一种肽适体及其作为稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂的应用

摘要

本发明提供一种肽适体及其作为稻瘟菌钙调节蛋白拮抗剂的应用，属于蛋白质工程领域。本发明的肽适体命名为SNP-D4，是以葡萄球菌核酸酶为基本骨架的肽适体。该肽适体以稻瘟菌钙调蛋白CaM为靶标，通过细菌双杂交获得，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，编码其的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。肽适体SNP-D4既能与CaM特异性相互作用，又具有抑制稻瘟菌孢子发育功能，可作为稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂，在植物保护领域具有广泛的用途。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体地说，涉及以葡萄球菌核酸酶 为基本骨架的肽适体及其在水稻稻瘟病防治中的应用。

背景技术

稻瘟病、白叶枯病和纹枯病被列为水稻三大主要病害。稻瘟病是 由稻瘟霉(Magnaporthegrisea)引起的水稻真菌性病害,分布范围十 分广泛，90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在5700万亩以上， 年损失稻谷达数亿公斤。稻瘟菌侵染过程依赖多种信号通路参与调 控，其中Ca²⁺信号通路在稻瘟菌的生长发育、孢子萌发、侵染结构形 成和致病性方面也具有重要作用。钙调蛋白(Calmodulin，CaM)是Ca²⁺信号通路中的重要组成部分，尤其与稻瘟菌孢子萌发和附着胞形成密 切相关。

钙调蛋白拮抗剂是以钙调蛋白为靶点的药物，对研究钙调蛋白在 稻瘟菌致病性方面的功能具有重要意义。但是，目前市场上钙调蛋白 拮抗剂均专一性不强，且无任何稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂的研究报道， 使得钙调蛋白拮抗剂不仅于稻瘟菌钙调蛋白，还会影响其他的通路蛋 白，无法实现单一变量的实验策略。

肽适体(peptideaptamer，pepaptemers)是人工合成的随机氨基 酸文库中筛选出的可特异性、高亲和力结合靶标的短肽。其主要结构 包括一段无生物活性的支架蛋白(scaffoldprotein)以及两端固定在 支架蛋白上的可变肽段。肽适体文库的设计原理是将大量人工合成的 随机肽序列，插入、整合于蛋白支架之上构成肽库，利用随机区域的 信号基序(signalmotif)与靶蛋白之间的相互作用，筛选得到针对靶 蛋白的高亲和力、高特异性的肽适体。本实验室拥有库容量约为 1.5-2.0×10⁷的肽适体文库：肽库为可编码16个随机氨基酸的寡核苷 酸文库，以改造的葡萄球菌核酸酶SNase(Staphylococcalnuclease， SN)为脚手架蛋白，借助两端限制性酶切位点，成功将随机片段插 入至SNase中。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够作为稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂的肽 适体及其应用。

本发明提供的肽适体，其为SNP-D4，以葡萄球菌核酸酶为基本 骨架，具有：

1)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或

2)SEQIDNo.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或 几个氨基酸。

本发明提供了编码上述肽适体的基因，其具有：

1)SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或

2)SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或 几个核苷酸；或

3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

含有上述编码肽适体的基因表达载体属于本发明的保护范围。

含有前述表达载体的宿主细胞属于本发明的保护范围。

本发明提供了含有肽适体SNP-D4的生物制剂。

本发明提供了含有肽适体SNP-D4的稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂。

本发明还提供了含有肽适体SNP-D4的农药。

本发明提供了肽适体SNP-D4在植物保护方面的应用和在抑制稻 瘟菌中的应用。

本发明提供了含有肽适体SNP-D4的生物制剂在在植物保护方面 的应用和在抑制稻瘟菌中的应用。

本发明提供了含有肽适体SNP-D4的农药在植物保护方面的应用 和在抑制稻瘟菌中的应用。

本发明提供了肽适体SNP-D4在制备抑制稻瘟菌的生物制剂或农 药中的应用。

本发明提供了肽适体SNP-D4在制备转基因植物方面的应用。

本发明具有下列优点及有益效果：

本发明提供的肽适体SNP-D4(氨基酸序列如SEQIDNo.1所示， 核苷酸序列如SEQIDNo.2所示)既能与CaM特异性相互作用、又具 有抑制稻瘟菌孢子发育功能，可作为稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂在植物保 护、抑制稻瘟菌生长方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为稻瘟菌CaMPCR扩增产物1％琼脂糖电泳图，其中M为 DS5000Marker；1为空白对照，2为稻瘟菌CaM。

