用于分析透明或低对比度样本的自动显微镜聚焦系统和方法

摘要

一种显微镜系统和方法凭经验确定物镜的景深的边界。所述系统和方法很大程度上自动化，其中待成像的样本的操纵由处理器和相关联设备实行。经验景深的计算也同样自动化。在凭经验确定所述景深的所述边界后，所述样本(尤其当透明或半透明时)可即刻在小于所述景深的用户界定的深度处准确成像。

说明书

技术领域

本发明大体涉及显微镜，且更特定来说涉及用于凭经验确定聚焦 在透明或低对比度样本上的物镜的焦点的工作距离和深度的显微镜系统和 方法。本发明提供可有益地聚焦在透明或低对比度样本的经界定深度上的显 微镜系统和方法。

背景技术

所有光学显微镜都需要借以提供聚焦以便清楚地使样本成像的机 构。在许多情形中，系统聚焦取决于样本具有视觉上可辨识的特征。这些特 征产生用于聚焦的必要对比度。在其它情形中，确定到样本的距离，且通过 物镜的已知焦长设定焦点。透明样本为建立适当聚焦提出了特殊挑战，且需 要仅本领域极其熟练的技术人员已知的特别的技术来改进到可能发生适当 聚焦的点的对比度。

显微镜传统上通过增加或减小显微镜物镜与样本之间的距离直到 图像对于显微镜人员呈现为焦点对准为止来进行聚焦。显微镜的聚焦因此通 常某种程度上具有主观性，且显微镜必须具有焦点调整能力以便适当视觉化 样本的表面特征。更通常的做法是，提供旋钮以移动物镜或固持样本的载物 台以便调整物镜与样本之间的相对距离，且显微镜人员操纵此旋钮直到他主 观上相信已达到最佳聚焦为止。因此，尽管需要更加精细的准确度，但显微 镜人员基本上维持借以主观上确定聚焦的主观工具。

技术已通过两种基本方法将主观性排除出聚焦的确定。第一方法 通过感测从样本表面反射的光(例如，近红外)来测量物镜与样本之间的距离 以提供反馈来自动控制聚焦。此类型的方法由尼康(Nikon)公司(日本)描述。 在另一方法中，尼康公司还描述使用经反射声音来测量距离。如MotionX公 司(美国)例如在其FocusTracLaserAutoFocusSystems,andPriorScientific(美 国)中描述的激光聚焦控制系统还通过测量物镜与样本之间的距离且提供反 馈用于焦点调整来促进聚焦。美国专利No.7,345,814进一步描述激光聚焦系 统。在一些情况下，这些方法归因于样本反射性和透明度而在透明样本上聚 焦时存在困难。这些距离测量方法通常需要添加硬件和控制软件以促进使用 标准显微镜进行聚焦。美国专利No.5,594,235使用共焦传感器来最佳测量高 度或Z轴点(如其在现有技术中所提及)。预先确定给定数目的z点，且接着 评估每一者的反射率。归因于不同程度的反射率，可确定表面的每一点处的 高度。虽然此可视为最高点测量的工具，但其还确保聚焦准确性的特定置信 度。

使显微镜聚焦的第二已知方法是随着显微镜物镜与样本之间的距 离增加和减小而比较图像的对比度。这基本上是显微镜人员用于视觉上确定 样本处于焦点对准(如上所述)的方法。所述方法容易通过使用例如(但不限 于)CCD或CMOS传感器等传感器以电子方式俘获样本图像而自动化。此方 法由Groen和Young等人在“AComparisonofDifferentFocusFunctionsfor UseinAutofocusAlgorithms”Cytometry6:81-91(1985)中详细描述。然而，此 对比度比较方法不能在完全透明或在图像内不具有对比度的样本上使用。

