞是致死的。同时，Jiangetal.,(2008)报道了大脑中动脉闭塞1小时增强TRPM7在身体同侧的海马中的表达，并对神经元造成损伤。通过使用神经生长因子，经由TrkA途径活化进行预处理，大大抵消TRPM7的表达增加及其结果。最近，施加5-脂氧合酶抑制剂可阻断TRPM7流，而不会影响蛋白表达和细胞膜浓度，从而实际上防止了细胞死亡(Chenetal.,2010)。

TRPM6

TRPM6通道独特定位在结肠和肾脏远曲小管中，双上皮否则对盐重吸收高度具有不可渗透性，突出了该通道在控制肠道Mg²⁺吸收和肾脏Mg2+再吸收，并且随后有助于全身Mg2+的体内平衡中的特定作用。这界定了Mg²⁺-可渗透性通道，它的活性受到细胞内Mg²⁺浓度([Mg²⁺]_i)的强有力地调节。TRPM6的表达受到饮食Mg²⁺的调节，而TRPM7不受影响，这支持了TRPM6在经上皮的Mg²⁺转运中起到重要作用的观点。雌激素(17B-雌二醇)已知上调结肠和肾脏中的TRPM6的mRNA。

除了它的转录效果(Caoetal.,2009)之外，雌激素还经由对Mg²⁺体内平衡的快速途径起作用，可这可解释情感障碍在女性中的发生率较高。进一步，TRPM6通道的活性受到细胞传导分子，如RACK-1(Caoetal.,2008)，雌激素受体活性(REA)的抑制因子和已知是自分泌/旁分泌磁性同型(magnesiotropic)激素的EGF的调整(Groenestegeetal.2007)。

Ca²⁺/Mg²⁺平衡受到很多激素和刺激物的调节，但是这种机制不太可能在急性应激条件下起重要作用，其中细胞机制仍然能够维持适当的电解质平衡，因此也能维持Mg-ATP完整性。但是，在慢性应激过程中，细胞内的镁可能变得极低，因此危及稳定ATP的能力，同时循环中钙水平的短暂减少和镁的增加将刺激甲状旁腺，通过活化钙敏感受体，以增加PTH的产生。PTH水平的增加刺激钙离子被肾脏再回收，而且还刺激钙和磷酸盐离子被骨组织中的破骨细胞再吸收进入循环中。细胞内ATP(能量)的缺乏与钙超载可威胁到中枢和外周的适当的细胞功能。后者得到MDD与骨质疏松症的强关联的支持。这进一步激起钙离子流入到细胞中，这与HCO₃^-离子(很可能通过细胞水平上的Cl^-/HCO₃交换机制)组合将最终导致钙化，从而导致外周和CNS细胞的凋亡。

如通过锂离子在MMD中的情感稳定功效所证明的，电解质平衡的交换(通过Li⁺情况中的IP3)对脑功能具有重要作用。在患MDD的患者中的研究已经示出，脑脊液(CSF)中Ca²⁺/Mg²⁺比率增加(Levineetal.,1999)。此外，抑郁患者的死后研究已经示出，脑组织中的Mg²⁺浓度降低(Nowaketal.,2010)。之前示出，cAMP在血浆和脑脊液中的基线水平(Belmakeretal1980；Postetal1982；Majetal1984)在各种情感状态中没有改变。

磷光核磁共振光谱(NMR)已经证明，Mg²⁺浓度在抑郁患者中降低，对SSRI治疗有抵抗力(Iosifescuetal.,2005)。在海马突触体中，蛋白激酶C(PKC)的活化通过Mg²⁺消除对NMDA依赖的离子通道的阻断，而不改变膜电位(Pittalugaetal.,2000)。相应的，PKC激动剂的细胞内给药加强了在培养的海马神经元中的NMDA受体的功能(Xiongetal.,1998)。这可产生前馈周期；NMDA依赖的Ca²⁺流可增加PKC活性，从而使NMDA依赖的离子流的Mg²⁺阻断的进一步释放。Mg²⁺对PKC功能也具有直接影响。PKC的催化亚基需要Mg²⁺作为辅助因子(HannunandBell,1990)，并且PKC通过三磷酸腺苷(ATP)的失活依赖于Mg²⁺的存在(Wolfetal.,1985)。除了通过NMDA受体影响谷氨酸盐的神经传递之外，Mg²⁺缺失还经由非NMDA受体介导的Ca²⁺流影响海马的兴奋性，该非NMDA受体介导的Ca²⁺流可被Ca²⁺通道阻断剂维拉帕米(verapamil)抑制(Pohletal.,1992；Waldenetal.,1992)。在正常条件下，NMDA受体仅允许神经元功能所需的量的Ca²⁺进入，但是具有因不足的Mg²⁺所引起的不适当的功能，例如Ca²⁺的流入将增加超过可处理的水平,从而生成有毒的活性氧类(ROS)和有毒量的氧化氮(NO)自由基(Blaylock,1999；Mark,2001；Carafoli,2005)。Mg缺失已知与P物质增加和骨质疏松症相关(RudeRK,2009)。我们证明了，情感障碍与血液中增加的P物质浓度有关，并且令人惊奇证明了也与尿液中增加的P物质浓度有关。雌激素、(REA)、EGF和RACK-1可用作情感障碍的生物标记物。

进一步的，镁缺失已知与衰老有关，这意味着端粒酶可能起到镁缺失的分子标记物的作用。

其它矿物质以类似的方式受到内分泌负反馈系统的调节，如钠和钾离子水平受到肾上腺皮质类固醇激素醛固酮的调节。

醛固酮，一种由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，是控制钠和钾平衡的基本盐皮质激素(Rogerson,2000；Agarwal,1999)。醛固酮的主要作用是促进穿越多种上皮组织、唾腺、肠、汗腺和肾脏进行单向盐再吸收。在肾上腺皮质的球状带(zonaglomerulos)中，从胆固醇合成醛固酮。醛固酮的分泌使复杂的，受到激素和电解质两者的影响。但是，肾素-血管紧张素系统(RAS)是醛固酮分泌的主要调节者(Lumbers,1999)，血管紧张素II和钾通过增加激素的合成率而刺激醛固酮的分泌。血管紧张素转化酶(ACE)已经被重复讨论为重性抑郁症(MD)及MD与心血管障碍之间的双相联系的敏感性因子(Zill,2012)。较少的调节因子包括来自垂体的促肾上腺皮质激素(ACTH)、来自心脏的心房钠尿肽和多巴胺的局部肾上腺分泌。我们证明了，情感障碍与血液以及尿液中的增加的醛固酮和地高辛浓度有关。

氧化应激&内皮素功能障碍假说

重性抑郁症已经示出伴随有增加的氧化应激和快速过氧化反应。血浆的过氧化物和血清的氧化LDL(oxLDL)的抗体已知与重性抑郁症有关。(Maes,2010)。动脉粥样硬化和抑郁症以已知是相关的(Jones,2003；Wiiteman,2004；Hamer,2010)。

在动脉粥样硬化的发病机理中，由氧化的LDL(oxLDL)引起的内皮损伤、活化和功能障碍经由外源凝集素样氧化的低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)的活化发挥影响。LOX-1，最初被鉴定为内皮细胞中的oxLDL的主要受体，还可表达在巨噬细胞和平滑肌细胞(SMC)中。一旦出现内皮功能障碍，就确定了动脉粥样硬化的阶段。LOX-1可在起始和加强该关键的第一步骤中起作用.