图2为显微镜下SNP-D4抑制稻瘟菌生长的观察图。以PBS和 SNase处理组为阴性对照，1％三环唑处理组为阳性对照，显微观察各 组孵育0h、3h、7h后孢子萌发及芽管形成的差别。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的 修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

大肠杆菌E.coliXL1-BlueMRF’、E.coliXL1-BlueMR为实验室 保存菌种。质粒pBT、pTRG、pBT-LGF2、pTRG-Gal11p为实验室保 存质粒。肽适体文库pTRG-SNP由本实验室构建。表达质粒 pET32a-CaM已在文献(马志斌,刘静,张红玉,王立安.稻瘟病菌钙 调素基因的克隆及原核表达特性研究.中国植物病理学会2008年学 术年会论文集.2008.5月:249-253页)中公开。稻瘟病菌菌株 Magnaportheoryzae为实验室保存菌株。

实施例1稻瘟菌CaM基因的克隆

1、引物设计

根据稻瘟菌CaM核酸序列，使用PrimerPremier5.0和DNAMAN 软件设计上下游引物(如表1所示)，由上海生工生物工程股份有限 公司合成。

表1稻瘟菌CaMPCR扩增引物

2、PCR扩增

PCR反应体系(50μl)：

PCR反应程序：94℃，3min；94℃30s,63℃45s,72℃45s，共30个 循环，72℃10min。PCR结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

3、PCR产物回收

利用PCR产物纯化试剂盒(上海捷瑞)进行PCR产物纯化回收， 电泳检测回收的DNA片段。

4、“诱饵”重组质粒的构建

4.1酶切

(1)稻瘟菌CaM基因片段双酶切

①稻瘟菌CaM基因片段，酶切体系如下：

②37℃酶切3h。纯化，溶于30μlTE缓冲液。

(2)“诱饵”表达载体pBT双酶切

①pBT载体双酶切，体系如下：

②37℃酶切3h，取0.5ul1×CIP处理30min。回收、纯化，溶于 30μlTE缓冲液。

4.2连接反应

按照载体/基因片段摩尔比为1:3或者1:4，使用T₄DNAligase进 行连接反应，反应体系(10μl)如下：

16℃处理4h后，存放于-20℃用于后续实验

4.3XL1-BLUEMRF’感受态细胞的制备

采用CaCl₂法制备XL1-BLUEMRF’大肠杆菌感受态细胞。

4.4热激转化

(1)向大肠杆菌XL1-BLUEMRF’的CaCl₂感受态细胞中加1μl重组 质粒DNA，轻轻摇匀，冰上放置30min；

(2)42℃水浴热激90s，立即放入冰上冷却2min；

(3)加800ulLB液体培养基，37℃摇床温育1-2h；

(4)取200ul菌液涂布于Cam/IPTG/X-gal平板上，37℃培养12h。

4.5阳性克隆的筛选

挑取Cam/IPTG/X-gal平板上长出的白色菌落划线，37℃培养12h。

4.6菌落PCR验证阳性克隆

分别采用CaM上下游引物CaM-F/CaM-R和pBT载体上游引物 pBT-F5'TCCGTTGTGGGGAAAGTTATC3'与CaM下游引物CaM-R 两对引物对阳性克隆进行菌落PCR验证。

PCR验证体系①：细菌裂解上清1μl，CaM-F0.5μl，CaM-R0.5μl， 2×PCRmix6μl，ddH₂O4μl，总体积12μl。

PCR程序：94℃3min；94℃30s,63℃45s,72℃45s,共25个 循环；72℃10min。

PCR验证体系②：细菌裂解上清1μl，pBT-F0.5μl，CaM-R 0.5μl，2×PCRmix6μl，ddH₂O4μl，总体积12μl。

PCR程序：94℃3min；94℃30s,57℃45s,72℃45s,共25个 循环；72℃10min。

选用引物CaM-F/R，以质粒pET32a-CaM为模板进行PCR扩增， 1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图1所示，在分子量450bp处 出现一条与预期分子量大小一致的目的片段。将获得的阳性克隆送往 生工生物工程有限公司进行测序，测序结果见SEQIDNO.3。将 pBT-CaM测序结果进行NCBI-BLAST分析 (http://www.nicbi.nlm.gov/)。结果显示，测序结果与NCBI数据库中 的稻瘟菌钙调蛋白(Calmodulin，CaM)基因序列(GenBanK序列号： FJ865430.1)匹配率为100％。由此说明，“诱饵”重组质粒pBT-CaM 构建成功。