采用使用显微镜的景孔径(F制光圈，F-Stop)的方法在样本上聚焦。 此方法由Chow和Liu描述，尼康光学显微镜,基本操作程序, http://nanomech.me.washington.edu/pdfs/nikon.pdf，2009年1月，且进一步在 耐诺(Nanometrics)公司的NanoSpec^TM3000实验室指南，NanoSpecFilm ThicknessMeasurementSystem，第8.33章中描述。在此方法中，F制光圈关 闭以便将F制光圈投影在样本上，且调整焦点(即，相对移动样本和物镜)使 得对比度增加和/或减小。在最大对比度点处，样本视为处于焦点对准且F 制光圈打开以允许样本的成像。

在显微镜成像过程中，样本主要经由物镜放大。每一物镜具有相 关联景深，有时也称为焦深。尼康公司将景深界定为从处于焦点对准的最近 物平面到也同时处于焦点对准的最远平面的距离。在显微镜学中，景深是从 近似0.2到55微米(μm)的极短范围。应了解，当使透明样本成像时，景深内 的任何物体将被成像。举例来说，使用参考6中的数据，4倍物镜具有55.5μm 的景深，且因此当其聚焦在透明样本上且最近处于焦点对准的物平面在样本 表面处时，样本的顶部55.5μm内的所有物体将被成像。当例如所关注区域 仅是样本的顶部5μm时，这不合需要。因此，本领域中需要一种允许显微 镜在所要深度自动聚焦在透明或半透明样本上从而视需要取消物镜的景深 的其余部分的显微镜系统。本领域中需要提供允许使透明或低对比度样本在 所要深度自动成像的显微镜系统和方法。

发明内容

本发明的一实施方案提供一种用于凭经验确定显微镜系统的物镜 的景深的边界的方法，所述显微镜系统具有显微镜、F制光圈，以及一或多 个处理器，所述方法包括以下步骤：

将样本的焦面放置在物镜的景深外部的第一位置处；

在第一位置处将F制光圈投影到焦面上以在其上产生F制光圈投影；

实行样本与物镜之间的递增相对移动以将样本的焦面相对于物镜放置 在不同递增位置处，且投影F制光圈以在所述递增位置处在焦面上产生F制 光圈投影，其中所述实行递增相对移动的步骤将焦面带至景深的边界处的位 置；

执行第一位置处以及所述递增位置处F制光圈投影的图像的对比度分 析，所述执行对比度分析的步骤由所述一或多个处理器实行且确立焦面何时 处于景深的边界处的位置处。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0008]中的方法，其中样 本是透明的且焦面选自近焦面(相对于物镜)和远焦面(相对于物镜)。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0008]或[0009]中的方法， 其中景深具有第一边界WD和第二边界WD₁，其中WD是焦面可距物镜的 且仍处于明确焦点对准的最短距离，且WD₁是焦面可距物镜的且仍处于明 确焦点对准的最大距离，且第一位置经选择为小于WD的99％或大于WD₁的101％的距离。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0008]到[0010]的任一者 中的方法，其中所述执行对比度分析的步骤通过比较多个递增位置处F制光 圈投影的相对焦点的标准偏差而确立焦面何时处于景深的边界处的位置处。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0008]到[0011]的任一者 中的方法，其中所述投影F制光圈的步骤由所述一或多个处理器自动化。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0008]到[0012]的任一者 中的方法，其中所述实行递增相对移动的步骤由所述一或多个处理器自动 化。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0008]到[0013]的任一者 中的方法，其中所述放置步骤由所述一或多个处理器自动化。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0008]到[0014]的任一者 中的方法，其中第一位置由显微镜系统的用户输入。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0008]到[0015]的任一者 中的方法，其中物镜具有制造商陈述的工作距离，且所述第一位置基于所述 制造商陈述的工作距离而选择，如显微镜系统的用户所输入。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0008]到[0016]的任一者 中的方法，其中显微镜系统进一步包括图像传感器，且所述方法进一步包括： 以电子方式利用图像传感器使F制光圈投影在所述递增位置处在焦面上成 像，所述以电子方式成像的步骤由所述一或多个处理器自动化。