在高胆固醇血症、高血压和糖尿病的病症中，疾病阐明了促使血管损伤，LOX-1在血管中是高表达的。

LOX-1的表达的诱导由血管紧张素II和内皮素-1(两者都是NO的拮抗物)介导。随着LOX-1在内皮上的水平升高，增加量的oxLDL可被内吞，是进一步增强LOX-1表达的活性。oxLDL通过LOX-1还增加了血管紧张素转化酶的表达，并且降低了NO的细胞内浓度。除了是oxLDL的主要受体之外，LOX-1还具有结合受损或凋亡的细胞、活化的血小板、晚期糖基化终产物和致病生物的能力。一旦被结合，这些配体可被内吞或吞噬到细胞内。在生理条件下，LOX-1可在宿主防御中起作用，或用于清除细胞碎片。但是，在病理状态下，LOX-1可参与结合使内皮活化的促动脉粥样硬化的物质，诸如oxLDL。因为具有与诱导炎症和内皮活化的产物结合的能力，在初始和晚期的动脉粥样硬化病灶中观察到升高的LOX-1表达是不奇怪的。一旦出现内皮功能障碍，就确定了动脉粥样硬化的阶段。在高胆固醇血症、高血压和糖尿病的病症(都已知与情感障碍相关)中，疾病阐明了促使血管损伤，LOX-1在血管中是高表达的。LOX-1表达的诱导由血管紧张素II和内皮素-1(两者都是NO的拮抗物)介导。随着LOX-1在内皮上的水平升高，增加量的oxLDL可被内吞，是进一步增强LOX-1表达的活性。oxLDL通过LOX-1还增加了血管紧张素转化酶的表达，并且降低了NO的细胞内浓度。因此，LOX-1活性扩大了内皮功能障碍的程度。但是，由LOX-1提升的oxLDL还介导内皮细胞凋亡，可能经由核因子(NF)B的活化。这可能产生直接的脉管剥蚀和损害，可能触发或增强现存的炎症反应(Szmitko,2003)。

我们证明了，情感障碍与血液以及尿液中的增加的内皮素-1、F2-异前列腺素、LOX-1和硝基酪氨酸浓度有关。

紧密连接假说

肠粘膜的功能障碍已经暗示在抑郁症的炎症病理生理学上起作用，该肠粘膜的功能障碍特征是革兰氏阴性细菌的转位增加(肠漏症)。暗示增加的LPS转位可发动免疫应答，从而在一些患MDD的患者中使炎性应答系统活化，并且可诱导特异的“疾病行为”症状(Maes,2008；Painsipp,2011)。T细胞来源的LIGHT已知活化上皮LTβR，以破坏屏障功能(BradT.etal.2007)。进一步，发现具有最近发作精神病且具有多发作性精神分裂症的个体(具有针对麦胶蛋白的增加的抗体)可共同具有乳糜泻的一些免疫学特征,但是他们对麦胶蛋白(gliadin)的免疫应答与乳糜泻的不同(Dickerson,2010)。麦胶蛋白与CXCR3结合，导致MyD88依赖的连蛋白释放和肠通透性增加(Lammers,2008)。我们首次证明了，连蛋白血清浓度与情感障碍相关。

连蛋白(zonulin)

细胞间的紧密连接是动态结构，参与水和电解质穿过肠上皮的细胞膜和脑血屏障的矢量运输。来源于霍乱弧菌(Vibriocholerae)的闭锁小带毒素与特定的肠上皮表面受体相互作用，随后激活调节紧密连接的通透性的复杂的细胞内级联事件。连蛋白可能在发育、生理和病理过程中的紧密连接的调节中起关键作用，其中发育、生理和病理过程包括组织形态发生，肠腔和小间隙之间的流体、大分子和白血球的移动，和炎性/自身免疫性障碍。

促炎性假说

在过去的150年中，西方群体的快速扩张已经与饮食的变化相关，其中来自鱼、野味和植物的ω-3多不饱和脂肪酸被替代成来自家畜的饱和脂肪和来自普通植物油(玉米、红花和大豆)和其它来源的ω-6多不饱和脂肪酸。这些变化已经导致普通饮食中的ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比率从1:1增加至高于10:1(4,5)。这已经导致在大部分组织中的细胞膜中，具有高比例的普通ω-6脂肪酸花生四烯酸，而不是EPA。如在图1中所示，花生四烯酸的增加还因为与代谢酶竞争而影响EPA和DHA的产生。AA/EPA比率可用作情感障碍的生物标记物。

ω-3脂肪酸(EPA)对于重性抑郁症和双相抑郁症的抗抑郁功效已经得到了很好的证明(Pao-YenLin,2007)。两种ω-3脂肪酸，EPA和DHA，与花生四烯酸竞争并入到膜磷脂中。磷脂酶A2是催化水解释放花生四烯酸和溶血磷脂的键的酶。磷脂酶A2包括几种具有普通酶活性的蛋白家族。两种最著名的家族是CA²⁺依赖的分泌和胞浆磷脂酶A2。

其它家族包括不依赖于Ca²⁺的PLA2(iPLA2)和脂蛋白相关联的PLA2(lp-PLA2)，还已知为血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)。增加的PLA2活性和PLA2-生成的介导因子已知在脑中的急性炎性应答中和在与神经关联的氧化应激中起到主要作用(Faraooqui,2006)。磷脂酶A2和COX-2基因还通过调节多不饱和脂肪酸的水平，增加了IFN-α诱导的抑郁症的风险(SuKP,HuangSY,2010)。通过降低磷脂酶A2、血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸(细胞膜上的AA水平)、前列腺素E2(PGE2)和LTB4合成，EPA在平衡免疫功能和生理健康中是重要的。(JoelM.Kremer,1996)。我们还证明了PLA2和情感障碍的相关性。

在“矿物质体内平衡”部分中解释的细胞钙超载解释激活PLA2酶，以从细胞膜释放花生四烯酸(AA)。因此，增加量的AA经由环氧酶和5-脂氧合酶(lopoxygenase)被转化成类二十烷酸代谢物。最重要的都示于图2中。

这导致前列腺素、凝血噁烷和白细胞三烯的增加。这些促炎性的类二十烷酸全部与抑郁症相关联(Linnoilaetal.,1983；Calabreseetal.,1986；Ohishietal.,1998；Nishinoetal.,1989；Songetal.,1998)。我们还证明了，情感障碍与血液以及尿液中增加的PGE2、LTB4和凝血噁烷B2的浓度有关。

EPA与花生四烯酸竞争环加氧酶系统(如图1中所示)，抑制来源于花生四烯酸(例如前列腺素、白细胞三烯和凝血噁烷)的促炎性类二十烷酸的产生，其中花生四烯酸已经与抑郁症相关联。

DHA和EPA还抑制促炎性细胞因子，诸如白介素-1β、白介素-2、白介素-6、干扰素-γ和肿瘤坏死因子α的释放(Guixiang,2007)，这依赖于类二十烷酸的释放，并且也与抑郁症相关联。进一步的，ω-3脂肪酸影响脑来源的神经营养因子，这激发突触可塑性、提供神经保护、增强神经传递并且具有抗抑郁效果(Ikemoto,2000)。

基于其代谢物的AA、DGLA和所有环氧酶&5-脂氧合酶可用作抗炎性&促炎性疾病状态的生物标记物。对应的途径示于图3中。

DGLA及其代谢物是：

-系列-1，凝血噁烷(具有1个双键的凝血噁烷)，经由COX-1和COX-2途径。

-系列-1，前列腺素，经由COX-1和COX-2途径。(Yang-li,1998)

-阻断花生四烯酸向白细胞三烯的转化的15-羟基衍生物(Belch,2006)。

DGLA及其代谢物的效果是抗炎性。这与花生四烯酸(AA)的类似代谢物形成鲜明对比，花生四烯酸(AA)的类似代谢物是系列-2的凝血噁烷和前列腺素以及系列-4的白细胞三烯。除了产生抗炎性的类二十烷酸之外，DGLA与AA竞争COX和脂氧合酶，抑制AA的类二十烷酸的产生。

