一种鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用ELISA试剂盒

摘要

本发明公开了一种可鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用AGL-ELISA试剂盒，包括包被8BF蛋白的酶标板和酶标记的重组蛋白[AGL]n，重组蛋白[AGL]n为将金黄色葡萄球菌A蛋白免疫球蛋白结合结构域中B结构域、链球菌蛋白G蛋白免疫球蛋白结合结构域中C2结构域、大消化链球菌蛋白L蛋白免疫球蛋白结合结构域中B3结构域这三种蛋白结构域进行基因优化和串联，形成的多拷贝重组蛋白，n为1、2或3。本发明重组蛋白[AGL]2进行酶标记，酶标记产物经Western-blot、ELISA检测，可与多物哺乳动物免疫球蛋白结合，可作为各种哺乳动物血清学检测中通用抗体，可替代物种特异性抗体，进行多物种共患传染病检测。AGL-ELISA可检测多种动物口蹄疫感染，并能鉴别疫苗免疫和自然感染动物以及持续感染动物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种一种鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用ELISA试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

SPA、SPG、PPL都是典型的免疫球蛋白结合蛋白，可以与人和多种动物免疫球蛋白结合，结合能力和结合谱不同。SpA，SpG和PPL的单结构域已被证实有结合Ig的作用(JanssonBirger,UhlénMathias,NygrenPer.AllindividualdomainsofstaphylococcalproteinAshowFabbinding[J].FEMSImmunology&MedicalMicrobiology,2006,20(1)。先前报道认为SPA只能结合鼠IgG的Fc区域，SPG既能结合Fc区域又能结合Fab区域，并且认为SPA、SPG与Fc的结合位点是重叠的。但是Aybay,C等用木瓜蛋白酶消化鼠IgG后发现两种蛋白结合Fc区域的结合位点是独立的，并不重叠(AybayC.DifferentialbindingcharacteristicsofproteinGandproteinAforFcfragmentsofpapain-digestedmouseIgG[J].IMMUNOLOGYLETTERS,2003,85(PIIS0165-2478(02)00262-63):231-235.)。SPA、SPG与免疫球蛋白的重链结合，相反PPL只与多种哺乳动物Igκ轻链结合，而且只与片段区域的可变区的VκI、VκIII、和VκIV亚基结合而不与重链、Igλ轻链和κ链的C_L区域结合。PPL与人IgA1、A2、D、E、M亚型和大鼠IgG1的结合能力是SPA、SPG所无法比拟的。PPL有5个同源性Ig结合区域(B1-B5)每个区域有72-76个残基。尽管B1结构域初始残基有些无序，它的C末端62个残基形成一个非常牢固的区域(Tm≈70℃)，由一个a螺旋贯穿四个β折叠构成。

根据SPA、SPA、PPL的免疫球蛋白结合区域的特性与互补性，早在1994就有学者选择L蛋白4个重复结构域B1-B4和蛋白G两个IgGFc结合结构域，构建融合蛋白LG，并用来纯化鼠科动物的IgG和IgG片段的单克隆抗体(GSvenssonH.,RHoogenboomH.,U.ProteinLA,anovelhybridproteinwithuniquesingle-chainFvantibody-andFab-bindingproperties.[J].EuropeanJournalofBiochemistry,1999,258(2))，这些融合蛋白高效而且通用，可以作为强有力的结合介质，用来鉴定、纯化抗体和抗体片段。但并未证实融合后的结构域是如何发挥作用，是协同作用还是抑制作用。2008年Yanghua构建了两种单结构域融合的新型免疫球蛋白结合分子PA(A)-PG和PA(A)-PL，对hIgG/hIgG1-Fc和hIgM/hIgA展现出很强的结合能力，经竞争性抑制试验证实PA(A)-PG和PA(A)-PL分子发挥协同结合的优势和结合性能(HuaYang,JieCao,Lian-QingLietal.Evolutionalselectionofacombinatorialphagelibrarydisplayingrandomly-rearrangedvarioussingledomainsofimmunoglobulin(Ig)-bindingproteins(IBPs)withfourkindsofIgmolecules[J].BMCMicrobiology,2008,8(1))。

本发明选金黄色葡萄球菌A蛋白免疫球蛋白结构域中B结构域、链球菌蛋白G蛋白免疫球蛋白结合结构域C2结构域、大消化链球菌蛋白L蛋白免疫球蛋白结合结构域中B3结构域进行基因优化设计，把三种蛋白结构域串联，形成多种拷贝，在大肠杆菌中实现可溶性高效表达，选择表达量高与免疫球蛋白结合能力强的2拷贝体进行酶标记。标记产物经Western-blot、ELISA检测，可与多物哺乳动物免疫球蛋白结合，可作为血清学检测中通用抗体，可替代单一抗体，进行多物种布鲁氏菌检测。改善的AGL-ELISA可检测口蹄疫感染，并能鉴别疫苗免疫和自然感染动物以及持续感染动物。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用ELISA试剂盒，该试剂盒可检测多种动物口蹄疫感染，并能鉴别诊断出疫苗免疫和自然感染动物以及持续感染动物；

本发明第二个目的在于一系列所述重组蛋白[AGL]_n，HRP酶标记的重组蛋白[AGL]₂可以特异地与多种哺乳动物免疫球蛋白反应，并且可以作为第二抗体用于多种动物传染病的血清学检测方法中；

本发明的第三个目的在于提供一种制备所述重组蛋白[AGL]_n的方法；

本发明的第四个目的在于提供所述AGL-ELISA试剂盒在制备检测多种动物共患传染病、非共患传染病以及哺乳动物免疫球蛋白试剂中的应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

一种检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的AGL-ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被8BF蛋白的酶标板和酶标记的重组蛋白[AGL]_n；

其中，所述重组蛋白[AGL]_n为将金黄色葡萄球菌A蛋白免疫球蛋白结构域中B结构域、链球菌蛋白G蛋白免疫球蛋白结合结构域中C2结构域、大消化链球菌蛋白L蛋白免疫球蛋白结合结构域中B3结构域这三种蛋白结构域进行基因优化和串联，形成的多拷贝重组蛋白，n为1、2或3。

在本发明中，优选的，所述的多物种为牛、羊、猪以及鹿；所述的鉴别诊断口蹄疫病毒感染是指通过检测口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)产生的抗体来达到区分疫苗免疫动物与口蹄疫病毒感染动物的目的。

进一步的，本发明提供了所述重组蛋白[AGL]_n的制备方法：

(1)重组蛋白[AGL]_n基因的设计与串联

①选取金黄色葡萄球菌蛋白A的B结构域、链球菌蛋白G的C2结构域和大消化链球菌蛋白L的B3结构域，设计可在大肠杆菌表达系统中高效表达的B-SPA、B-SPG和B-PPL基因序列，并采用重叠延伸PCR方法合成出B-SPA和B-SPG基因，人工合成B-PPL基因，所述B-SPA、B-SPG和B-PPL基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；

②将合成的B-SPA和B-SPG基因分别与pMD18-T载体连接，连接产物转化TG1感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切、PCR鉴定和测序，得到重组质粒pMD18-T-B-SPA和重组质粒pMD18-T-B-SPG；将合成的B-PPL基因与同样用XhoI、BglII酶切的pJWF载体连接，连接产物转化TG1感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切、PCR鉴定和测序，得到重组质粒pJWF-B-PPL；

③重组质粒pMD18-T-B-SPA用BglII和XhoI进行双酶切，酶切产物B-SPA与同样双酶切的pET-30a(+)载体连接，连接产物转化TG1感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切鉴定，得到重组质粒pET-30a(+)-B-SPA；重组质粒pMD18-T-B-SPG用BamHI和XhoI进行双酶切，酶切产物B-SPG与同样双酶切的pET-30a(+)载体连接，连接产物转化TG1感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切鉴定，得到重组质粒pET-30a(+)-B-SPG；

④重组质粒pET-30a(+)-B-SPA用BglII和XhoI进行双酶切，重组质粒pET-30a(+)-B-SPG用BamHI和XhoI进行双酶切，酶切产物B-SPA、B-SPG同时与酶切回收产物pET-30a(+)载体进行连接，连接产物转化TG1感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切鉴定，得到重组质粒pET-30a(+)-B-SPAG；