本发明的另一实施方案提供一种用于使透明样本在顶部焦面下方 的所界定深度处或在底部焦面上方的所界定高度处成像的方法，所述方法包 括以下步骤：

凭经验确定显微镜系统的物镜的景深的边界，所述显微镜系统具有显微 镜、F制光圈，以及一或多个处理器，所述凭经验确定边界的步骤包括以下 步骤：

将样本的焦面放置在物镜的景深外部的第一位置处，

在第一位置处将F制光圈投影到焦面上以在其上产生F制光圈投影，

实行样本与物镜之间的递增相对移动以将样本的焦面相对于物镜放置 在不同递增位置处，且在所述递增位置处投影F制光圈以在焦面上产生F制 光圈投影并在焦面上使F制光圈投影的图像成像，其中所述实行递增相对移 动的步骤将焦面带至景深的边界处的位置，以及

执行第一位置处以及所述递增位置处F制光圈投影的图像的对比度分 析，所述执行对比度分析的步骤由所述一或多个处理器实行且确立焦面何时 处于景深的边界处的位置处；以及

基于所述确定边界的步骤中所确定的景深的边界将透明样本的焦面放 置在景深内。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0018]中的方法，其中景 深具有第一边界WD和第二边界WD₁，其中WD是焦面可距物镜的且仍处 于明确焦点对准的最短距离，且WD₁是焦面可距物镜的且仍处于明确焦点 对准的最大距离，且所述利用景深放置透明样本的焦面的步骤包括将顶部焦 面放置成比WD₁更接近物镜或将底部焦面放置成比WD更远离物镜。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0018]或[0019]中的方 法，其中景深具有第一边界WD和第二边界WD₁，其中WD是焦面可距物 镜的且仍处于明确焦点对准的最短距离，且WD₁是焦面可距物镜的且仍处 于明确焦点对准的最大距离，且第一位置经选择为小于WD的99％或大于 WD₁的101％的距离。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0018]到[0020]的任一者 中的方法，其中所述执行对比度分析的步骤通过比较多个递增位置处F制光 圈投影的相对焦点的标准偏差而确立焦面何时处于景深的边界处的位置处。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0018]到[0021]的任一者 中的方法，其中所述投影F制光圈的步骤由所述一或多个处理器自动化。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0018]到[0022]的任一者 中的方法，其中所述实行递增相对移动的步骤由所述一或多个处理器自动 化。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0018]到[0023]的任一者 中的方法，其中所述放置步骤由所述一或多个处理器自动化。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0018]到[0024]的任一者 中的方法，其中第一位置由显微镜系统的用户输入。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0018]到[0025]的任一者 中的方法，其中物镜具有制造商陈述的工作距离，且所述第一位置基于所述 制造商陈述的工作距离而选择，如显微镜系统的用户所输入。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0018]到[0026]的任一者 中的方法，其中显微镜系统进一步包括图像传感器，且所述方法进一步包括：

以电子方式利用图像传感器使F制光圈投影在所述递增位置处在焦面 上成像，所述以电子方式成像的步骤由所述一或多个处理器自动化。

本发明的另一实施方案提供一种显微镜系统，其包括：

用于固持样本的台，

照明源，

物镜，

机动化F制光圈，

驱动机构，其可操作以改变样本与物镜之间的相对位置，

电子图像传感器，

用以确定样本与物镜之间的给定相对位置处样本的相对焦点的装置，

用以确定第一凭经验工作距离WD_E的装置，其中WD_E是当焦面处于焦 点对准(如所述用以确定相对焦点的装置所确定)时样本的焦面与物镜之间的 最近距离，

用以确定第二凭经验工作距离WD_E1的装置，其中WD_E1是当焦面处于 焦点对准(如所述用以确定相对焦点的装置所确定)时样本的焦面与物镜之间 的最远距离，

一或多个处理器，其控制所述台、机动化F制光圈、驱动机构和图像传 感器，且实行所述用以确定相对焦点的装置，所述用以确定WD_E的装置和 用以确定WD_E1的装置，以及