另一代谢物是脂氧素。脂氧素是一系列抗炎性介导因子。脂氧素是短暂的内源性产生的非经典类二十烷酸，它在炎性中出现标志炎症消退。

它们的缩写是LX，是脂氧合酶(LO)相互作用的产物的首字母缩略词。目前已经鉴定出两种脂氧素；脂氧素A₄(LXA₄)和脂氧素B₄(LXB₄)。脂氧素以及特定的肽具有脂氧素A₄受体(LXA4R)的高亲和性配体，其中脂氧素A₄受体(LXA4R)是基于与甲酰化肽受体样受体(FPRL1)的序列同源性首先被鉴定出来的。通过LXA4R的脂氧素信号传导抑制趋化性、移行(transmigration)、超氧化物生成和NF-κB活化。与白细胞三烯类似，LXA₄将形成半胱氨酰-脂氧素LXC₄、LXD₄和LXE₄。在次纳摩尔(subnanomolar)浓度上，LXA₄和LXB₄抑制白细胞三烯刺激的人嗜中性粒细胞和内皮细胞之间的相互作用。

免疫-炎症假说

在过去的二十年中，精神病学研究中的新进展已经产生了如下假说：炎性过程和神经-免疫相互作用参与重性抑郁症的发病机理中，并且这些可能成为频繁观察到的MDD中一些血清素能性和肾上腺皮质相关性的基础。抑郁症的该单核细胞-T-淋巴细胞或细胞因子假说(Maes1993,1995a,1995b,1999；Schiepersetal.,2005)暗示起神经调质作用的促炎性细胞因子，诸如白介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ，代表了抑郁障碍的行为、神经内分泌和神经化学特征的(中枢)介导中的关键因子(Schiepersetal.,2005)。

细胞因子的中枢作用还可引起在抑郁障碍中频繁观察到的HPA-轴活动过度(hyperactivity)，因为促炎性细胞因子可通过干扰HPA轴上循环的皮质类固醇的负反馈抑制，导致HPA-轴活动过度(vanWestandMaes,1999；Leonard,2001；Schiepersetal.,2005；Maesetal.,2008；Maes,2010)。另一联系可经由TNF-α核皮质醇，两者都影响T-淋巴细胞中转录因子cAMP应答元件结合蛋白(CREB)的磷酸化(Kochetal.,2009)。细胞因子还影响单胺能神经传递，即血清素、去甲肾上腺素和多巴胺(Linthorstetal.,1995,Meralietal.,1997,Paulietal.,1998andSongetal.,1999,2000；Lacostaetal.,2000)。

它们还可能通过活化TRP-代谢酶吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)降低色氨酸(TRP)的可用性。因此，通过细胞因子增加IDO的刺激可能导致血清TRP的缺失，这使5-HT合成显著降低((Heyesetal.,1992；StoneandDarlington,2002FullTextviaCrossRefViewRecordinScopusCitedByinScopus(177)StoneandDarlington,2002)，从而危及5-HT的神经传递。通过细胞因子的IDO的活化还可能导致神经毒性的犬尿氨酸和异喹啉的产生增加。MDD中的免疫活化的特征包括：免疫细胞活化的标记物的血清水平增加(例如新蝶呤、PGE2和可溶性IL-2受体)，C-反应性蛋白(CRP)的较高的血清浓度，以及促炎性细胞因子的释放增加，其中促炎性细胞因子诸如通过活化的巨噬细胞释放的IL-1、IL-2和IL-6，和通过活化的T细胞释放的IFN-γ(Maesetal.,1995a,b；Maes,1999；Irwin,1999；Nunesetal.,2002)。

与抑郁症的免疫-炎症假说一致，已经报道了在患抑郁症的患者中观察到的促炎性细胞因子IL-1和IL-6的血浆浓度增加与MDD的严重性和HPA轴活动过度的分量相关(Maes,1995,1999)。

神经发生和神经可塑性假说

在过去的十年中，越来越多的可靠证据已经暗示了在抑郁症的发病机理中的神经营养因子(Tanisetal.,2007)。图1概述了该假说基础的一些机制(Duman,R.S.etal.,1997,Arch.Gen.Psychiatry54:597-608；Manji,H.K.etal.,2000,Mol.Psychiatry5:578-593)。

压力(抑郁症的一个重要沉淀剂)已经反复示出降低脑中的神经发生和神经营养因子基因的表达(Duman,2004；Nibuyaetal.,1995)。相反，很多抗抑郁治疗刺激神经发生和神经营养因子基因的表达(Nibuyaetal.,1995；Malbergetal.,2000)。我们现在意识到，“长期”(即30天)抗抑郁治疗在脑的特定区域中产生环磷酸腺苷3-5-单磷酸盐(cAMP)的持续活化。蛋白激酶A(被cAMP刺激)磷酸化cAMP调节元件结合蛋白(CREB)。然后，该蛋白调节和激活特定的靶基因，包括编码脑来源的神经营养因子(BDNF)、刺激海马神经生长的神经保护因子的基因。

进一步的，抑郁患者示出在脑的边缘区域和皮质区域中细胞萎缩增加，这与减小的神经营养活性一致(DumanandMonteggia,2006)。与健康对照相比，患抑郁症的患者的MRI扫描已经揭示在脑结构中存在很多异常。尽管有一些矛盾，元分析(meta-analyses)已经示出清除的证据证明有较小的海马容量和增加数量的高度密集的病灶(Videbechetal,1997,2004)。进一步的，一系列脑成像研究一致地示出在背外侧前额叶皮层中具有降低的神经元活性，这与抑郁症的严重性共变(即，抑郁症越严重，前额叶缺失越大)(Drevets,W.C.,1998,Ann.Rev.Med.49:341-361)。因此，对抑郁障碍发展的更新的假说可假定，在基因易感的人中，压力诱导的易损性可诱导细胞内神经元基质的级联反应，增加或减小特定脑神经元的存活和功能所需的特定的神经营养因子。此外，抗抑郁剂、电惊厥疗法(VaidyaV.A.etal.,1999,Neuroscience89:157-166)和专注于抑郁症的心理疗法(Thase,M.E.,2001,Arch.Gen.Psychiatry58:651-652)积极影响神经生长和局部脑代谢。

脑室下区中的一小部分神经元干细胞能分裂，并且终生都可更新，并且能移动至具体参与记忆巩固的海马中。多数证据表明，神经元的突触可塑性和可更新性(神经发生)在抑郁症都受到损害，并且与记忆干扰(memorydisturbances)相关(REF)。还证明，有效的抗抑郁治疗对神经可塑性、神经发生和认知具有刺激效果。

在神经营养因子中，脑来源的神经营养因子(BDNF)与抑郁症的关系得到最广泛的研究。BDNF(“神经营养”家族的成员)示出促进背根神经节的神经元亚群的存活，并且随后从猪脑中纯化出BDNF(Barde,Y.A.etal.,1982,EMBOJ.1:549-533)。对BDNF的几个元分析的结果证实，在血清BDNF水平和抑郁状态以及成功的抗抑郁疗法之间存在显著相关性(Senetal.,2008；Bocchio-Chiavettoetal.,2010；Brunonietal.,2008)。最近的研究清楚证明，BDNF的血清水平在患MDD的患者中显著减少，并且抗抑郁剂治疗能够逆转这一效果，表明血清BDNF是MDD和成功治疗的潜在的生物标记物(Bocchio-Chiavettoetal.,2010；SchmidtandDuman2010；Dell'ossoetal.,2010；etal.,2010)。

