牛口蹄疫病毒VP2-ELISA和3B表位串联肽间接ELISA试剂盒的研制

摘要

口蹄疫（Footand Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdisease，virus，FMDV）引起的以感染偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病。该病的发生和流行严重危害畜牧业的健康持续发展，造成巨大的经济损失，该病被世界动物卫生组织列为必须通报的多种动物共患传染病之一。从2005年起国内不断发生牛口蹄疫，目前面临着Asia1型口蹄疫的持续危害、O型FMDV的复发感染、新型毒株A型的侵袭风险。因此，国内口蹄疫的防控任务艰巨。我国防控FMD主要采取疫苗免疫和抗体监测为主的综合防控政策，通过接种疫苗提高畜群整体抗体水平来预防口蹄疫的感染和传播。因此牛口蹄疫感染的快速诊断、免疫效果评价、自然感染和疫苗免疫的鉴别诊断成为防控口蹄疫的关键技术。
　　 本研究通过pPROEXTMHTb表达载体在大肠杆菌DH5a中成功表达了FMDV的vp2基因，获得大小为35ku的融合蛋白，Westernblot证实目的蛋白可与FMDV5种血清型的牛阳性血清发生特异性反应。以此纯化蛋白为抗原建立了牛FMDVVP2蛋白间接ELISA方法。特异性试验表明，该抗原不与常见的7种牛病阳性血清发生交叉反应。检测非免疫无口蹄疫地区牛阴性血清特异性为100％；检测感染血清敏感性为97.3％；与4种商品化试剂盒比较检测O-Asia1二价灭活苗免疫牛血清364份，符合率分别为69.0％、95.0％、90.4％和86，8％。试验结果表明建立的ELISA方法可用于牛口蹄疫感染和免疫抗体检测。
　　 本研究利用实验室融合表达的3B表位串联肽（8BF）为检测抗原建立的间接ELISA为基础，优化组装了一种特异、敏感的间接ELISA试剂盒。通过检测大量未免疫、免疫健康牛血清和感染牛血清，确定了判定标准：S/P>0.3，阳性：0.2

目录

文摘

英文文摘

Contents

1 前言

1.1 口蹄疫的危害和流行现状

1.2 口蹄疫病毒的分子生物学特性

1.2.1 口蹄疫病毒的形态特征和理化特性

1.2.2 病毒基因组结构及功能

1.2.3 病毒结构蛋白及其功能

1.2.4 病毒非结构蛋白及其功能

1.3 口蹄疫的抗感染免疫机制

1.4 口蹄疫诊断技术研究进展

1.4.1 病毒分离

1.4.2 血清学检测技术

1.4.3 分子生物学检测技术

1.5 非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物的研究进展

1.5.1 口蹄疫感染与免疫动物鉴别诊断的原理

1.5.2 口蹄疫病毒NSP免疫特性和抗体消长

1.5.3 口蹄疫病毒感染与免疫鉴别诊断研究现状

1.5.4 口蹄疫病毒鉴别诊断面临的问题和解决方案

1.5.5 口蹄疫病毒鉴别诊断新思路

1.5.6 口蹄疫病毒鉴别诊断小结

1.6 研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 重组质粒、菌株

2.1.2 生物学试剂

2.1.3 血清

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 口蹄疫病毒VP2融合蛋白和3B表位串联肽（8BF）的表达、纯化和抗原性鉴定

2.2.2 口蹄疫病毒VP2-ELISA方法的建立和初步应用

2.2.3 口蹄疫病毒3B表位串联肽间接ELISA试剂盒（8BF-ELISA）的研制和初步应用

3 结果与分析

3.1 VP2蛋白和8BF蛋白的表达、纯化和抗原性鉴定

3.1.1 重组蛋白VP2的诱导表达与纯化

3.1.2 8BF蛋白表达与纯化

3.1.3 VP2蛋白和8BF蛋白Western blot分析

3.2 VP2-ELISA方法的建立和初步应用

3.2.1 VP2-ELISA相关条件确定

3.2.2 VP2-ELISA临界值确定

3.2.3 VP2-ELISA敏感性试验

3.2.4 VP2-ELISA特异性试验

3.2.5 VP2-ELISA重复性试验

3.2.6 临床样本检测结果

3.3 8BF-ELISA试剂盒的研制和初步应用

3.3.1 8BF-ELISA试剂盒相关条件确定

3.3.2 8BF-ELISA试剂盒组装

3.3.3 8BF-ELISA试剂盒临界值确定

3.3.4 8BF-ELISA试剂盒最低检出限量试验

3.3.5 8BF-ELISA试剂盒特异性交叉反应试验

3.3.6 8BF-ELISA试剂盒重复性试验

3.3.7 8BF-ELISA试剂盒保存期试验

3.3.8 8BF-ELISA试剂盒检测NSP抗体持续期试验

3.3.9 8BF-ELISA试剂盒与3种商品化试剂盒比较结果

3.3.10 8BF-ELISA试剂盒与3ABC-I-ELISA试剂盒进一步比较结果

3.3.11 8BF-ELISA试剂盒临床应用结果

4 讨论

4.1 选择口蹄疫病毒VP2蛋白建立抗体检测ELISA方法的依据

4.2 VP2-ELISA检测感染和免疫牛血清的临床应用

4.3 3B表位串联肽（8BF）作为FMD自然感染和疫苗免疫鉴别诊断抗原的优势

4.4 8BF-ELISA试剂盒的初步组装

4.5 8BF-ELISA试剂盒临床应用区别自然感染和疫苗免疫牛

4.6 VP2-ELISA和8BF-ELISA试剂盒的配合使用

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文