用以输入待成像焦面下方的用户界定的深度或待成像焦面上方的用户 界定的高度的装置，所述一或多个处理器适于将所述样本移动到适当位置以 在焦面下方的用户界定的深度或焦面上方的用户界定的高度处成像，所述适 当位置基于WD_E或WD_E1。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0028]中的显微镜系统， 其进一步包括：用以存储样本到物镜的给定相对位置、以电子方式使样本在 所述相对位置处成像且存储关于所述相对位置处的相对焦点的信息的装置。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0028]或[0029]中的显微 镜系统，其进一步包括用以采用如所述用以确定相对焦点的装置所确定的相 对焦点的标准偏差分析确定WD_E和WD_E1的装置。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0028]到[0030]的任一者 中的显微镜系统，其进一步包括与所述处理器通信以允许用户输入数据的输 入装置。

本发明的另一实施方案提供一种如段落[0028]到[0031]的任一者 中的显微镜系统，其进一步包括所述台上的样本，所述样本是透明的。

附图说明

图1是根据本发明的显微镜系统的大体示意图；

图2是展示物镜与样本之间的工作距离和景深关系的侧部正视示 意图；

图3是在本发明的第一方法中的初始定位处展示的物镜、样本和 样本台的驱动机构的侧部正视示意图；

图4是在图3的初始位置处的物镜和样本的侧部正视示意图；

图5是图4的物镜和样本的侧部正视示意图，但展示样本被移动 到确立凭经验工作距离WD_E1的位置；

图6是如图4和5中的物镜和样本的侧部正视示意图，但展示样 本被移动到确立凭经验工作距离WD_E的位置；

图7是在本发明的第二实施方案中的初始定位处的物镜和样本的 侧部正视示意图；

图8是图7的物镜和样本的侧部正视示意图，但展示样本被移动 到确立凭经验工作距离WD_E的位置；

图9是如图7和8中的物镜和样本的侧部正视示意图，但展示样 本被移动到确立凭经验工作距离WD_E1的位置；

图10是投影在透明样本上的关闭F制光圈的示范性图像，其中F 制光圈脱离焦点对准；

图11是投影在透明样本上的关闭F制光圈的示范性图像，其中F 制光圈处于焦点对准；

图12是展示可如何采用图像的标准偏差来确定图3-6的方法中的 工作距离的示范性曲线图；

图13是展示可如何采用图像的标准偏差来确定图7-9的方法中的 工作距离的示范性曲线图；以及

图14是展示可如何应用从凭经验确定的工作距离的偏移来使透 明样本的特定深度成像的侧部正视示意图。

具体实施方式

本发明提供用以凭经验确定工作距离和景深且允许自动指定待成 像的透明或低对比度样本的深度的显微镜系统和方法。“透明”应理解为样本 允许光从中穿过(与不透明形成对比)。本文中，此术语还应理解为涵盖半透 明样本，其为半透明的从而允许光从中穿过，但图像可归因于半透明特性而 看到较少细节。在透明样本的情况下，本发明提供用于在样本内的不同深度 处的物体上聚焦的设备和方法。本发明改进在样本的表面处以及不同深度 (或层)内使透明样本中的物体和缺陷成像的准确度。“低对比度”是指样本中 暗到亮的范围非常小。本发明改进可在低对比度样本中检视物体和缺陷的准 确度。在更广义方面中，本发明提供用于凭经验确定给定物镜的工作距离和 景深的设备和方法。在一些实施方案中，所述方法很大程度上自动化，具有 来自使用显微镜系统的人的极少输入或无来自其的输入。