重要的是，注意到血清中的BDNF水平受到各种决定因素的影响，诸如年龄、性别、吸烟状态、城市化等(Bus,B.etal.,2011,Psychoneuroendocrinol.36:228-239)。

其它参与MDD中的神经营养因子属于HVEM、PEDF和中期因子的组。

HVEM

神经元被树突来源的免疫细胞环绕。树突细胞存在于身体的所有组织中，并且具有支持和保护作用。脑中的树突细胞特化成小胶质细胞。小胶质细胞以与神经元大致相同的数量存在于脑中。小胶质细胞的保护功能是广泛的(抵抗神经元的过度刺激、毒素、感染剂)，并且还包括引导神经元之间的连接的适当形成。小胶质细胞对于神经发生和神经可塑性是必不可少的，并且不能被低估为MDD中的参与者(player)。树突细胞中的HVEM受体是TNF受体超家族的一部分(肿瘤坏死因子-受体)(DeTrez&Ware,2008)。TNF-R在压力之后、免疫活化之后被刺激，并且可引起促神经可塑性或抗神经可塑性的效果。

HVEM刺激在保护性和不利性应答之间的细胞“选择”中可起决定性作用。非常有趣的是，TNF-R的阻断要去依那西普(Etanercept)减轻了抑郁症状(Uguz,Akman,Kucuksarac,&Tufekci,2009)

PEDF

成体干细胞的特点是自我更新和多向分化，并且这些特性似乎受到来自邻近的分化细胞类型和细胞外基质分子的信号的调节，其中邻近的分化细胞类型和细胞外基质分子整体被定义为干细胞“巢”。自我更新对于干细胞的终生存留是必不可少的，但是对它的调节认识很少。在哺乳动物的脑中，神经发生在两个胚区(脑室下区(SVZ)和海马)中持续，其中出生后持续的神经元产生似乎受到神经干细胞(NSC)的支持。色素上皮来源的因子(PEDF)由鼠科的SVZ的组分分泌，并且在体外促进成体NSC的自我更新。此外，心室内PEDF输注缓慢地活化正在分裂的干细胞，而内源性PEDF的阻断减少了它们的周期(cycling)。这证明，PEDF是成体NSC的巢来源的调节因子，并且提供了证据证明它在NSC维持中的作用(KatlinB.Massirer,2010；Carmen-Ramírez-Castillejo,2012)。

中期因子

中期因子(MK)是肝素结合细胞因子，并且促进靶细胞的生长、存活、迁移和其它活性。MK在胚胎发生过程中，特别在妊娠中期强表达，但是仅在成人的有限部位处表达。在组织受损，诸如缺血性脑损伤时，诱导MK表达。MK通过增强白细胞的迁移而参与炎性疾病中，包括趋化因子产生和抑制调节性T细胞。MK的适体(aptamer)抑制实验性自身免疫性脑炎(Muramatsu,2001；Reiff,2011)。

在本发明中，已经表明与如上所示的各种理论相关的标记物可用于诊断MDD以及相关疾病，诸如双相抑郁症和焦虑障碍。通常，认为本发明的标记物和标记物套可有利地用于诊断感情障碍。

如本领域技术人员可认识到的，上述标记物中仍然有很多标记物不与感情障碍，特别是抑郁症相关联。因此，特别想要标记物HVEM、中期因子、cGMP、皮质醇、孕烯醇酮和钙卫蛋白在尿液中，更优选在怀疑患感情障碍的人的第一次晨尿中，诊断感情障碍的应用。此外，这些化合物还可用作监控疾病发展或疾病治愈的进展的标记物。以类似的方式，血液样品的连蛋白、cAMP、HVEM、孕烯醇酮、中期因子和钙卫蛋白可用作检测感情障碍或用于监控疾病发展或对其疗法效果的个体标记物。

然而，优选在血清或尿液之一或两者中测量的两种或多种标记物的组用于进行感情障碍，优选抑郁症的可靠诊断。

这样的组最近已经在WO2009/111595和WO2010/097631中进行了描述。在WO2009/111595中，描述了包括BDNF、IL-7、IL-10、IL-13、IL-15、IL-18、FABP、A1AT、B2M、因子VII、EGF、A2M、GST、RANTES、TIMP-1、PAI-1甲状腺素和皮质醇的标记物组或该组的各子集的应用。该申请公开的另一组由ACTH、BDNF、皮质醇、多巴胺、IL-1、IL-13、IL-18、去甲肾上腺素、TSH、AVP和CRH组成，和额外的神经肽Y和血小板相关的血清素，或其子集。

在WO2010/097631中，提出了具有重叠的生物标记物的组，由IL-17、IgA、皮质醇、1载脂蛋白A、IL-6、补体3、因子VII、SAP、B2M、ICAM-1、IL-1、TNF-α、MIF、血管紧张肽原、NrCAM、CD40、CA125、HCC4、嗜酸性粒细胞趋化因子3、VEGF、触珠蛋白、IL-1α、载脂蛋白H和TIMP-1组成，和额外的AFP、谷胱甘肽s转移酶α、嗜酸性粒细胞趋化因子、弓形体(toxoplasma)、IGF-BP2、BDNF、SOD和IL-15中的一种或多种。

然而，这些申请中都没有给出证据来证明所示的组是否的确能给出抑郁症的可靠诊断。

因此，仍然需要用于情感障碍，诸如抑郁症的诊断的额外的标记物。

在本申请中，术语“生物标记物”用于指一种过程、事件或病症的独特的生物或生物来源的指示物。生物标记物可用在如下方法中：诊断，例如临床筛选，和预后评估和监控疗法结果。它们还可用于鉴定出最可能应答于特定治疗的患者，用于药物筛选，和用于药物开发。因此，生物标记物及其应用对于鉴定新药物治疗和发现药物治疗的新靶点是有价值的。进一步地，它们对于探究剂量方案和药物组合是有价值的。

为了清楚且简明描述的目的，本文的生物标记物被描述为同一或分离的实施方式的一部分，但是应理解本发明的范围可包括具有所有所述生物标记物或一些所述生物标记物的多种组合。

本领域技术人员应清楚，复杂且还没有(完全)理解个体发生的情感障碍是难以诊断的。如在引言中所讨论的，目前诊断是基于行为和心理的基础。在文献中，有证据证明很多因子参与，并且在情感障碍中起作用。但是，基于生物标记物的诊断开发的焦点大部分专注于单一测定。

在这一方面，本发明向现有技术已经公开的现存的标记物组中添加更多的标记物。发明人发现，几种化合物可用作(有助于)诊断感情障碍，优选抑郁症的标记物。如在实验部分中所示，显示出这些独特的标记物已经能在健康和受影响的人之间进行区分，但是在两组的值之间存在重叠。

这些独特的标记物是在血清或尿液中测量的Lox-1、HVEM、中期因子、孕烯醇酮和钙卫蛋白。当仅考虑在尿液中测量时，可将标记物皮质醇和P物质及cGMP添加到列表中。以类似的方式，血液样品的连蛋白和cAMP可额外用作检测感情障碍或用于监控疾病发展或对其疗法效果的独特的标记物。

为了使诊断更可靠，优选在测定中添加多于一种的标记物。如在引言中所讨论的，对于情感障碍，特别是抑郁症的起因和发展存在几种假说。支持本发明的想法是，选择代表这些不同假说的标记物，以获得互补标记物的组。