⑤重组质粒pET-30a(+)-B-SPAG用BamHI和XhoI进行双酶切，重组质粒pJWF-B-PPL用BglII和XhoI进行双酶切，酶切产物B-PPL基因与酶切回收产物pET-30a(+)AG载体进行连接，连接产物转化TG1感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切鉴定，得到重组质粒pET-30a(+)-B-SPPAGL；

⑥重组质粒pET-30a(+)-B-SPPAGL经BglII和XhoI双酶切后回收的带有黏性末端的B-SPPAGL片段，连接在经BamHI和XhoI双酶切pET-30a(+)-B-SPPAGL后回收的黏性末端的载体大片段上，串联为pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n载体；

(2)重组蛋白[AGL]_n的诱导表达

串联表达载体pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n，转化Rosetta(DS3)pLysS感受态细胞，感受态细胞于含浓度为30μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃培养12h后，按照1:100(V/V)的比例转接到含浓度为30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌液OD₆₀₀达到0.4～0.6时，按浓度0.8～1.2mmol/L加入IPTG诱导4～5h，诱导后的菌液4℃5000r/min离20min，收集菌体沉淀；

(3)重组蛋白[AGL]_n的提取与纯化

①每克菌体沉淀用1mLlysisbufferr溶解，反复冻融3次，在冰浴条件下超声波裂解菌体，功率400W，按超声3s，间歇3s的方式进行，超声至菌液不再粘稠为宜。超声后产物4℃条件下5000r/min离心20min，小心吸取上清，上清液用0.45μm滤膜过滤后用于重组蛋白[AGL]_n的纯化；

所述lysisbufferr包含50mmol/LNaH₂PO₄，300mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑，pH8.0；

②重组蛋白[AGL]_n采用亲和层析进行纯化，具体采用NovagenHisPurificationSystem纯化系统进行纯化，得到重组蛋白[AGL]_n。

在本发明中，优选的，步骤(1)重叠延伸PCR方法合成B-SPA的引物为A1、A2、A3和A4，其核苷酸序列如SEQIDNO:6-9所示；重叠延伸PCR方法合成B-SPG的引物为G1、G2、G3和G4，其核苷酸序列如SEQIDNO:10-13所示。

进一步的，本发明提供了当n为2时，重组蛋白[AGL]₂的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；编码所述重组蛋白[AGL]₂的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、封闭液、稀释液、显色液、洗涤液和终止液；所述酶为辣根过氧化物酶；所述口蹄疫病毒非结构蛋白抗体来源于受感染的牛、猪、羊和鹿血清。

在本发明中，优选的，所述阳性对照为成年牛免疫3ABC蛋白后1月采集的血清，3ABC抗体效价为大于1:1024；；所述阴性对照为健康未免疫犊牛血清，经LPBE和NSP蛋白试剂盒检测为阴性；所述封闭液和稀释液均为5％脱脂乳；所述显色液为TMB底物溶液；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述终止液为1MH₂SO₄溶液。

使用所述试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)包被8BF蛋白的酶标板4℃过夜后用洗涤液洗涤，37℃下用封闭液封闭2h，洗板；

(2)加入对照和待测样品，37℃孵育，洗板；

(3)加入酶标记的重组蛋白[AGL]_n，37℃孵育，洗板；

(4)加入显色液，37℃显色，最后加终止液终止反应，测定OD_450nm值。

在本发明的一个具体实施例中，优选的，所述的试剂盒包括：

酶标板：由8BF蛋白包被；

酶标记的重组蛋白[AGL]₂：辣根过氧化酶标记的重组蛋白[AGL]₂；

稀释液：5％脱脂乳；

封闭液：5％脱脂乳；

洗涤液：PBST缓冲液；

阳性对照：成年牛免疫3ABC蛋白后1月采集的血清，3ABC抗体效价为大于1:1024；；

阴性对照：健康未免疫犊牛血清，经LPBE和NSP(非结构蛋白)试剂盒检测为阴性；

显色液：TMB底物溶液；

终止液：1MH₂SO₄溶液。

为了确定出最佳反应条件，本发明在不同反应条件下，对包被缓冲液、封闭液、血清稀释液及酶标记的重组蛋白[AGL]_n稀释液进行优化，以P/N值高低为评价指标，确定它们的种类；对8BF抗原和酶标记的重组蛋白[AGL]_n分别系列稀释后做方阵滴定，以P/N值高低为评价指标，确定它们的最佳使用浓度；然后固定8BF抗原及酶标记的重组蛋白[AGL]_n的使用浓度分别检测待测样品和对照(5min、10min、15min、30min、45min和60min)、酶标记的重组蛋白[AGL]_n(5min、10min、20min、30min、45min和60min)、封闭液(3min、5min、10min、15min、20min和30min)不同孵育时间对检测效果的影响，选取P/N值较高者作为最佳的孵育时间。经试验确定包被缓冲液为0.01MNaOH溶液，封闭液、血清稀释液和酶标记的重组蛋白[AGL]_n稀释液均为5％脱脂乳，8BF抗原包被稀释倍数为1:320，酶标记的重组蛋白[AGL]_n的使用浓度为1:8000，对照和待测样品、酶标记的重组蛋白[AGL]_n及显色液的作用时间分别为30min、30min和5min。

在本发明中，优选的，所述对照包括阳性对照和阴性对照，阳性对照为成年牛免疫3ABC蛋白后1月采集的血清，3ABC抗体效价为大于1:1024；；阴性对照为健康未免疫犊牛血清，经LPBE和NSP(非结构蛋白)试剂盒检测为阴性；所述封闭液为5％脱脂乳；所述显色液为TMB底物溶液；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述终止液为1MH₂SO₄溶液；所述酶为辣根过氧化酶。

本发明[AGL]₂-HRP可应用于多种与哺乳动物免疫球蛋白检测相关的研究，例如用于多抗效价的测定(牛干扰素α多克隆抗体的检测)、非共患传染病的检测(牛病毒性腹泻)、多种动物共患传染病的检测(口蹄疫病、布鲁氏菌病)。[AGL]₂-HRP应用于布鲁氏菌病间接ELISA，通过检测118份犬血清，86份鹿血清，90份猪血清，87份羊血清，证实与国际标准检测方法结果一致。[AGL]₂-HRP用于检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体，与国际标准方法的符合率达到97.83％。口蹄疫检测结果证实，[AGL]₂-HRP可准确、特异的检测牛、猪、羊、鹿口蹄疫感染抗体。

因此，更进一步的，本发明提供了所述试剂盒在检测多种动物共患传染病、非共患传染病以及哺乳动物免疫球蛋白试剂中的应用。

在本发明中，优选的，所述的多种动物共患传染病为口蹄疫病或布鲁氏菌病，所述的非共患传染病为牛病毒性腹泻。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1.蛋白构造上，[AGL]_n蛋白为多拷贝化的重组蛋白，其是包括3种免疫球蛋白结合结构域的串联重复体，以往技术发明只包括SPA、SPG、PPL中的1种或2种结构域，或者活性片段为单拷贝。

2.[AGL]_n蛋白可特异结合牛、羊、猪、鹿、犬、鼠、人等物种的免疫球蛋白，结合免疫球蛋白速度与结合谱优于以住蛋白，可作为检测多种动物免疫球蛋白的通用结合物，用以替代物种特异性抗体(例如抗牛抗体、抗羊抗体等)，尤其在该物种(例如鹿、虎、狐、貂)缺乏商品化抗体检测试剂的情况下更为优越。

3.[AGL]_n蛋白，特别是[AGL]₂蛋白，标记后可用于多种动物共患传染病的检测(口蹄疫病、布鲁氏菌病等)，构建多物种通用检测试剂盒。例如，可感染多种动物(牛、羊、猪、鹿、骆驼等)的口蹄疫的检测，通常要分别制备适用于各个动物的检测试剂盒，非常繁琐。但使用[AGL]₂，组装一种试剂盒即可用于多个物种，大大减化了研究与制备成本。

附图说明

图1为B-PPL优化前后密码子使用频率图；

图2为改造前后的蛋白LB3结构域RNAstructure分析图；

图3为B-SPA，B-SPG基因的合成结果图，其中1：B-SPA基因SOE-PCR结果，2：B-SPG基因SOE-PCR结果，M：DNAMarkerDL2000；