实施例2对稻瘟菌孢子具有抑制功能的肽适体的筛选

1、细菌双杂交筛选特异性肽适体

(1)37℃预热SOC培养液，并于-20℃预冷电转杯和1.5ml离心管若 干；

(2)取出-80℃保存的XL1-BLUEMRF’甘油感受态细胞于冰上解冻 15min左

(3)设置电转化参数(电压1.5kv，电阻400Ω，电容25μF)；

(4)添加50ng实施例1获得的诱饵质粒pBT-CaM和50ng pTRG-SNP肽适体文库。该肽适体文库构建方法为：

1)提取葡萄球菌基因组分别用5SNA及3SNA，5SNB及3SNB 进行PCR,用对应酶切，连接到载体pTRG上，构建成pTRG-SN。

5SNA:5'-GGATCCGCGGCCGCAATGGGTTACCCATAC GACGTTC-3'(BamHI位点)

3SNA:5'-GTACTTAGATCTGGCCTTTCTTAAGGAGAA TTCTG-3'(BglII位点)

5SNB:5'-AAGGCCAGATCTAAGTACGGTCCAGAAGCT TC-3'(BglII位点)

3SNB:5'-GATCTCACTAGTTTAGTGGTGGTGGTGGTG GTGGTCGATGTC-3'(ScaI位点)

2)合成单链随机核酸序列，其中N代表A/G/T/C中的一种；S 代表G/C中的一种。5'

GGTGGTNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNN SNNSNNSNNSGGTGGT3'；

3)单链转换成双链，并将此片段插入pTRG-SN载体，构成含有 可变环的pTRG-SN-peptide(简称pTRG-SNP)；转化随机挑取单菌落 测序，计算库容量可达10^7-8。

至解冻的40μl大肠杆菌XL1-BlueMR甘油感受态细胞中，并于冰上 反复轻柔吹打混匀；

(5)转移步骤(4)中的质粒、感受态细胞混合物至预冷的电转杯中， 轻敲电转杯，使混合物均匀铺满杯底；

(6)擦干电转杯，滑动电转杯至电触头，使其与电极紧密接触；

(7)脉冲电击电转杯后，迅速取出电转杯，加入预热至37℃的SOC 培养基900μl，重悬菌体。

(8)转移菌液至1.5mlEP管，37℃，150rpm孵育2h；

(9)室温或4℃下，2000g离心10min；

(10)小心吸出上清，用1mlM9⁺His-DropoutBroth(提前使其温度 恢复至室温)重悬菌体；

(11)室温或4℃下，2000g离心10min；

(12)小心吸出上清，再用1mlM9⁺His-DropoutBroth重悬菌体；

(13)37℃，150rpm孵育2h；

(14)孵育期间，将筛选平板避光放置于超净台中吹1-1.5h；

(15)将步骤13中的菌体以5000rpm，3min离心，富集至300μl

(16)各取150μl菌液分别涂布于3-AT平板和No-3-AT平板；

(17)37℃倒置避光培养24h后，取出放置于室温避光培养24h。

2、菌落PCR验证

采用pBT载体引物pBT-F5'-TCCGTTGTGGGGAAAGTTATC- 3'；pBT-R5'-GGGTAGCCAGCAGCATCC-3'以及pTRG载体引物 pTRG-F5'-TGGCTGAACAACTGGAAGCT-3'；pTRG-R5' -ATTCGTCGCCCGCCATAA-3'对获得目的菌株进行菌落PCR验证。

①菌落PCR体系：细菌裂解上清1μl，pBT-F和pBT-R各0.5μl， pTRG-F和pTRG-R各0.5μl，2×PCRmix6μl，ddH₂O4μl，总体积13μl。

②菌落PCR程序：94℃3min；94℃30s，50℃45s，72℃1min， 共20个循环；72℃10min。

③1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物。

3、获得与pBT-CaM相互作用的肽适体pTRG-SNP

①获得与pBT-CaM相互作用的pTRG-SNP

(1)挑取3-AT平板中的阳性克隆接种至LB+Cam(25μg/ml) +Ter(12.5μg/ml)双抗平板，37℃，避光倒置培养12h；

(2)将双抗平板上的菌落转接至5mlLB+Ter(12.5μg/ml)液体 培养基，37℃，150rpm震荡培养12h；

(3)收集步骤2中的菌体，利用质粒小量提取试剂盒提取质粒

(4)将步骤3中的质粒通过热激转化转入XL1-BLUEMRF’大 肠杆菌感受态细胞，涂布于LB+Ter(12.5μg/ml)平板，避光倒置过 夜培养；

(5)挑取步骤4中的阳性克隆，分别于LB+Cam(25μg/ml)平 板和LB+Ter(12.5μg/ml)平板上进行划线培养；

(6)选取步骤5中在LB+Cam(25μg/ml)平板不长，但是，在 LB+Ter(12.5μg/ml)平板上能够生长的菌落，接种于5mlLB+Ter (12.5μg/ml)液体培养基，37℃过夜震荡培养；