在图4和图5(分别是血清样品和尿液样品)中，表明了哪几组(几套标记物)被认为可用于诊断感情障碍，特别是抑郁症，其中总计用于血清的有38种标记物和用于尿液的有32种标记物。可以看出，每次都示出仅包括2种标记物的一套标记物。这样，本发明覆盖了至少两种标记物的一套标记物在诊断感情障碍，特别是抑郁症中的应用，该标记物选自如在图4和图5中所示的多套的组。但是，这样的一套标记物可任选补充有在图中列出的任意数量的其它标记物。相应的，一套标记物可包括如图4和图5中提到的组合所示的两种标记物，但是也可包括3种标记物，其中第三种标记物选自图4和图5中所列的任意标记物。或者，可包括选自图4和图5中所示标记物中的4种标记物、5种标记物、6种标记物和多至28种标记物。

进一步的，适用于本发明的一套标记物可由上述“血清”标记物和“尿液”标记物的组合组成。

这些标记物的检测和/或量化可使用免疫学方法进行，其中免疫学方法包括能特异性结合生物标记物的抗体或其片段。适当的免疫学方法包括：三明治免疫测定，诸如三明治ELISA，其中生物标记物的检测使用识别生物标记物上的不同表位的两种抗体进行；放射性免疫测定(RIA)，直接、间接或竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、化学发光免疫测定、免疫印迹、免疫沉淀和基于任何颗粒的免疫测定(例如，使用金、银或乳胶颗粒，磁性颗粒，或Q-斑点)。免疫学方法可例如在微量滴定板或在测试条上进行。还可以使用并行的芯片实验室技术(concurrentlab-on-a-chiptechnique)进行分析。这些免疫测定在市场上可以买到。在本申请的实施例部分，表明了针对在本申请中测量的每一种生物标记物使用了来自哪一供应商的测定法，该测定法是本发明的基础。

但是，本发明并不限于免疫测定。对患者样品中的生物标记物所进行的分析可使用如下方法进行：化学分析方法(如质谱分析法、MALDI-TOF、显微拉曼光谱法)，磁放射性成像(magneticradioimaging)，流式细胞检测分析，和适于检测流体中的蛋白的所有其它定量分析系统。测定还可对编码(蛋白)标记物或酶的核酸进行，其中的酶处于非蛋白标记物的生物合成途径中。这样的测定优选是RT-PCR测定，其中测量来自样品的mRNA。在这样的情况中，所述样品可以是来源身体的任意细胞材料。还可以使用基于受体的测定作为分析工具，该基于受体的测定使用在生物系统中针对所提到的生物标记物正常存在的受体。当然，也可使用针对编码受体的核酸的RT-PCR测定。除了RT-PCR之外，还可使用杂交技术(RNA印记(northernblotting))、微阵列杂交等)和测序技术，以确定所述(蛋白)标记物和/或它们的受体的DNA表达。

最近，科学家关注于表观遗传变异(epigeneticvariation)和DNA甲基化中的特定变化，作为可应用于一系列障碍的有前景的一类生物标记物(Petronis,2010；Portela&Esteller,2010)。甲基化指在它们的启动子区域中的CpG的胞嘧啶上添加甲基(CH₃)基团，而在大多数细胞中，这些CpG“岛”是未甲基化的。启动子区域中的CpG岛的甲基化可明显改变基因表达。在很多年中，研究主要关注于DNA甲基化在癌症中的作用，但是科学家越来越关注于DNA甲基化在精神障碍中的作用(Tsankovaetal.,2007；Bredyetal.,2010)。事实上，一些现存的神经药物的作用机制可包括表观遗传改变(epigeneticalteration)(例如丙戊酸)。表观遗传变化已经与神经元中的基因调节中的变化和下游过程(诸如记忆和认知)相关联。总体结论是表观遗传变化可在长期神经学变化(或“分子和细胞记忆”)方面起到重要作用。因此，DNA甲基化可用作治疗靶点的重要的生物标记物。

可在本发明中使用的测定优选是定量测定，其中可确定样品中的生物标记物的浓度。这在原理上可通过上面提到的所有检测方法来实现。对这样的测定的结果进行解释时，应考虑各种决定因素，诸如性别、年龄、吸烟状态、城市化、食物和酒精摄入。

对于所有这些标记物，可利用市场上出售的免疫测定。这些标记物都可以在体液中测定，但是一种类型的体液对于一些生物标记物是优选的也是可能的。因此，如果测试两种或多种标记物，可以是如下情况：在血液中测试一种标记物，而在尿液中测试其它标记物，并且在来源于细胞材料的核酸上进行第三种标记物的测试。对这样的测定结果进行解释时，应考虑各种决定因素，诸如性别、年龄、吸烟状态、城市化、食物和酒精摄入。

优选地，标记物组将被提供在诊断患者中情感障碍(优选抑郁症)的诊断中，其中该组包括反映以下组的标记物：

-反映矿物质体内平衡假设的标记物：PTH、AVP及其受体(V1a、V1b)、cAMP、TRPM7、地高辛、TRPM6、RACK-1、雌二醇、REA、P物质及其受体NK1、EGF及其受体ERBB1-4、醛固酮及其受体(MRC)，和已知影响醛固酮排泄的所有物质，如血管紧张素I和II及它们的受体(AT1、AT2)、ACTH及其受体(MC2)、钾和凝乳酶。

-反映内皮素功能障碍和氧化应激的标记物，选自：oxLDL及其受体LOX-1、硝基酪氨酸、F2-异前列腺素、内皮素-1及其受体(Eta、ETb)、弹性蛋白/锁链素。

反映紧密连接&肠漏症假说的标记物：连蛋白和闭锁小带毒素(zot)；LIGHT和淋巴毒素β受体(LTβR)。

反映促炎性假说的标记物，选自：所有磷脂酶A2酶、PAF/PLAF；和，花生四烯酸以及双高-γ-亚麻酸途径的所有下游组分，如但并不限于PGA2、PGE2及其受体、凝血噁烷B2及其受体TP、环前列腺素、PGF2和PGD2；下游5-HPETE和其它HPETE衍生物，如但并不限于5-HETE、LTB4及其受体(BLT1、BLT2等)、LTC4、LTD4LTE4；1型半胱氨酰白细胞三烯受体、脂氧素(LXA4、LXB4)、脂氧素A₄受体、PGE1、PGA1、PGH_1-15OH三烯。

-反映免疫炎症假设的标记物，选自：

脂质运载蛋白-2、TNFα、TNFβ、1+2型TNFα受体、HVEM、钙卫蛋白、il-6及其受体、il-1及其受体、髓过氧化物酶、半乳糖凝集素-8和新蝶呤。

-反映神经发生假说的标记物，选自：BDNF及其受体TrkB和LNGFR、中期因子及其受体RPTPζ、bFGF及其受体HVEM和PEDF。

-反映能量状态(的变化)的标记物：瘦素及其受体(LEP-R)、脂联素及其受体(ADIPOR1、ADIPOR2和CDH13)。

-其它标记物，选自：维生素D及其受体(VDR)、皮质醇及其受体(GCR)、膜联蛋白-1、孕烯醇酮及其受体(GCR)、、GABA、VILIP-1、神经肽Y、MMP-1、BCL-2、钙网蛋白、活化素/抑制素cGMP，和来自NO-cGMP途径的化合物，包括已知影响cGMP的排泄的所有试剂，如心房钠尿肽、脑钠尿肽和c型钠尿肽；血管活性肠肽和降钙素基因相关肽、一氧化氮合成酶(内皮NOS、eNOS，神经元NOS、nNOS)和l-精氨酸。