图4为重组克隆载体pET-30a(+)-B-SPA,pET-30a(+)-B-SPG的酶切鉴定图，其中M：Trans2KplusⅡDNAMarker，1：pET-30a(+)-B-SPAXhoⅠ单酶切，2：pET-30a(+)-B-SPAXhoⅠ和BglⅡ双酶切，3：pET-30a(+)-B-SPGXhoⅠ单酶切，4：pET-30a(+)-B-SPGXhoⅠ和BglⅡ双酶切；

图5为重组质粒pJWF-PPL的酶切鉴定图，其中M：DNAMarker；1：pJWF-PPLXhoΙ单酶切，2：pJWF-PPLXhoΙ和BglⅡ双酶切；

图6为图3-3pET-30a(+)-B-SPAG的酶切鉴定图，其中M：Trans2KplusⅡDNAMarker，1：pET-30a(+)-B-SPAGXhoⅠ单酶切，2：pET-30a(+)-B-SPAGXhoⅠ和BglⅡ双酶切；

图7为pET-30a(+)-B-SPPAGL的酶切鉴定图，其中M：DNAMarker；1：pET-30a(+)-B-SPPAGLXhoΙ单酶切，2：pET-30a(+)-B-SPPAGLXhoΙ和BglⅡ双酶切；

图8为AGL基因的信息学特征图；

图9为串联AGL基因表达载体pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n的鉴定图，其中M：Trans2KplusⅡDNAMarker；2、3、5、7：pET-30a(+)-BB-pPL、pET-30a(+)-B-SPPAGL、pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₂、pET-30a(+)-BB-SP[AGL]₃XhoI单酶切；1、4、6、8：pET-30a(+)-B-PPL、pET-30a(+)-B-SPPAGL、pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₂、pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₃XhoI和BglⅡ双酶切；

图10为串联AGL基因表达载体pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n的超声处理后的SDS-PAGE分析图，其中M：蛋白质分子质量标准；1,6,10,14分别对应L.AGL,(AGL)₂,(AGL)₃蛋白诱导表达前全菌体；2,7,11,15分别对应L,AGL,(AGL)₂,(AGL)₃蛋白诱导表达后全菌体；3,8,12,16分别对应L,AGL,(AGL)₂,(AGL)₃蛋白超声后沉淀；4,9,13,17分别对应L,AGL,(AGL)₂,(AGL)₃蛋白超声后上清；5,18分别对应pET32a-Rosstta空载体诱导表达；

图11为重组蛋白L、[AGL]_n的纯化图，其中M：蛋白质分子质量标准；1-5.L、AGL、[AGL]₂、[AGL]₃蛋白纯化结果；

图12为纯化的[AGL]_n蛋白WesternBlot检测结果图，其中2,3,4分别对应纯化后AGL、[AGL]₂、[AGL]₃蛋白WesternBlot检测结果，1对应pET30a阴性对照蛋白；

图13为[AGL]₂蛋白与多种IgG的WesternBlot检测结果图，其中A-M.WesternMarker，B-MEasySeeWesternBlotMarker，1-人IgG，2-猪IgG，3-山羊IgG，4-兔IgG，5-豚鼠IgG，6-空白对照，7-小鼠IgG，8-鸡IgY，9-鹅IgY，10-pET30a空载体对照；

图14为[AGL]₂和[AG]₃两种蛋白的结合免疫球蛋白能力的比较图；

图15为HRP标记[AGL]₂蛋白SDS–PAGE电泳图，其中M，BlueblusIIMarker；1.纯化后的[AGL]₂蛋白；2,HRP标记后[AGL]₂蛋白；3,辣根过氧化物酶；

图16为酶标蛋白活性测定图；

图17为酶标蛋白与动物免疫球蛋白Dot-ELISA结果图，其中A1-A5：人IgM，人IgG，人IgA，兔IgG，猪IgG；B1-B5：小鼠IgG，豚鼠IgG，山羊IgG，鸡IgY，鹿IgG；

图18为酶标蛋白与多物种免疫球蛋白结合活性的比较分析结果图；

图19为两种酶标蛋白活性的比较分析结果图；

图20为两种酶标物检测BoIFN-α蛋白的WesternBlot结果图；其中1-BoIFN-α蛋白，2-pPIZαA空载体蛋白，M-WesternBlotEasySEEMarker；

图21为牛、猪、羊、鹿血清S/P平均值(X)分布图；其中A:牛血清，B:猪血清，C:羊血清，D:鹿血清。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1重组蛋白[AGL]_n基因的设计和串联

1、材料和方法

1.1材料

重组质粒pET-30a-8BF、表达载体pET-30a(+)、大肠杆菌感受态细胞TG1及Rosetta(DE3)PlysS均由本实验室保存；克隆载体pJWF购于北京六合华大基因科技股份有限公司，克隆载体pMD18-T购于宝生物工程(大连)有限公司；目的蛋白表达菌株BL21-pET-30a-8BF以及空载体对照菌株BL21-pET-30a均由本实验室制备并保存。限制性内切酶BamHI、XhoI、BglII和T4DNA多聚核酸激酶(T4PNK)均购自宝生物工程(大连)有限公司；T4DNA连接酶购自NewEnglandBioLabs(NEB)。

1.2实验方法

1.2.1用于合成B-SPA、B-SPG和B-PPL基因的寡聚核苷酸链设计

分析文献中鉴别出的金黄色葡萄球菌蛋白A的5个免疫球蛋白结合结构域，从中选取B结构域基因进行设计优化，而对于链球菌蛋白G的3个免疫球蛋白结合结构域，从中选取C2结构域为设计优化对象，对于大消化链球菌蛋白L的5个免疫球蛋白结合结构域，选取大消化链球菌蛋白L的B3结构域为设计优化对象。

参考大肠杆菌密码子利用表，利用DnastarLasergene7.1和SyntheticGeneDesigner进行反向翻译，在不改变参考氨基酸序列的前提下尽量综合考虑密码子偏好性、密码子对及mRNA二级结构等与大肠杆菌基因表达相关的因素，将参考表位的核苷酸序列密码子改为大肠杆菌利用率最高或较高的密码子。利用RNA二级结构预测软件RNAstructure4.5进行调整，使此设计的基因mRNA自由能尽量降低、二级结构尽可能减少，最终获得密码子优化基因序列B-SPA、B-SPG和B-PPL。

利用PrimerPremier5软件分别设计4条相互重叠的寡聚核苷酸片段A1、A2、A3、A4(表1)，G1、G2、G3、G4(表2)，采用重叠延伸PCR(genesplicingbyoverlapextension；SOE-PCR)技术(Horton,1989；Xiong,2004)进行合成优化基因B-SPA、B-SPG，并委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成B-PPL基因(表3)。

表14条寡聚核苷酸片段及优化后B-SPA

表24条寡聚核苷酸片段及优化后B-SPG

表3优化后B-PPL

1.2.2SOE-PCR法合成密码子优化基因B-SPA、B-SPG和B-PPL

1.人工合成B-SPA

将4条寡聚核苷酸片段用去离子水稀释后作为模板和引物，采用SOE-PCR经两步合成B-SPA。

B-SPA基因合成第一步体系：

反应条件为：

将反应后的两份产物各取10μl混合，按上述反应条件进行PCR。

B-SPA基因合成第二步：

将最终反应液取出1μl作为目的基因模板，以A1，A4为引物进行PCR扩增。体系及反应条件如下：

反应条件：

2.人工合成B-SPG

SPG的合成方法同SPA的合成，但第一步的退火温度为60℃，第二步的退火温度为60℃。

首次扩增目的基因SPA产物较特异，直接用于回收；SPG特异性较差，需进行优化。

SPG优化：对起始浓度分别进行1:10和1:50倍稀释产物较特异，可用于直接回收。

3.人工合成B-PPL

委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成B-PPL基因。

1.2.3克隆载体pET-30a(+)-B-SPAG构建及序列测定

1.2.3.1B-SPA、B-SPG基因片段的纯化

1.5％琼脂糖凝胶分别回收第二次PCR产物中159bp的B-SPA条带和174bp的B-SPG条带，应用上海华舜生物工程有限公司的销量胶回收试剂盒进行纯化，操作按说明书进行。B-SPA基因与同样用BglII和XhoI酶切的pMD18-T载体16℃连接过夜，重组质粒命名为pMD18-T-B-SPA，B-SPG基因与同样用BamHI和XhoI酶切的pMD18-T载体16℃连接过夜，重组质粒命名为pMD18-T-B-SPG。上述重组质粒转化到感受态TG1中。待菌落长出后，挑取菌落于含有氨苄青霉素的新鲜的LB液体培养基，37℃振荡培养箱中培养过夜，碱裂解法小剂量制备重组质粒。对于重组质粒pMD18-T-B-SPA进行XhoI单酶切，BglII和XhoI双酶切鉴定，并以重组质粒pMD18-T-B-SPA为模板，利用寡聚核苷酸A1、A4为引物进行PCR鉴定。酶切产物和PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切产物和PCR产物片段大小。