(7)收集步骤6中的菌液，提质粒，即获得单一的、与pBT-CaM 相互作用的靶标质粒pTRG-SNP。

②菌落PCR验证

采用pBT载体引物pBT-F/pBT-R以及pTRG载体引物pTRG-F对 获得到的包含单质粒pTRG-SNP-MRF’菌株进行菌落PCR验证。

通过上述共转化诱饵质粒pBT-CaM与肽适体文库(pTRG-SNase peptideaptamers，pTRG-SNPs)至XL1-BlueMR感受态细胞，3-AT 平板筛选获得与CaM特异性相互作用的肽适体。将3-AT平板筛选出 的菌落重新划线过夜培养，通过双引物菌落PCR验证，琼脂糖凝胶 电泳结果显示所有阳性克隆均具有两条条带，大小分别为596bp和 759bp，与预期大小相一致，表明均含有两种质粒。经过4次细菌双 杂交实验筛选，共获得目的菌株34株。

4、筛选对稻瘟菌孢子具有抑制功能的肽适体

4.1制备稻瘟菌孢子悬液取若干培养4-5d的稻瘟菌燕麦平 板，用无菌水冲洗平板表面的菌苔，收集冲洗后的液体，经8层纱布 过滤即为孢子悬液。为了保证孢子抑制实验的可靠性，一般通过离心 浓缩控制孢子悬液的浓度达到5×10⁵个/ml。

4.2诱导表达筛选得到的特异性肽适体

(1)从pTRG-SNP-XL1-BLUEMR菌液中提取质粒pTRG-SNP。 采用CaCl2法制备XL1-BLUEMR大肠杆菌感受态细胞。

(2)将获得的pTRG-SNP-XL1-BLUEMR菌挑单菌落至5ml LB+Ter(12.5μg/ml)液体培养基，37℃震荡过夜培养；

(3)次日，以1:1000的比率转接菌液至50mlLB+Ter(12.5μg/ml) 液体培养基；

(4)转接菌液的同时，添加IPTG，使得IPTG终浓度为50μM；

(5)扩大培养3-4h，至菌液OD600达到0.4-0.5；

(6)将菌液分装至50ml离心管，5000rpm，10min，离心收集 菌体。

(7)用无菌水洗一次，收集沉淀，PBS重悬；

(8)超声波破碎：间歇时间3s，超声时间2s，全程30min，温 度4℃

(9)5000rpm，离心10min，收集裂解上清，上清即为SNP蛋 白粗提液。

4.3筛选对稻瘟菌孢子具有抑制功能的肽适体

(1)准备孢子悬液及SNP蛋白粗提液，同时按照制备SNase蛋 白(阴性对照)粗提液。

(2)分别将阴性对照(SNase蛋白粗提液)、阳性对照(0.2％三 环唑溶液)、空白对照(PBS缓冲液)、实验组(SNP蛋白粗提液)与 稻瘟菌孢子悬液等体积混匀点在载玻片上孵育，置于28℃恒温培养 箱内培养。

(3)分别在孵育0h、3h、6h显微观察孢子萌发、芽管生长以及 附着胞的形成过程，并拍照记录。

通过上述以SNase处理组为阴性对照，1％三环唑处理组为阳性对 照，将不同SNP处理组作为实验组，显微观察各组孵育0h、3h、6h 后孢子萌发及芽管形成的差别，从而筛选出对稻瘟菌孢子萌发及芽管 形成具有抑制作用的特异性SNP-D4。

特异性肽适体SNP-D4处理后的稻瘟菌孢子，孵育3h后，其芽管 长度明显短于阴性对照组；孵育6h后，阴性对照组和空白对照组中 均能观察到附着胞，而D4未观察到附着胞的形成。因此D4肽适体 具有抑制稻瘟菌芽管生长和侵染性结构附着胞形成的功能(图2)。

4.4功能性肽适体的序列测定与分析

将筛选得到SNP-D4肽适体，提取质粒，运用pTRG载体引物送 往生工生物工程有限公司进行测序，测序结果显示SNP-D4肽适体的 核苷酸序列为GTCACCTTCCTCGTGAACACCTACCCGAACGGGG TCCAGAGCAGGGCC(SEQIDNO.2)

氨基酸序列为：VTFLVNTYPNGVQSRA(SEQIDNO.1)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。