根据本发明，可用于在测定中诊断感情障碍，优选MDD、双相抑郁症或焦虑症的一套标记物可以是选自上述组中的一套两种标记物，这一套可补充有来自上述组的任意标记物。对于在尿液中的测试，优选一套两种标记物选自包括如下32种标记物的组：活化素、cAMP、醛固酮、地高辛、脂质运载蛋白、新蝶呤、LTB4、TNFα受体2、HVEM、PGE2、凝血噁烷B2、LOX-1、硝基酪氨酸、F2-异前列腺素、中期因子、IGF、内皮素-1、c-GMP、GABA、维生素D、皮质醇、孕烯醇酮、P物质、EGF、钙卫蛋白、瘦素、髓过氧化物酶、神经肽Y、CCK、sVEGFR1、AVP和脂联素。对于在血清中的测试，一套两种标记物选自包括如下38种标记物的组：活化素、cAMP、醛固酮、脂质运载蛋白、TNFα受体2、HVEM、、PGE2、凝血噁烷B2、LOX-1、硝基酪氨酸、F2-异前列腺素、BDNF、PEDF、中期因子、内皮素-1、c-GMP、GABA、维生素D、孕烯醇酮、P物质、EGF、连蛋白、钙卫蛋白、VILIP、瘦素、AVP(加压素)、神经肽Y、MMP-1、bFGF、地高辛、BCL-2、钙网蛋白、髓过氧化物酶、LTB4、PLAF、sVEGFR1和脂联素。

紧接着上面给出的针对抑郁症的个体发生和在其中起作用的化合物的假说的概述，文献中介绍了其中一些标记物与抑郁症的参与和可能诊断之间的关联。本文后面附上了很大一部分、但是并不完整的相关文献列表。

进一步地，使用脂质运载蛋白-2作为标记物的基本原理可来源于共同审理的申请NL2007112。

如上所示，标记物可用于证实基于心理和行为标准的诊断。对于每一种标记物，可以示出测量的水平是否是存在情感障碍，诸如抑郁症的指示物。这一方面的信息可在引用的文献中找到，并且该知识的实际应用在本申请的实验部分进行了证明。显然，在一组中使用越多的标记物，随后测试的具有怀疑患病的水平的标记物越多，则可进行越可靠的抑郁症诊断。

当然，如果使用的标记物中全部或接近全部都对抑郁症作出阳性应答，则诊断应认为是确定的。或者，可如在WO2009/111595的第8页和第9上例示的那样，计算诊断得分。

在标记物的初始结果的基础上，如下面实验部分所示，建立血清/血浆测定的标记物组的优选实施方式包括标记物TNF-R2、皮质醇、凝血噁烷、内皮素、瘦素和维生素D，该血清/血浆测定的标记物组可以高度可信度来诊断情感障碍，优选抑郁症。为了进一步增加诊断的可信度，这一套标记物可扩展至由钙卫蛋白、cAM连蛋白和P物质组成的生物标记物的组。为了进一步提高可信度，测定可进一步扩展有标记物BDNF、中期因子、硝基酪氨酸、LTB4、神经肽Y、端粒酶和醛固酮。

类似地，对于仅在尿液中进行的测试，提供可靠诊断的一套标记物由cGMP、皮质醇、钙卫蛋白、凝血噁烷、醛固酮、HVEM和P物质组成。为了实现诊断可靠性的进一步改进，可以进一步包括生物标记物瘦素、LTB4、异前列腺素和中期因子。通过进一步包括生物标记物cAMP、内皮素、TNF-R2和神经肽Y，可实现诊断正确性的更进一步的提高。

当混合血清/血浆生物标记物和尿液生物标记物时，能提供可靠诊断(显著性p<0.00001)的最小的一套标记物由以下生物标记物组成：TNF-R2(s)、皮质醇(s)、凝血噁烷(s)、瘦素(s)、内皮素(s)、cGMP(u)、皮质醇(u)、醛固酮(u)、凝血噁烷(u)、HVEM(u)和P物质(u)，其中后缀(s)或(u)表示该标记物是在血清/血浆(s)中测量还是在尿液(u)中测量。为了提高诊断的精密度，这一套生物标记物可延伸至维生素D(s)、cAMP(s)、连蛋白(s)、P物质(s)和钙卫蛋白(u)的组。精密度的进一步提供可以通过使上述的标记物套与其它标记物套进一步组合来获得，其它的标记物套包括钙卫蛋白(s)、瘦素(u)、LTB4(u)、异前列腺素(u)和中期因子(u)。

上述组还列在下面的表4中。

而对这样的测定的结果进行解释，应考虑各种决定因素，诸如性别、年龄、吸烟状态、城市化、食物和酒精摄入。还可从引用的文献(例如Busetal.,2010)中推断出，标记物的存在与以下因素有关：诸如性别，其中男性中存在的浓度比女性高；或者诸如年龄，其中年纪大的人中标记物水平比年纪小的人高。测量的值当然应根据本领域技术人员已知的这些关系进行解释，如在本文所引用的文献中证明的。

优选地，当对尿液进行测定时，该测定更优选针对第一次晨尿样品进行，还包括对肌酐进行同步测定。肌酐是蛋白代谢的一种副产物。在正常条件下，肌酐存在于血液中，并且作为最终代谢物被排泄在尿液中。尿液的肌酐水平常规用作肾功能诊断的一部分。具体地，尿液中肌酐水平的改变是肾脏疾病，诸如急性或慢性肾炎、肾变病(nephrosis)等的指示物。因为已经建立了肌酐排泄的标准值，尿液的肌酐水平对于其它化合物的测定的校正也是有用的，因为它们为所述测定证明尿液收集的适当性。具体地，肌酐校正可用于校正尿液稀释度，从而在不考虑尿液的水含量和/或产生尿液的那一天的时间的情况下，可以对测量的浓度进行标准化。进一步地，在影响排泄率的肾功能上的变化可通过测量尿液中的肌酐进行校正。在对尿液进行测定的实验部分中，所给出的任何值都已经通过肌酐的测量进行了校正。

本发明的生物标记物或这样的替代分子被识别为“生物传感器”，可包括能与生物标记物特异性结合的一种配体或多种配体。这样的生物传感器可用于检测和/或量化生物标记物，优选用于量化。

特别有用的生物传感器是抗体。本文使用的术语“抗体”可包括：多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab’)2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型抗体和表位结合片段。术语“抗体”还指免疫球蛋白和T细胞受体分子，即含有抗原结合位点的分子，其中抗原结合位点与抗原特异性结合。免疫球蛋白分子可以是属于任何类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)或其子类别。如果生物标记物是核酸，则特异性探针可用作“生物传感器”。优选在这样的情况中，使用适当的引物序列在PCR反应中对靶DNA进行第一次扩增。

对情感障碍(特别是抑郁症，更尤其是重性抑郁障碍)具有特异性的生物标记物的鉴定对于整合诊断程序和治疗方案是关键的。适当的诊断工具(诸如生物传感器)可在本发明的方法和应用中进行开发；并且，生物标记物的检测和量化可使用微量分析系统、显微工程系统、显微分离系统、免疫层析系统或其它适当的分析装置(诸如拉曼或质谱分析等)中的生物传感器进行。经由电、热、磁、光学(例如全息图)或声学技术，生物传感器可并入到检测生物标记物的免疫学方法中。使用这些技术，可检测在生物样品中以预期浓度存在的靶标生物标记物。因此，根据本发明的又一方面，提供了一种诊断或监控情感障碍(特别是抑郁症且更具体是重性抑郁障碍)的装置，包括在微量分析系统、显微工程系统、显微分离系统和/或免疫层析系统中的一种或多种生物传感器，该微量分析系统、显微工程系统、显微分离系统和/或免疫层析系统被配置为检测和/或量化本文限定的任何生物标记物。

本发明的生物标记物可使用基于“智能”全息图或高频声学系统的生物传感器并入技术来检测，其中高频声学系统尤其经得起“条形码”或阵列配置的检验。

在智能全息图传感器(SmartHologramsLtd,剑桥(Cambridge),UK)中，将全息图像储存在薄的聚合物薄膜中，该薄的聚合物薄膜经感光以与生物标记物特异性反应。在曝光时，生物标记物与聚合物反应，使得在全息图显示的图像中发生改变。