对于重组质粒pMD18-T-B-SPG进行XhoI单酶切，BamHI和XhoI双酶切鉴定，并以重组质粒pMD18-T-B-SPG为模板，利用寡聚核苷酸G1、G4为引物进行PCR鉴定。酶切产物和PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切产物和PCR产物片段大小。

重组质粒pMD18-T-B-SPA和pMD18-T-B-SPG分别经单、双酶切和PCR鉴定后，将阳性重组子进行测序(由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)。

1.2.3.2串联SPAG基因载体pET-30a(+)-B-SP[AG]n的构建

a克隆载体pET-30a(+)-B-SPA构建

相同黏性末端B-SPA基因和载体pET-30a(+)的制备：

重组质粒pMD18-T-B-SPA和载体pET-30a(+)用BglII和XhoI进行双酶切，放于16℃金属浴连接过夜。转化到感受态TG1中。待菌落长出后，挑取菌落于含有氨苄青霉素的新鲜的LB液体培养基，37℃振荡培养箱中培养过夜，碱裂解法小剂量制备重组质粒。对于重组质粒进行XhoI单酶切，BglII和XhoI双酶切鉴定。进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切产物片段大小。

b克隆载体pET-30a(+)-B-SPG构建

克隆载体pET-30a(+)-B-SPG构建方法与pET-30a(+)-B-SPA相似。

重组质粒分别经单、双酶切鉴定后，阳性重组子分别命名为pET-30a(+)-B-SPA、pET-30a(+)-B-SPG，存于-20℃保存。

c克隆载体pET-30a(+)-B-SPAG构建

(1)黏性末端B-SPG基因和载体pET-30a(+)-B-SPA的制备

重组质粒pET-30a(+)-B-SPG用BamHI和XhoI进行双酶切，取酶切产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果。对目的片段进行回收，回收产物存于-20℃。

重组质粒pET-30a(+)-B-SPA用BglII和XhoI进行双酶切，取酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果。对目的片段进行回收，回收产物存于-20℃。

(2)B-SPA基因和载体pET-30a(+)的连接

由于BglII与BamHI两种限制性内切酶属于同尾酶，进行酶切反应时可以产生相同的黏性末端，所以产物可以进行连接。两种回收产物放于16℃金属浴连接过夜。

(3)连接产物转化TG1感受态和质粒提取

连接产物转化TG1感受态和质粒提取参照《分子克隆实验指南》进行。

(4)重组质粒pET-30a(+)-B-SPAG的鉴定

对于重组质粒进行XhoI单酶切，BglII和XhoI双酶切鉴定。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切产物片段大小。

1.2.4串联SPPAGL基因载体pET-30a(+)-B-SPP[AGL]n的构建

1.2.4.1B-PPL基因片段的纯化

委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成B-PPL基因片段，所用载体为pJWF。pJWF载体是按照本发明发明人的要求由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。pJWF载体的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示。将合成的B-PPL基因与同样用XhoI、BglII酶切的pJWF载体连接，连接产物转化TG1感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切、PCR鉴定和测序，得到重组质粒pJWF-B-PPL。对于重组质粒pJWF-B-PPL进行XhoI单酶切，BglII和XhoI双酶切鉴定。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切产物片段大小。

1.2.4.2克隆载体pET-30a(+)-B-SPPAGL构建

(1)蛋白LB3结构域和载体pET-30a(+)-B-SPAG粘性末端的制备

重组质粒pJWF-B-PPL用BglII和XhoI进行双酶切，取酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果。对目的片段进行回收，回收产物存于-20℃。

重组质粒pET-30a(+)-B-SPAG用BamHI和XhoI进行双酶切，取酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果。对目的片段进行回收，回收产物存于-20℃。

(2)B-PPL基因和载体pET-30a(+)AG的连接

BglII与BamHI酶切后产生相同的黏性末端，所以产物可以进行连接。两种回收产物于16℃金属浴连接12～14小时。

(3)连接产物转化TG1感受态和质粒提取

连接产物转化TG1感受态和质粒提取参照《分子克隆实验指南》进行。

(4)重组质粒pET-30a(+)-B-SPPAGL的鉴定

对于重组质粒进行XhoI单酶切，BamHI和XhoI双酶切鉴定。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切产物片段大小。

2、实验结果

2.1重组克隆载体pET-30a(+)-B-SPPAGL的构建

2.1.1B-SPA、B-SPG、B-PPL多肽的基因优化

设计利用氨基酸密码子的简并性进行同义改造，B-SPA、B-SPG两种序列自由能增大，密码子适应性指数升高，稳定的二级结构被打开使转录更易进行，并且消除了序列中的AT富含区，使GC含量较为均衡(45.36％和50.30％)，优化后的B-PPL序列自由能减小，CAI升高，二级结构打开后转录更容易进行，并且消除了序列中的AT富含区，使GC含量较为均衡(47.64％)(见表4)，mRNA的二级结构得到优化，增大基因B-SPA密码子使用频率，从而提高表达效率。mRNA的二级结构得到优化，增大基因B-PPL密码子使用频率，从而提高表达效率。B-PPL优化前后密码子使用频率的比较见图1，改造前后的蛋白LB3结构域RNAstructure分析见图2。

表4基因优化前后表达量影响因素的比对

2.1.2SOE-PCR人工合成B-SPA，B-SPG和B-PPL基因

分别将4寡聚核苷酸片段进行SOE-PCR人工合成B-SPA、B-SPG和B-PPL基因，经1.5％琼脂糖电泳分析显示：在100-250bp之间出现了特异的基因条带，大小与预期B-SPA(159bp)、B-SPG(174bp)一致，如图3所示。B-PPL基因条带大小为264bp。

2.1.3重组克隆载体pET-30a(+)-B-SPA，pET-30a(+)-B-SPG构建及序列测定

重组质粒pET-30a(+)-B-SPA，pET-30a(+)-B-SPG经XhoI单酶切，出现了约5400bp的基因片段；经BglⅡ和XhoI双酶切，都分别出现了约210bp左右的目的基因和约5400bp的pET-30a(+)载体大片段，出现与预期大小一致的基因带，见图4。

将鉴定为阳性的重组质粒送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，序列测定显示B-SPA基因(159bp)和B-SPG(174bp)碱基无突变，人工合成结果与设计相符，并且两基因成功克隆到载体pET-30a(+)的BglⅡ和XhoⅠ位点。

2.1.4重组质粒pJWF-PPL的鉴定

pJWF-PPL重组质粒经XhoΙ单酶切，出现了约3007bp的基因片段；BglII和XhoΙ双酶切后，出现了两条带，一条约为260bp，另一条约2800bp，与预期大小一致，见图5。

2.1.5重组克隆载体pET-30a(+)-B-SPAG构建

重组质粒pET-30a(+)-B-SPAG经XhoI单酶切，出现了约5400bp的基因片段；经BglII/XhoI双酶切，分别出现了373bp的目的基因片段和约5400bp的pET-30a(+)载体大片段，见图6。证实B-SPA、B-SPG基因成功利用同尾酶BglII和BamHI在载体pET-30a(+)上相连。

2.1.6重组克隆载体pET-30a(+)-B-SPPAGL构建

pET-30a(+)-B-SPPAGL重组质粒经XhoI单酶切，出现了约6139bp的基因片段；BglII和XhoI双酶切，出现了两条带，一条为717bp，另一条约5400bp，与预期大小一致，见图7。证实B-PPL基因成功利用同尾酶BglII和BamHI相连在载体pET-30a(+)AG上。