典型的显微镜系统在图1中展示且由数字10表示。显微镜系统 10包括用于使样本成像的光学系统12，和用于自动确定景深的焦点检测系 统14。此特定系统10采用经修改反射光显微镜作为光学系统12，但应注意， 透射光显微镜可类似地适合。光学系统12包括在物镜18下方承载样本S的 样本台16。光学系统12进一步包括用于照明样本S的光源20和垂直照明 器22。光学系统12还包括可调整F制光圈24。图像传感器26接收经由物 镜18发射的图像，且图像传感器26可视为焦点检测系统14的一部分。焦 点检测系统14还包括电机28和驱动机构30，其操作以朝向和远离物镜18 而移动样本台16(以及因此其上的样本S)。驱动机构30展示为螺钉31，其 由电机28旋转以推进样本台16，其中向上移动源自在一个方向上(例如，顺 时针)旋转螺钉31，且向下移动源自在相对方向上(例如，逆时针)旋转螺钉 31。将了解，可使用其它驱动机构，且重要的是物镜18与样本S之间的相 对移动，使得驱动机构可作为替代或另外操纵显微镜以将其相对于样本S移 动。驱动机构应使得台以及因此其上的样本可以非常小的增量(大约微米或 更优选地纳米)移动，因为经由当前设备和方法凭经验确定的景深的量值通 常非常小。电机28由一或多个处理器32控制，处理器32经由电缆34或其 它适当机构(例如，无线通信)与电机28通信。焦点检测系统14还包括电机 36以打开和关闭F制光圈24，电机36也由一或多个处理器32控制，处理 器32经由电缆38或其它适当机构(例如，无线通信)与电机36通信。最后， 处理器32和图像传感器26经由电缆40或其它适当机构(例如，无线通信) 通信。操作者输入单元42(例如，键盘、触摸屏监视器或其它标准装置)可用 于允许操作者输入所要控制和数据。

所述设备的光学组件决定系统的特性，尤其是放大率、工作距离 (WD)和景深(DOF)。图1的实施例设备的放大率是物镜18的功能。如图所 示，每个物镜被指定一数值孔径NA，以及一放大率。物镜的这些规格及其 构造界定本发明的两个关键分量：焦深，DOF和工作距离WD。焦深、DOF 及其与工作距离WD和WD₁的关系在图2中展示。DOF对于每一不同物镜 是唯一的，且界定为在图像在两个位置均处于明确焦点对准的情况下样本距 物镜的最短距离与样本距物镜的最大距离之间的差。出于公开本发明的目 的，将DOF与工作距离相关是有帮助的，且因此注意到，参看图2，工作距 离WD确立为物镜18与样本S的顶部表面(样本在该处处于焦点对准)之间 的最小距离。以类似方式，工作距离WD₁确立为物镜18可距样本S的顶部 表面的最大距离，其中样本仍处于焦点对准。可见：

DOF＝WD₁-WD，或

DOF＝|WD-WD₁|

尽管DOF是物镜的特征，但其可归因于设备中的机械组件和额外 光学组件而改变。实际工作距离尽管是物镜的特性，但也可归因于设备中的 机械组件和额外光学组件而改变。出于此处的目的，DOF_M将指代物镜制造 商供应的所陈述焦深，且WD_M(其中WD_M1为WD_M与DOF_M之和(即，WD_M+DOF_M))将指代物镜制造商供应的所陈述焦深。因此这些是给定或已知值， 且应注意，本发明提供一种通过将F制光圈投影到样本S上且在测量物镜 18与样本S之间的相对距离ΔD的同时分析所投影图像来凭经验确定WD 和DOF的方法。凭经验确定的工作距离和景深将在本文表示为WD_E和WD_E1以及DOF_E。