测试结果的读数可以是光学亮度、图像、图像的颜色和/或位置的变化。对于定性和半定量应用，传感器的全息图可通过眼睛读出，从而不需要检测设备。当需要定量测量时，可使用简单的颜色传感器读出信号。样品的不透明度或颜色不干扰传感器的运行。传感器的形式运行同时检测几种物质的多路复用。可设计可逆和不可逆的传感器以满足不同的需求，并且能实行对感兴趣的特定生物标记物的持续监控。

适当地，根据本发明的检测一种或多种生物标记物的方法将生物分子识别与适当的手段组合，以将样品中生物标记物的存在或数量的检测转变成信号。

检测一种或多种生物标记物的生物传感器还可以通过声学、等离子共振、全息和纤维工程传感器来检测。可利用印迹识别元件(Imprintedrecognitionelement)、薄膜晶体管技术、磁声共振器装置和其它新的声学-电子系统，以检测本发明的一种或多种生物标记物。

涉及本发明的一种或多种生物标记物的检测和/或量化的方法可在台式仪器上进行，或者可并入到一次性的诊断或监控平台中，该一次性的诊断或监控平台可用在非实验室的环境中，例如在医师的办公室或在患者的床边。进行本发明的方法的适当平台包括具有光学或声学读出器的“信用”卡。传感器系统可配置为将收集的数据电子传输至医师以进行解读，从而可形成远程诊断的基础。

本发明的方法可以阵列的方式(例如在芯片上)进行或作为多孔阵列进行。这样能够同时在多个受试者或样品中，测试几种生物标记物或仅测试一种生物标记物。可使方法适应于单一测试，或多个相同或多个不同测试的平台，并且可以高通量的方式进行，其中多个不同测试尤其存在于基于尿液的标记物与基于血清的标记物组合的情况中。本发明的方法可包括进行一种或多种额外的不同测试，以证实或排除诊断，和/或以进一步表征病症。

提供了诊断或监控情感障碍(特别是抑郁症且更尤其是重性抑郁障碍)或其诱因的试剂盒。根据本发明的适当试剂盒可包括选自以下组的一种或多种组件：对生物标记物或该生物标记物的生物学途径中的上游或下游的分子具有特异性的生物传感器，其中该生物标记物是本文提供的生物标记物中的一种；一种或多种对照；一种或多种试剂和一种或多种消耗品；可选地，使用根据本文定义的任何方法的试剂盒的说明书。

对情感障碍(特别是抑郁症且更尤其是重性抑郁障碍)的生物标记物的鉴定能整合诊断程序和治疗方案。目前，药物治疗或心理疗法的效果难以进行测试，因此根本不可能对疗法应答进行快速评定。传统上，对于给定的疗法途径，很多抗抑郁疗法需要持续数周至数月的治疗。检测本发明的生物标记物可用于在受试者参加临床试验之前，对他们进行筛选。生物标记物提供了指示治疗应答、应答失败、不利的负作用图谱和服药依从性的程度的手段。生物标记物可用于在非常早期，就终止对无应答者的治疗。它们还可用于微调剂量，最小化处方药的数量，和缩小获得有效治疗的延迟。从而通过监控本发明的生物标记物，可精确制定患者护理，以与患者的障碍和药物基因组(pharmacogenomic)图谱所决定的需要相匹配。因此，生物标记物可用于以滴定法测量最佳剂量，并且鉴定积极的治疗应答。

基于生物标记物的测试(诸如本发明所提供的)提供了“新”患者的一线评定(firstlineassessment)，并且为精确且快速的诊断提供了在时间范围内并且具有精密度的客观测量，这是使用目前的主观测量不可能实现的。进一步地，诊断性生物标记物的测试(诸如本发明所提供的)可用于鉴定出具有发展成重性抑郁障碍的高风险的家庭成员或患者。这样能起始适当的疗法或预防措施，例如管理风险因素。识别这些途径以改进结果，并且可防止所述障碍的明显发作。

生物标记物监控的方法、生物传感器和试剂盒作为患者监控工具也是至关重要的。如果评定药物治疗使不充分的，则可恢复或增加疗法；如果适当的话，可对疗法进行改变。因为生物标记物对于障碍状态是敏感的，因此它们提供了药物疗法的影响的指示。

本文记载了用于诊断和监控情感障碍、优选抑郁症、最优选重性抑郁障碍的诊断试剂盒。诊断或监控生物标记物的方法可包括量化来自患者的样品中的生物标记物，并且将在该样品中存在的生物标记物水平与一种或多种对照进行对比。为了进行监控，对照可以是同一患者在较早时间点时的测试样品。

优选地，根据本发明对患者中情感障碍的存在所进行的诊断用于证明对情感障碍，诸如抑郁症的怀疑。这意味着，优选在进行一种或多种生物标记物的测定时，已经怀疑患者患有情感障碍。在这一方面，本发明可被认为是一种增强抑郁症诊断的方法。

本发明的主要优点之一是，提供了一种容易且可靠的方式来监控疾病的发展和/或疗法的效果。为此，在特定时刻(空值)和在重复该程序一段时间之后，确定受试者中上述鉴定的一种或多种生物标记物的值。在一段时间中，可进行几次重复测量。同时，可例如起始或改变疗法。生物标记物水平的变化将指示该疗法的效果或疾病的进展。

适当地，在从经历监控的受试者采集多个样品之间消逝的时间是几天、一周、两周、一个月、几个月或更长。可在抗抑郁疗法之前和/或过程中和/或之后采集样品。可在患者的剩余生命或其一部分中，以一定间隔采集样品。

因此，通过这样的途径，以非侵入性且容易的方式，可监控疾病的进展。

实施例

实施例1

患DSMIV、被诊断为重性抑郁症、具有18或更高的汉密尔顿(Hamilton)得分的十位患者，患DSMIV、被诊断为焦虑障碍、具有18或更高的汉密尔顿得分的一个人，以及患DSMIV、被诊断为双相抑郁、具有18或更高的汉密尔顿得分的一个人在年龄、性别和种族本源上与12位健康人相匹配。

通过静脉注射器(venapunction)，将来自所有这些人的血液和尿液收集在9mL管中。这些样品在3000×g离心10分钟。等分在25个管中；保持在4℃，并且储存在-80℃直至使用。从中段晨尿中采集尿液样品，直接储存在4℃。同一天，将这些样品在3000×g离心10分钟，并且等分在20个管中。将这些样品储存在-80℃，直至进一步使用。

使用市场上出售的测定剂，测试这些样品中的以下生物标记物。所述测定剂获自以下供应商，并且所述测定根据供应商的说明书进行，除非后面另有说明。

R&DsystemsEuropeLtd.(阿宾顿(Abingdon),英国(UnitedKingdom))：皮质醇、LTB4、凝血噁烷、内皮素-1、P物质、PGE2、c-AMP和c-GMP；

RayBiotechInc(斯市(Norcross),GA,USA)：活化素、Lox-1、瘦素、EGF、脂质运载蛋白、脂联素、TNFα受体2和HVEM；

BiovendorGmbH(海德尔堡(Heidelberg),德国(Germany))：PEDF、VILIP-1；

SanbioBV(Hycultbiotech,乌登(Uden),荷兰(TheNetherlands))：钙卫蛋白；

NorthwestLifeScienceSpecialties,LLC(温哥华(Vancouver),WA,USA)：异前列腺素-2、硝基酪氨酸；

ImmundiagnostikGmbH(本斯海姆(Bensheim),Germany)：连蛋白；

LDNGmbH(诺德霍恩(Nordhorn),Germany)：GABA；

IBL-HamburgGmbH(汉堡(Hamburg),Germany)：新蝶呤；

CellmidLimited(佩斯(Perth),澳大利亚(Australia))：中期因子；

Cusabio(武汉，中国)：半乳糖凝集素-8；

ImmunologyConsultantsLab.,Inc.(波特兰(Portland),OR,USA)：髓过氧化物酶；Diasource(勒芬(Leuven),比利时(Belgium))：孕烯醇酮、维生素D；