本发明选择三种免疫球蛋白结合分子单个结构域进行化设计，串联表达技术把三种蛋白单独结构域融合在一起。为让各结构域独立发挥免疫结合能力，发挥协同作用，也防止目的片段被酶切和拼接后可能引起的蛋白质生物学特性变化，所以在L结构域两端分别加入蛋白L结构域天然间隔肽序列SKEKTPEEPKEE和蛋白A结构域天然间隔肽序列QAPKADNKGSKF。因为两种间隔肽有良好的柔韧性和折叠性，同时具有高度亲水性，又是结合蛋白本身所含有的氨基酸序列(如图8A、B所示)，既保证了单联蛋白的生化特性，又确保各结构域形成各自的天然高级构象。

通过对构建好的AGL蛋白单独结构域串联基因的生物信息学分析(DNAStar软件)发现，90％以上的串联蛋白氨基酸显示出良好的亲水性，表明选择的区域为免疫球蛋白结合区域，容易形成亲水性好、暴露于蛋白高级结构外层的免疫球蛋白结合部位，而且串联蛋白的柔性和折叠性也较好，与免疫球蛋白结合部位有突出分子表面部位的可能性(如图8C所示)。由于利用同尾酶原理，AGL蛋白前段即蛋白A结构域与载体连接部位包含50个pET-30a(+)载体氨基酸序列，经DNAStar软件分析，这部分氨基酸有良好的亲水性和折叠性，在多拷贝串联时可作为间隔肽，确保串联的结构域能够独立发挥作用。综合上述分析，表明构建各个表位片段选择合理，串联基因构建成功。

实施例2重组蛋白[AGL]_n的原核表达与鉴定

1、材料和方法

1.1材料

氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)购自Sigma公司；小量胶回收试剂盒(GelExtractionMiniKit)、硝酸纤维素膜(NC膜)购于上海华舜生物工程有限公司；蛋白纯化试剂盒Ni-NTAHisHindPurificationSystem试剂盒购自Qiagen公司；EasySeeWesternBlotKit和WesternMarker购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1B-SPPAGL基因串联载体pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n的构建

pET-30a(+)-B-SPPAGL上的B-SPPAGL基因，设计时在首尾两端添加便于串联基因的XhoI、BglII和BamHI酶酶切位点的核苷酸序列，其中BglII和BamHI互为同尾酶，pET-30a(+)-B-SPPAGL序列经BglII和XhoI双酶切后回收的带有黏性末端的B-SPPAGL片段，可以连接在经BamHI和XhoI双酶切pET-30a(+)-B-SPPAGL后回收的黏性末端的载体大片段上，串联为pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₂载体，pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₂载体中的B-SPP[AGL]₂基因片段与B-SPPAGL基因具有相同的酶切位点，因此参照相同的串联方式，可以串联成n为任意整数的pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n载体。本发明共构建了pET-30a(+)-B-SPP[AGL]、pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₂、pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₃三种串联载体。各重组质粒转化至大肠杆菌TG1感受态细胞并进行质粒提取，参照《分子克隆实验指南》进行，并进行XhoI单酶切，BglII和XhoI双酶切鉴定。鉴定为阳性的重组质粒和菌液存于-20℃。

1.2.2[AGL]_n蛋白的原核表达

1.2.2.1串联表达载体pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n的构建

本实施例1.2.1中构建的3种pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n串联载体的AGL基因都插在pET-30a(+)的BglII与XhoI位点之间，为防止出现基因移码，再次利用同尾酶原理构建pET-30a(+)-B-PPL、pET-30a(+)–B-SPPAGL、pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₂、pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₃四种表达载体。

1.2.2.2pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n质粒转化Rosetta(DS3)pLysS感受态细胞

将质粒转化入Rosetta感受态细胞中，转化步骤参照《分子克隆实验指南》进行。

1.2.2.3重组蛋白[AGL]_n的诱导表达

将含有pET-30a(+)-B-PPL、pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n质粒的菌液和pET-30a(+)空载体质粒的菌液分别接种于5mlLB培养基中(含有卡那霉素30μg/mL)，37℃恒温振荡培养12h。取2ml接种于200mlLB培养基中(含有卡那霉素30μg/mL)，培养至菌液OD_600nm约为0.5时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG进行诱导表达，测定诱导5h后诱导后的菌液4℃5000r/min离20min，收集菌体沉淀留做SDS-PAGE分析。

1.2.2.4诱导菌的SDS-PAGE分析

用适量PBS重悬菌体，变性处理:菌液:2XSDS:DTT＝5:4:1，100℃水浴裂解处理10min，《参照分子克隆指南》第三版中SDS-PAGE制胶方法，采用12％分离胶进行电泳分析。

1.2.2.5目的蛋白表达的可溶性检测

每克菌体沉淀用1mLlysisbufferr(50mmol/LNaH₂PO₄，300mmol/LNaCl，10mmol/Limidazole(咪唑)，pH8.0)溶解，反复冻融3次，在冰浴条件下超声波裂解菌体，功率400W，按超声3s，间歇3s的方式进行，超声至菌液不再粘稠为宜。超声后产物4℃条件下5000r/min离心20min，小心吸取上清，上清液用0.45μm滤膜过滤后用于重组蛋白[AGL]₂的纯化；

样品处理后各取10μL跑蛋白电泳，考马斯亮蓝染色，检测目的蛋白的表达形式，是可溶性表达还是包涵体表达。

1.2.2.6重组蛋白[AGL]_n的亲和层析纯化

对重组蛋白[AGL]_n蛋白采用NovagenHisPurificationSystem纯化系统进行纯化，方法参照说明书进行。

收集本实施例1.2.2.4的大量诱导200mL重组菌pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n上清，用0.45μm滤膜过滤后用于蛋白的纯化。具体方法如下：

再生Ni-NTA柱，用lysisbuffer洗涤柱子，2mL/次，洗涤两次。将过滤后的菌液裂解上清加入到Ni-NTA柱中，旋转结合，旋转1min，至冰浴中3min，反复操作45min，收集流出液1ml；分别用2mLWashbuffe洗柱10次，收集少量流出液；用1.5mLElutionbuffer洗脱目的蛋白四次，收集全部的洗脱液。收集的液体均进行SDS-PAGE分析。

1.2.3重组蛋白[AGL]_n免疫球蛋白结合活性的鉴定

1.2.3.1重组蛋白[AGL]_n结合力鉴定

以选取的3种重组蛋白为被检抗原，pET-30a空载体蛋白为阴性参照；用5％脱脂乳1:200稀释牛血清；兔抗牛IgG-HRP为第二抗体，参照《免疫学常用实验方法》进行WesternBlot操作。

1.2.3.2重组[AGL]_n和[AG]_n蛋白与免疫球蛋白结合能力的比较

用0.01MNaOH作为包被缓冲液，包被人IgG、人IgA、人IgM、山羊IgG、兔IgG、豚鼠IgG、小鼠IgG、猪IgG、鹿IgG、鸡IgY至ELISA反应板上，1ug/孔，pET-30a(+)空载体为阴性对照，4℃过夜，洗板，拍干残余液体，用5％脱脂乳37℃封闭2h，洗板，加相同物质的量的[AGL]₂和[AG]₃蛋白(确保两种蛋白分子个数、结构域个数大致相等)，37℃作用1h，洗板，拍干残余液体，加入二抗HRP标记鹅免疫球蛋白λ轻链单克隆抗体，37℃作用1h，洗板，拍干残余液体，加入TMB底物溶液，室温10分钟，用1MH₂SO₄终止反应，酶标仪读OD_450nm值。

1.2.3.3HRP标记[AGL]₂蛋白及其活性测定

本研究采用的是过碘酸钠法，取4mg辣根过氧化氢酶(HRP)溶于1mL去离子水中，加入400μL新制备的NaOI₄(0.1mol/L)室温震荡20min。将反应物于pH＝4.4的醋酸钠缓冲液(0.001mol/L)中透析过夜。加入6mg[AGL]₂重组蛋白，用0.2mol/L的碳酸钠缓冲液(PH9.5)调节溶液pH值至9.0-9.5之间。立即加入200μL新制备的NaBH₄(5mg/ml)4℃2h。标记物的纯化采用饱和硫酸铵盐析法：将制备好的酶结合物中缓慢滴加等体积的饱和硫酸铵，边加边搅拌，4℃沉淀30min，5000rpm离心15min，沉淀用适量的PBS溶解并加入等体积的甘油，-20℃保存。