凭经验确定透明样本的WD_E和WD_E1以及DOF_E的方法在图3-10 中展示。所述方法对于低对比度样本稍许更局限，因为其不允许在样本的顶 面和底面两者上聚焦。在公开关于透明样本的方法之后将更具体公开针对低 对比度样本的方法。值得注意的是，大体概念在每一方法中相同，且涉及将 样本的“焦面”(本文稍后界定)从景深外部的位置移动到景深中以凭经验确定 景深的边界，即如上文公开的DOF_E与凭经验确定的工作距离WD_E和WD_E1有关。每一方法在本文中经实践以确定WD_E和WD_E1两者，且依据这些值， 还可确定DOF_E，但应了解，本文的方法可部分以及组合实践以凭经验确定 这些所要值。举例来说，可能采用一种方法来确定WD_E，且采用另一方法 来确定WD_E1，两种方法组合借此产生所有所要值，即WD_E和WD_E1以及 DOF_E。方法的此组合可能不太需要，因为将有可能发现其实行起来不太高 效，但不管如何，此组合仍提供本发明的优点且因此落在其范围内。

采用术语“焦面”来公开当前方法。出于本公开的目的，术语“焦面” 将暗示经分析以确定在上面投影的F制光圈何时处于焦点对准且因此在经 验景深内的样本的面。将了解，对于透明样本，顶面或底面可经选择以充当 焦面。事实上，本发明的特定方法仅在透明样本上实践。此通过下文的公开 内容将更充分了解。应进一步注意到，本发明大体针对使用比正采用的物镜 的景深厚的样本。将了解，因为DOF通常非常小(在微米范围内)，所以样本 比景深厚的事实可能总是发生。

命名“ΔD”应理解为物镜18与样本的焦面之间的距离，且因此ΔD₁和ΔD₂等可用于表示焦面的特定位置。

第一方法在图3-6中展示。此方法大体涉及将样本的最接近物镜 18的面视为“焦面”。此面在图中以字母PPF识别，代表“近焦面”。距物镜 18最远的面以字母DFF识别，代表“远焦面”。将了解，仅透明样本将提供 远焦面DFF，且远焦面DFF的使用将在本文下文阐释。首先解释近焦面PFF 的使用，应理解透明样本和不透明低对比度样本均将提供适宜的近焦面PFF。

样本S的初始定位在图3和4中展示，其中样本台16通过启动 电机28和驱动机构30而移动，使得样本S的近焦面PFF放置在相对于物镜 18的距离ΔD₁处，使得ΔD₁在DOF_E外部。在实践本发明的此实施方案的过 程中，这通常通过将焦面PF放置在大于WD_M加上DOF_M加上偏移的距离 ΔD₁处来实现。以此方式，近焦面PFF非常有可能在物镜18的DOF_E的外 部。一般来说，因为焦深通常是非常小的距离，所以可应用极微小偏移。意 图是初始定位样本S使得将看到投影到近焦面PFF上的F制光圈是模糊的 (即，在DOF_E外部)。尽管确切距离不是关键的，但在特定实施方案中，样 本S的初始定位使得ΔD₁至少大于WD_M的101％。在其它实施方案中，ΔD₁ 大于WD_M的102％，在其它实施方案中大于WD_M的103％，在其它实施方 案中大于WD_M的104％，且在其它实施方案中大于WD_M的105％。在一些 实施方案中，ΔD₁是WD_M的105％到150％。因为DOF与WD的比率如此 小，所以偏移确保近焦面PFF在DOF_E外部。当然，如果看见投影到近焦面 PFF上的F制光圈是清晰的且因此可能在DOF_E内，那么样本S可简单地再 定位得更远直到到达所要初始位置为止(即，直到近焦面PFF在DOF_E外部 为止)。

在到达如图3和4所示的此初始位置后，F制光圈24由电机36 自动关闭，且F制光圈的图像投影到样本S上(且在透明样本的情况下穿过 样本)。所投影F制光圈图像(图10、11，数字44)在图像传感器26处记录 且由处理器32分析。如图10所示，当F制光圈24在位置ΔD₁处关闭(即， 在物镜的DOF_E外部)时，样本S的近焦面PFF上的所投影F制光圈图像44 呈现为具有如46处的脱离焦点对准的边缘。边缘46脱离焦点对准，因为ΔD₁在DOF_E外部。在操作者或处理器32未能将近焦面PFF放置在DOF_E外部且 所投影F制光圈图像44确定为处于焦点对准的情况中，可应用另一偏移来 确保近焦面PFF在DOF_E外部。