PeninsulaLaboratories,LLC(圣卡洛斯(SanCarlos),CA,USA)：NPY和Arg-加压素；MonobindInc(森林湖(LakeForest),CA,USA)：地高辛；

PromegaBeneluxBV(莱顿市(Leiden),TheNetherlands)：BDNF；和

NovaTeinBio(坎布里奇(Cambridge),MA,USA)：苄氯素。

测试使用ELISA技术进行。所有程序都按照制造商的说明书进行，使用ELISA板洗涤仪PW40(SanofiPasteur)。数字化储存微量滴定板的读出值，并进一步用于数据简化。使用OD值的标准曲线分析所有数据，该OD值的标准曲线通过微量滴定板读出仪(多重扫描EF35型(MultiscanEFtype35),ThermoScientific)针对试剂盒的各制造商提供的浓度获得。样品OD值和在每一轮获得的标准曲线的OD值进行插值法，获得各测量的患者样品的值。

各样品的各标记物的结果显示在表2(血清样品)和表3(尿液样品)中。针对肌酐，校正尿液样品。

收集来自患者和对照者的数据，并且如果可能的话，对于每一个参数都确定两个值。为了获得每一参数的两个值，使用统计学程序Medcalc(版本11.4.0.0，http://www.medcalc.org)来确定受试者工作特征(ReceiverOperatingCharacteristic,ROC)。确定第一值，该第一值将在两组之间进行区分，是具有疾病的截止点的标准，被设置为计算的阳性预测值(+PV)的>95％处。测量的任何样品值超过该第一区分值(截止点-Dis，患病)都被认为是可辨识的疾病状态。第二值是相反(reciprocal)状态：是没有疾病的截止点的标准，被设置为计算的阴性预测值(-PV)的>95％处。测量的任何样品值超过该第二区分值(截止点-Excl.，排除患病状态)都被认为是可辨识的健康状态。在截止点-Dis和截止点-Excl.之间出现的任何值都被认为是不可辨识的。其中测量能确定这些截止点值的一个或两个的参数被认为有足够的辨识力，从而可用作本发明的标记物。

在每一参数的截止点-Dis和截止点-Excl.的结果的基础上，通过将样品分配成阳性、阴性和不确定的，对结果进行进一步分析。阳性样品被分配为值+1，阴性样品被分配为值“-1”，而不确定的样品被分配为值“0”。接着，构建一套标记物。每一个样品，在每一套参数中，确定所有Pos、Neg和不确定的结果(以+1、-1、0表示)的总和，然后通过ROC分析来测试所得值的敏感性和特异性：根据每一套标记物所得的+PV和-PV，使用每一套标记物获得的最佳截止点结果用于将患者分配为患病，或排除对照者患病。

独立地分析三套数据，在每一套中对生物标记物的组合进行选择。成套的生物标记物基于在其中检测生物标记物的体液：血清/血浆、尿液，或血液/血浆和尿液的组合。在所有三套生物标记物中，基于增加的贡献，可实现生物标记物数量的降低，从第4阶(order)(即所有标记物)开始下降至第3阶、第2阶，并最终下降至第1阶。生物标记物在各阶中的贡献的显著性基于：在定义为ROC分析的AUC的表型随机化直方图(phenotyperandomisationhistogram)中，所测量的组合的曲线下面积(AUC)的位置。显著性是在合适的0％至5％区域内的任何位置。根据表型随机化与在第4阶至第1阶的生物标记物中包含的生物标记物的总数量的对比，给出在表4中示出的显著性。AUC在0.500至1.000之间变化。AUC的值约高，则它的敏感性和特异性越好。因此，选择AUC来评价每一种生物标记物组合的性能，并且为了最佳目的而作出选择。

在每一“阶”内，基于分别在90％和95％处的不同的入选标准(inclusioncriteria)，进行三种或四种分析。入选标准越严格，满足入选标准而被入选的(“参与的生物标记物”)生物标记物的数量越少。当增加在第4阶中开始的严格性时，参与的生物标记物的数量降低，从而能进行最佳选择。在下面较低的阶中，逐步排除特定条件下一些生物标记物，这些生物标记物发现在较高严格性下不参与。

对选择的描述。

1、尿液+血清/血浆。

严格条件(包括90％和95％条件的7.5％)下，测试显著性示出p＝0.04的表型随机化显著性。在此条件下，包括所有40种生物标记物，使得每一种生物标记物都成为潜在的候选物，而不考虑生物标记物在其中进行测试的体液(随机化运行特征：AUC_-实际＝0.855,AUC_-随机＝0.801+/-0.032，运行次数＝3025，0.855的分数剩余(fractionleft)＝95.7％，有活性的生物标记物40/40，软件随机化检查(SoftwareRandomisationcheck)版本1.05，参见表)。

第4阶：似乎包括所有40种测试的生物标记物。

第3阶：排除在入选条件20％/12.5％处的19种生物标记物，保留21种生物标记物。

第2阶：排除在入选条件25％/12.5％处的3种生物标记物，保留16种生物标记物。

第1阶：排除在入选条件25％/15％处的5种生物标记物，保留11种生物标记物。

最大性能条件AUC_最大＝0.879使用21种生物标记物来实现：10种血清生物标记物+11种尿液生物标记物。使用11种生物标记物实现最佳性能条件AUC_最小＝0.858：血清中的5种生物标记物与尿液中的6种生物标记物的组合。

2、尿液。

在90％和95％处包括10％的严格性获得p＝0.046的显著性。在这一条件下，包括所有19种生物标记物，以使测试的每一尿液生物标记物都成为潜在的候选物。随机化运行特征：AUC_-实际＝0.781，AUC_-随机＝0.721+/-0.037，运行次数＝3538，0.721的分数剩余＝95.4％，有活性的生物标记物19/19，软件随机化检查版本1.05，数据没有示在表中。

第4阶：似乎包括所有19种测试的生物标记物。

第3阶：排除在入选条件14％/10％处的4种生物标记物，保留15种生物标记物。

第2阶：排除在入选条件20％/12.5％处的4种生物标记物，保留11种生物标记物。

第1阶：排除在入选条件25％/15％处的4种生物标记物，保留7种生物标记物。

最大性能条件AUC_最大＝0.825使用11种生物标记物来实现。最佳性能条件AUC_opt＝0.823使用11种生物标记物来实现。

3、血清/血浆

在90％和95％处包括7.5％的严格性示出p＝0.030的显著性。在这一条件下，包括所有21种生物标记物，以使测试的每一血清/血浆标记物都成为潜在的候选物。随机化运行特征：AUC_-实际＝0.793，AUC_-随机＝0.727+/-0.036，运行次数＝3154，0.721的分数剩余＝97.0％，有活性的生物标记物21/21，软件随机化检查版本1.05，数据没有示在表中。

第4阶：包括21种生物标记物。

第3阶：排除在入选条件15％/7.5％处的4种生物标记物，保留17种生物标记物。

第2阶：排除在入选条件20％/12.5％处的7种生物标记物，保留10种生物标记物。

第1阶：排除在入选条件25％/14％处的4种生物标记物，保留6种生物标记物。

最大性能条件AUC_最大＝0.793使用21种生物标记物来实现。最佳性能条件AUC_opt＝0.775使用10种生物标记物来实现。

表2

表3

表4

参考文件

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