酶标蛋白活性的测定选用ELISA法：牛IgG及阴性对照牛IFN-α蛋白，1μg/孔包被于ELISA板，HRP标记的[AGL]₂蛋白用PBST以1:200开始倍比稀释至1:256000倍，具体步骤参照本实施例1.2.3.2。

2实验结果

2.1[AGL]_n蛋白的表达

2.1.1串联AGL基因表达载体pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n的构建

为了防止本实施例1.2.1构建的3种pET-30a(+)-B-SPP[AGL]_n串联载体由于移码而导致表达错误，因此利用同尾酶原理把[AGL]_n基因连接到用BamHI与XhoI双酶切后的pET-30a(+)载体上，以此方式共构pET-30a(+)-B-PPL、pET-30a(+)–B–SPP[AGL]、pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₂、pET-30a(+)-B-SPP[AGL]₃4种基因读码正确的表达载体，经XhoI单酶切，BglⅡ和XhoI双酶切，出现了目的基因和约5400bp的pET-30a(+)载体大片段，见图9。证实[AGL]_n基因成功地克隆到了载体pET-30a(+)的BglⅡ和XhoI位点。

2.1.2重组蛋白[AGL]_n的诱导表达与纯化

结果如图10所示，与空载体菌pET-30a(+)/Rosetta相比，4种重组菌L/Rosetta、AGL/Rosetta、[AGL]₂/Rosetta、[AGL]₃/Rosetta在约19.1ku、34.2ku、59.1ku、83.9ku的位置出现了目的蛋白表达带。经过凝胶成像系统软件扫描分析，目的蛋白占总菌体的百分比最高的为[AGL]₂/Rosetta(36.2％)。对4种菌液进行表达形式分析，结果均完全为可溶性表达。选取表达量相对较大的重组菌株(AGL/Rosetta、[AGL]2/Rosetta、[AGL]3/Rosetta)在正常条件下经过Ni-NTA纯化，出现单一目的条带，如图11所示。

2.1.3重组蛋白[AGL]_n的WesternBolt鉴定结果

纯化后的AGL、[AGL]₂、[AGL]₃重组蛋白进行WesternBlot检测，结果如图12所示。结果证实[AGL]_n蛋白(AGL、[AGL]₂、[AGL]₃)与牛血清间具有良好的反应性，其中AGL反应性最弱，[AGL]₂、[AGL]₃相当。WesternBlot分析[AGL]₂重组蛋白与多种动物免疫球蛋白的反应性，结果显示[AGL]₂蛋白与人IgG，猪IgG，山羊IgG，兔IgG，豚鼠IgG，小鼠IgG有很好地结合能力，不与鸡IgY反应(见图13)。

[AGL]₂蛋白和[AG]₃蛋白在摩尔数相同的情况下，分子结构域数量也相同，两种蛋白与包被量相同的各物种免疫球蛋白(1μg/孔)反应，间接ELISA结果如图14所示，初步判定[AGL]₂蛋白结合免疫球蛋白能力强于[AG]₃蛋白。

实施例3酶标记蛋白与多种动物Ig结合活性分析与应用

1、材料和方法

1.1材料

3、3,5、5-四甲基联苯胺(TMB)、兔抗牛IgG辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体和山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体购自Sigma公司；布鲁氏杆菌抗体快速检测测试盒和布鲁氏菌快速检测试纸条购自韩国安捷公司；WesternMarker购自北京全式金生物技术有限公司；3ABC抗体检测ELISA试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所；HumanIgM、HumanIgA购自北京博胜经纬科技有限公司；山羊IgG、猪IgG、豚鼠IgG人IgG、兔IgG、小鼠IgG均购自万华士(北京)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1HRP标记[AGL]₂蛋白与多种动物IgDot-ELISA试验分析

IgG、人IgA、人IgM、山羊IgG、兔IgG、豚鼠IgG、小鼠IgG、猪IgG、鹿IgG、鸡IgY为被检抗原，具体操作：(1)取适当大小NC膜，用铅笔画或使用点膜器制备直径5mm的加样孔，并作好相应标记。(2)将NC膜浸入到0.01mol/LpH7.4的PBS中15-30min，取出用滤纸吸干。(3)将1μL牛IgG、兔IgG、山羊IgG、猪IgG、人IgG、豚鼠IgG、人IgM、人IgA分别点加于加样孔内，室温干燥。(4)将NC膜浸入封闭液中振摇封闭30min。(5)将NC膜浸入洗涤液中振荡洗涤3次，每次5min，取出用滤纸吸干。(6)将NC膜浸入稀释好的酶标抗体溶液中，振摇反应30min。(7)重复步骤5。(8)将NC膜浸入底物溶液中，振摇显色10-20min。(9)用流水冲洗数分钟，放入蒸馏水中终止反应。判定标准根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量：斑点呈褐色为+，无色为-。

1.2.2HRP标记[AGL]₂蛋白与多种Ig结合力的比较

采用直接ELISA方法比较酶标蛋白的结合活性，分别包被0.1μg、1μg的不同动物的IgG，酶标蛋白1:8000稀释，具体方法参见实施例2中的1.2.3.2。

1.2.3[AGL]₂与[AG]₄两种酶标蛋白活性的比较

(1)以人IgG为被检抗原，包被、封闭同实施例2中的1.2.3.2，分别加入倍比稀释的两种酶标蛋白(1:1000起)，稀释至1:128000，每个梯度做4个重复，37℃作用1h，显色，酶标仪读数OD_450nm。

(2)选择两种酶标蛋白OD_450nm相等的稀释梯度，并以此稀释度作用梯度稀释包被的人IgM，人IgA(1μg/孔～2^-7x1μg/孔)，ELISA步骤同上。

(3)选择两种酶标蛋白OD_450nm相等的稀释梯度，并以此稀释度作用包被好的人IgG，作用时间设为5min，10min，20min，25min，30min，ELISA步骤同上。

1.2.4酶标蛋白应用于检测BoIFN-α多克隆抗体

以兔抗BoIFN-αA多克隆抗体为被检抗原，pET-30a空载体蛋白为阴性参照；参照2.2.4.1方法进行WesternBlot操作，兔血清为一抗；1:8000稀释[AGL]₂-HRP、1:5000稀释山羊抗兔IgG-HRP，最后用ECL显色系统进行显色，比较两种酶标抗体的活性及特异性。

1.2.5酶标蛋白应用于布鲁氏菌和BVDV临床样品检测

先用布鲁氏菌快速间接ELISA试剂盒对实验室现存88份牛血清进行布鲁氏菌血清抗体检测，HRP标兔抗牛IgG1:1295稀释，[AGL]₂-HRP以1:8000稀释，应用快速间接ELISA试剂盒对检测过的88份血清进行再次检测，对检测结果进行分析，来比较两种酶标抗体的性能的差异。对实验室保存的122份犬血清、88份猪血清、92份羊血清、86份鹿血清用布鲁氏菌快速间接ELISA检测，步骤按实际和说明书。

用NS3-ELISA试剂盒对本实验室保存的92份牛血清进行BVDV血清抗体检测，Thermo商品化AG二抗滴度为1:8000。再用标记好的[AGL]₂蛋白以1:8000的滴度替代Thermo商品化二抗，应用NS3-ELISA检测，分析检测结果，比较两种酶标物性能的差异。

2实验结果

2.1酶标蛋白的制备与鉴定

2.1.1重组蛋白[AGL]₂标记

标记产物和HRP以及[AGL]₂重组蛋白经SDS和DDT高温变性处理后进行SDS–PAGE电泳，考马斯亮蓝染色10min，煮胶10min脱色后观察，结果显示大部分HRP偶联在蛋白上，分子量增大，条带上移(图15)。测定标记后蛋白浓度为0.643mg/mL。[AGL]₂重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