在F制光圈24关闭后，驱动机构30即刻自动开始通过在箭头A 的方向上移动样本S使其较接近物镜(如图4中表示)而减小物镜18与近焦面 PFF之间的距离，即减小ΔD。移动样本直到所投影F制光圈图像如图11中 说明处于焦点对准为止，其中样本S的近焦面PFF上的所投影F制光圈图像 44呈现为具有如48处的清晰且处于焦点对准的边缘。此位置(表示为ΔD₂) 指示经验工作距离WD_E1，如图5中所见。应注意，图10和11针对本文的 每一方法而参考，应理解焦面，不论是近焦面PFF还是远焦面DFF，将针对 每一方法特别地界定。

处于焦点对准的图像表征为F制光圈所投影图像44周围很大程度 上界定的边缘(如处于焦点对准的边缘48处)。界定这些边缘的方法是本领域 一般技术人员众所周知的且通常表征为对比度分析。作为一实施例，如图像 传感器26上存储的图像的标准偏差SD将如图12所示改变。此实施方案中 随着ΔD减小从而使近焦面PFF较接近物镜18，SD增加直到发生最大值为 止。在SD曲线的最大值处，所投影F制光圈图像44处于焦点对准。最大 值首先在ΔD₂处发生，其将理解为也是WD_E1，如图5所示的位置。电机28 和驱动机构30继续减小ΔD直到所投影F制光圈图像44脱离焦点对准为止。 这将表征为在图12中的ΔD₃处发生的SD的减小，且ΔD₃指示经验工作距 离WD_E，如图6所示。处理器32和相关元件(例如，图像传感器26、电机 36和相关联可调整F制光圈24，以及电机28和相关联驱动机构30)容易自 动执行所有移动、成像和分析。在确定ΔD₃(WD_E)后，F制光圈24自动打开， 且存储ΔD₂(WD_E1)和ΔD₃(WD_E)处的台位置。因为ΔD₂和ΔD₃是凭经验确 定的工作距离WD_E1和WD_E，所以经验焦深DOF_E容易计算为：

DOF_E＝(ΔD₂-ΔD₃)＝WD_E1-WD_E

应了解，可实行图3-6的实施方案，在样本为透明的情况下分析 将焦面视为样本的远焦面DFF。本发明预期此情形，且本领域的一般技术人 员不需要额外公开内容来理解将现有方法应用于远焦面DFF。将焦面简单地 视为远焦面DFF，且执行相同移动和分析。本领域的一般技术人员将能够将 远焦面DFF放置在DOF_E外部的适当开始位置处，且还可采取措施来防止或 考虑透明样本的近焦面PFF在初始位置处位于DOF_E内的情形。

另一方法在图7-9中展示，其中样本S的焦面是透明样本的远焦 面DFF，即允许光从中穿过尤其使得光可到达远焦面DFF且允许其成像的 焦面。样本S的初始定位在图7中展示，其中通过启动电机(未图示)和驱动 机构(未图示)而移动样本台(未图示)使得样本S的远焦面DFF放置在相对于 物镜18的距离ΔD₁处使得ΔD₁在DOF_E外部。在实践本发明的此实施方案 的过程中，这通常通过将远焦面DFF放置在小于WD_M减去偏移的距离ΔD₁处来实现。以此方式，远焦面DFF非常有可能在物镜18的DOF_E的外部。 一般来说，因为DOF通常是非常小的距离，所以可应用极微小偏移。初始 定位的意图是在样本S的初始位置处将看到投影到远焦面DFF上的F制光 圈是模糊的(即，在DOF_E外部)。尽管确切距离不是关键的，但在特定实施 方案中，样本S的初始定位使得ΔD₁小于WD_M的99％。在其它实施方案中， ΔD₁小于WD_M的98％，在其它实施方案中小于WD_M的97％，在其它实施 方案中小于WD_M的96％，且在其它实施方案中小于WD_M的95％。在一些 实施方案中，ΔD₁是WD_M的50％到95％。因为DOF与WD的比率如此小， 所以偏移确保近远焦面DFF在DOF_E外部。当然，如果看见投影到远焦面 DFF上的F制光圈是清晰的且因此可能在DOF_E内，那么样本S可简单地再 定位得更接近物镜18直到到达所要初始位置为止(即，直到远焦面DFF在 DOF_E外部为止)。