2.1.2酶标蛋白活性检测

对HRP标记蛋白的活性及特异性进行检测，HRP-[AGL]₂活性滴度达1:6400以上，与对照组相比显示明显的特异性(图16)。

2.2酶标蛋白活性分析

Dot-ELISA结果显示，酶标蛋白与9种免疫球蛋白反应，但反应程度各不相同，ELISA结果显示与人IgG反应性最强，与山羊IgG、小鼠IgG、猪IgG、豚鼠IgG、人IgM、人IgA、兔IgG、鹿IgG显示了良好的反应性，鸡免疫球蛋白几乎不反应(图17和图18)。酶标蛋白可以在哺乳动物疾病血清学检测中作为一种通用抗体，具有很好的使用价值。

两种酶标蛋白在倍比稀释，用直接ELISA方法测定活性，结果显示[AGL]₂-HRP1:8000稀释后与人IgG作用OD45nm与[AG]₄酶标蛋白1:4000稀释后相等(如表5所示)，故选作两种酶标蛋白分别以1:8000,1:4000稀释与倍比稀释包被的人IgA，人IgM作用，TMB显色终止后，测得OD450nm值如图图19-A和图19-B所示。随着人IgA，人IgM包被量的减少，OD_450nm呈减小趋势，但[AGL]₂-HRP对人IgA，人IgM的亲和性明显高于[AG]₄酶标蛋白。两种蛋白在相同时间内与人IgG作用后，在不同时间段内测得OD_450nm，[AGL]₂-HRP始终高于[AG]₄酶标蛋白，如图图19-C所示。有文献报道蛋白G对人IgA，人IgM没有结合能力，蛋白A只能结合少量的人IgA，人IgM，蛋白L对所有人Ig亚型都有较强的结合能力，这也验证了本发明研究的结果。

表5两种酶标蛋白稀释度的选择

2.3酶标[AGL]₂蛋白应用于检测BoIFN-αA多克隆抗体

WesternBlot化学发光试验结果显示，两种酶标物结果均为阳性，并且特异比较好。说明[AGL]₂-HRP可替代山羊抗兔酶标物用于检测BoIFN-αA多抗，结果见图20。

2.4酶标蛋白用于布鲁氏菌病和BVDV临床样品检测

布鲁氏菌病快速间接ELISA试剂盒应用标记好的[AGL]₂蛋白与HRP标记兔抗牛IgG检测结果(如表6所示)，应用兔抗牛IgG酶标物检测Brucellosis阳性血清56份，阴性血清32份，利用酶标[AGL]₂蛋白检测结果56份阳性血清，其中52份血清符合，阴性血清33份，29份血清符合，共81份完全符合，符合率为92.05％。对两种二抗检测结果不同的样品，用韩国安捷布鲁氏杆菌抗体快速检测测试盒重新检测，4份HRP标记兔抗牛IgG检测阳性而[AGL]₂-HRP检测阴性的样品结果为阴性，3份HRP标记兔抗牛IgG检测阴性而[AGL]₂-HRP检测阳性的样品结果为弱阳性，应用酶标蛋白为二抗的快速间接ELISA特异性和特异性明显增强，完全适用于对布鲁氏菌病的检测。对本实验室保存的122份犬血清、92份猪血清、86份鹿血清、88份羊血清进行布鲁氏菌快速间接ELISA检测，结果见表7。

用酶标蛋白代替Thermo商品化二抗检测BVDV结果见表8所示，两种方法符合率为97.83％，酶标蛋白可代替Thermo商品化二抗应用于NSP-ELISA检测BVDV。

表6酶标蛋白和兔抗牛IgG-HRP比较

注：括号内为两种方法检测一致的血清数

表7酶标蛋白应用于布病快速间接ELISA检测

表8酶标蛋白和Thermo商品化二抗比较

注：括号内为两种方法检测一致的血清数

实施例4酶标蛋白用于AGL-ELISA检测多物种FMD

1、材料和方法

1.1材料

3、3,5、5-四甲基联苯胺(TMB)购自Sigma公司，HRP标记鹅免疫球蛋白λ轻链单克隆抗体、BoIFN-αA多抗以及所用到的血清均由本实验室按照常规方法制备并保存。

1.2方法

1.2.1AGL-ELISA相关条件确定方法

1.2.1.1ELISA操作步骤

(1)将纯化后的8BF蛋白(非结构蛋白3B上的一段抗原短肽进行反复串联，并在大肠杆菌中表达出重组蛋白，具体制备方案参见文献AnELISAbasedontherepeatedfoot-and-mouthdiseasevirus3Bepitopepeptidecandistinguishinfectedandvaccinatedcattle(2012,ApplMicrobiolBiotechnolGao,M等))，用0.01MNaOH(pH12.0)稀释后包被到酶标板上，100μL/孔，置于4℃14h～18h。

(2)PBST洗板，排干残余液体。

(3)每孔加入300μL5％脱脂乳封闭，37℃，2h。

(4)重复步骤2

(5)阴阳性对照血清1:10稀释后每孔加入100μL，37℃作用30min。

(6)重复步骤2

(7)[AGL]₂-HRP1:8000稀释后，100μL/孔，37℃作用20min。

(8)重复步骤2

(9)显色，具体步骤参照2.2.4.2，酶标仪OD_450nm读值。求出P/N值。

阳性对照：成年牛免疫3ABC蛋白后1月采集的血清，3ABC抗体效价为大于1:1024；；阴性对照：健康未免疫犊牛血清，经LPBE和NS蛋白试剂盒检测为阴性。

1.2.1.2抗原最佳包被量和最佳血清稀释度的确定

棋盘法确定抗原最佳包被量和最佳血清稀释度，按本实施例1.2.1.1方法进行ELISA，观察记录结果，计算并且P/N值。

1.2.1.3最佳酶标蛋白工作浓度的选择

抗原包被和封闭见本实施例1.2.1.1，血清作1:10稀释，将酶标蛋白做1:4000、1:8000、1:16000、1:32000和1:64000倍稀释，100μL/孔，按间接ELISA操作，确定最佳酶标蛋白工作浓度。

1.2.1.4最适包被缓冲液、封闭液、牛血清稀释液、酶标蛋白稀释液的确定

将8BF蛋白分别溶于4种包被缓冲液中，1μg/孔包被ELISA板，血清作1:10稀释。按2.2.8.1方法进行ELISA操作，观察记录结果。7种组合封闭液，血清作1:10稀释，按间接ELISA操作，比较封闭效果。用4种稀释液稀释血清，其他条件按已经摸索好的最佳反应条件进行ELISA，比较本ELISA方法选用的血清稀释液的效果。用4种稀释液稀释酶标蛋白，其他条件按已经摸索好的最佳反应条件进行ELISA，比较本ELISA方法选用的酶标蛋白稀释液的效果。各种稀释封闭液体见表9。

表9各种稀释、封闭液体的确定

1.2.1.5各步作用时间的确定

各部分作用时间设定见表10，后一步反应均在前一步确定好的条件下进行。

表10各步作用时间的确定

1.2.2重复性试验

批内重复性试验：用同一批次制备的重组抗原包被酶标板，6份效价不同的血清和标准阴阳性血清进行检测，每份血清做5个重复。批间重复性试验：在5个不同时间各包被的ELISA板，对批内检测过的6份血清进行检测，结果进行统计学分析。

统计学分析方法为：变异系数CV＝S/X×100％，S：标准差，X：算术平均值，以检验板内和板间检测样品的重复性。

1.2.3特异性试验

用建立的AGL-ELISA方法分别检测牛结核阳性血清、牛布鲁氏菌阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清、牛传染性鼻气管炎阳性血清、牛肠道病毒血清，同时设置阳、阴性血清对照，计算S/P值，并对结果进行分析。

1.2.4AGL-ELISA试剂盒保存期试验

AGL-ELISA试剂盒放置4℃保存，每隔1个月取5条包被好的酶标板条对30份不同状态的奶牛血清进行检验，测定试剂盒的保存期。

1.2.5与3ABC-ELISA商品化试剂盒的比较

用建立的AGL-ELISA试剂盒检测3ABCELISA试剂盒检测过的血清，比较本发明AGL-ELISA试剂盒与商品化试剂盒的差异。

1.2.6AGL-ELISA检测猪、羊血清、鹿血清相关条件的确定

以检测牛血清的相关条件为基础，改变AGL-ELISA各个反应条件，改善各步反应时间，主要改良血清稀释液配方和作用时间，对其他物种FMD的检测。血清以1:10、1:20、1:40比例确定血清稀释倍数，其它各步反应条件的选择与牛血清检测条件类似。

1.2.7FMDVAGL-ELISA方法的初步应用

使用多物种AGL-ELISA方法对黑龙江省及上海等地养殖场进行FVDV抗体的血清学检测，共检测9个奶牛养殖场，904份血清，猪血清174份，羊血清292份，鹿血清80份，评估本方法的临床应用价值。

2实验结果

2.1AGL-ELISA相关条件确定

2.1.1AGL-ELISA抗原抗体最佳稀释度的确定

8BF抗原与FMDV标准血清方阵滴定结果(见表11)表明，当8BF以1:320(1.0μg/ml)稀释包被，对照血清作1:10稀释时，阴性血清OD_450nm<0.2且P/N值最大，所以选此稀释度作为抗原抗体的最佳稀释浓度。

表11AGL-ELISA抗原抗体最佳稀释度

2.1.2酶标蛋白工作浓度的确定

[AGL]₂-HRP最佳稀释度摸索，如表12所示，当酶标蛋白1:8000稀释时，PosOD_450nm值大于1.0，NegOD_450nm小于0.2，且P/N比值最大，最终确定其工作浓度为1:8000。

表12[AGL]₂-HRP最佳稀释度的确定

2.1.3包被缓冲液的确定

结果显示：0.01MNaOH(pH12.0)P/N明显较大，如表13所示。所以选择0.01MNaOH溶液为AGL-ELISA多物种试剂盒的包被缓冲液。

表13包被缓冲液的确定

2.1.4最佳封闭液的确定

5％脱脂乳作为封闭液时，P/N值较高为10.736，而1％酪蛋白P/N值为10.700，二者几乎相同，但酪蛋白配制时不易溶解，所以选5％脱脂乳作为最佳封闭液，结果如表14所示。

表14最佳封闭液的确定

2.1.5最佳牛血清稀释液的确定

PBST明显高于其他稀释液(结果如表15所示)，5％脱脂乳P/N比值也较高但无论是从配制上还是经济角度，都不如PBST溶液配制简单而且经济实惠。

表15牛血清稀释液的确定

2.1.6[AGL]₂-HRP稀释液的选择

用5％脱脂乳稀释时阳性血清OD_450nm值达到1.460，并且阴性值小于0.2(结果如表16所示。)。5％脱脂乳控制本底方面较为突出，所以确定5％脱脂酶标蛋白稀释液。

表16[AGL]₂-HRP稀释液的选择

2.1.7AGL-ELISA多物种试剂盒各步反应时间确定

(1)包被时间和封闭时间的确定

综合比较AGL-ELISA试剂盒原有条件4℃包被过夜为最佳，不作改动。

(2)被检血清最佳作用时间的确定

从表17中看出37℃30min条件下，标准阳性血清和阴性血清P/N比值明显高于其他组，所以选定37℃30min为一抗孵育时间。

表17被检血清最佳作用时间确定(37℃)

(3)酶标蛋白最佳作用时间的确定

从表18中看出，最终选择37℃30minP/N较高，为最佳孵育时间。

表18辣根过氧化物酶标记蛋白最佳作用时间确定(37℃)

(4)底物最佳显色时间确定

在其余条件相同的情况下，结果见表19，最终选择37℃5min为最佳底物显色时间。

表19底物最佳作用时间确定

2.2AGL-ELISA重复性试验

结果显示，批内重复性试验CV在2.22％～6.39％；批间CV在6.32％～9.75％，均小于10％，说明操作具有良好的重复性(表20)。

表20板内、板间重复性试验结果(n＝5)

2.3AGL-ELISA特异性试验

用建立好的AGL-ELISA多物种试剂盒检测牛结核、牛布病、牛病毒性腹泻、牛肠道病毒、牛传染性鼻气管炎五种牛常见传染病阳性血清，结果均为阴性，相同条件下牛FMD血清为阳性，表明建立的AGL-ELISA多物种试剂盒具有较好的特异性(表21)。S/P＝(被检血清OD_450nm值－阴性对照OD_450nm均值)/(阳性对照OD_450nm值－阴性对照OD_450nm均值)

表21特异性试验

2.4AGL-ELISA保存期试验

保存期试验表明，检测试剂盒在4℃保存4个月，试剂盒物理性状，检测特异性、灵敏性和重复性均不受影响；至第4个月，底物溶液与新配置的相比，检测被检血清光密度值略微下降，灵敏性稍低。因此我们将保存期暂定为：4℃保存，有效期4个月。

2.5AGL-ELISA与3ABC-I-ELISA试剂盒比较

优化后的AGL-ELISA与3ABC-I-ELISA试剂盒检测结果(表22)，两种试剂盒的符合率为93.75％，优化后的AGL-ELISA检出的阳性阴性血清完全符合于3ABC-I-ELISA试剂盒。

表22试剂盒初步比较结果

注：括号其它两种试剂盒检测一致的血清数

2.6AGL-ELISA检测猪血清、羊、鹿血清反应条件的确立

2.6.1猪血清稀释液的选择

5％的脱脂乳P/N值较其他稀释液较大(如表23所示)，且控制本底方面较为突出，所以为5％的脱脂乳为猪血清稀释液。

表23猪血清稀释液的选择

2.6.2猪血清最佳稀释度的确定

猪FMD阳性对照血清作1:10稀释时，阴性血清OD₄₅₀nm<0.2且P/N值较大(如表24所示)，所以选1:10稀释度作为猪血清最佳稀释浓度。

表24猪血清最佳稀释度的确定

2.6.3AGL-ELISA检测猪、羊、鹿血清相关条件的确立

AGL-ELISA以检测牛血清条件为基础，优化反应步骤，实现检测猪、羊、鹿血清各步反应条件确定为：各物种血清0.01MNaOH(pH12.0)稀释8BF抗原以1:320(1.0μg/ml)，4℃包被过夜，5％脱脂乳封闭37℃封闭2h，血清作用时间30min，酶标蛋白作用时间20min，显色5min。猪血清以5％脱脂乳1:10稀释；羊血清用兰兽研血清液1:10稀释；鹿血清用5％脱脂乳1:10稀释。

2.7AGL-ELISA检测多种动物FMD临界值的确定

2.7.1牛、猪、羊、鹿血清临界值判定

用优化后的AGL-ELISA检测本实验室保存的FMD阴性牛、猪、羊、鹿血清进行检测，计算S/P平均值(X)(S/P平均值(X)分布见图21A-D)，标准差(SD)计算结果结果见表25。经统计学计算，牛、羊、鹿阴阳性临界值＝平均值+3X标准差，即当待检血清血清样品S/P≥X+3SD＝判定为阳性，S/P<X+2SD判定为阴性，X+3SD≥S/P≥X+2SD为可疑。猪血清临界值判定S/P<X+2SD判定为阴性，S/P>X+2SD判定为阳性。

表25牛、羊、猪、鹿血清阴阳性临界值判定

2.8AGL-ELISA在临床检测中的应用

应用本发明方法检测黑龙江省部分奶牛场和上海某地奶牛场临床血清样本904份进行检测，并且对本实验保存的猪血清174份、羊血清292份、鹿血清80份进行检测，结果如下表26所示。

表26AGL-ELISA在临床检测中的应用

实施例5试剂盒的组装

本发明中所述的试剂盒包括：

酶标板：由8BF蛋白包被；

酶标记的重组蛋白[AGL]₂：辣根过氧化酶标记的重组蛋白[AGL]₂；

稀释液：5％脱脂乳；

封闭液：5％脱脂乳；

洗涤液：PBST缓冲液；

阳性对照：成年牛免疫3ABC蛋白后的1月采集的血清，3ABC抗体效价为大于1:1024，NSP(非结构蛋白)抗体阳性；

阴性对照：健康未免疫犊牛血清，经LPBE和NSP(非结构蛋白)试剂盒检测为阴性；

显色液：TMB底物溶液；

终止液：1MH₂SO₄溶液。