在到达如图7所示的初始位置后，F制光圈24由电机36自动关 闭，且F制光圈的图像投影到样本S上且穿过样本S。此所投影F制光圈图 像44在图像传感器26处记录且由处理器32分析。当F制光圈24在位置ΔD₁处关闭时，样本S的近焦面PFF上的所投影F制光圈图像44呈现为具有如 46处的脱离焦点对准的边缘，所述边缘脱离焦点对准，因为ΔD₁在DOF_E外部。如先前所述，此在图11中展示，图11大体适用于所有实施方案。在 操作者或处理器32未能将远焦面DFF放置在DOF_E外部且所投影F制光圈 图像44确定为处于焦点对准的情况中，可应用另一偏移来确保远焦面DFF 在DOF_E外部。

在F制光圈24关闭后，驱动机构30即刻自动开始通过在箭头B 的方向上移动样本S使其较远离物镜18(如图7中表示)而增加物镜18与远 焦面DFF之间的距离，即增加ΔD。移动样本S直到所投影F制光圈图像 44如图12中说明处于焦点对准为止，其中样本S的远焦面DFF上的所投影 F制光圈图像44呈现为具有如48处的清晰且处于焦点对准的边缘。这指示 经验工作距离WD_E，如图8中所见。

用以确定处于焦点对准的图像的方法与针对图3-6的实施方案所 公开的方法相同，且通过标准偏差分析而自动执行。如图像传感器26上存 储的图像的标准偏差SD将如图13所示改变。此实施方案中随着ΔD增加从 而使远焦面DFF较接近物镜18，SD增加直到发生最大值为止。在SD曲线 的最大值处，所投影F制光圈图像44处于焦点对准。最大值首先在ΔD₂处 发生，其将理解为也是WD_E，如图8所示的位置。电机28和驱动机构30 继续增加ΔD直到所投影F制光圈图像44脱离焦点对准为止。这将表征为 在图13中的ΔD₃处发生的SD的减小，且在图9中展示为WD_E1。在确定ΔD₃(WD_E1)后，F制光圈24自动打开且存储ΔD₂(WD_E)a和ΔD₃(WD_E1)处的台 位置。因为ΔD₂和ΔD₃是凭经验确定的工作距离WD_E1和WD_E，所以经验焦 深DOF_E容易计算为：

DOF_E＝(ΔD₃-ΔD₂)＝WD_E1-WD_E

应了解，可实行图7-9的实施方案，分析将焦面视为透明样本的 近焦面PFF。另外，在不透明或低对比度样本的情况中，近焦面PFF将必须 充当用以实行图7-9的方法的焦面。本发明预期此情形，但不需要额外公开 内容。将焦面简单地视为近焦面PFF，且执行相同移动和分析。本领域的一 般技术人员将能够将近焦面PFF放置在DOF_E外部的适当开始位置处，且还 可采取措施来防止或考虑透明样本的远焦面DFF在初始位置处位于DOF_E内的情形。

依据以上公开内容，应容易了解，在透明样本的情况中，近焦面 PFF或远焦面DFF可放置在DOF_E外部且随后通过分析其上F制光圈图像的 清晰度而被带至DOF_E的边界(WD_E或WD_E1)的一者。另外，其可从向上或 向下方向被带至边界。在不透明低对比度样本的情况下，仅采用近焦面PFF， 但该面可从任一方向被带至DOF_E的任一边界(WD_E或WD_E1)。如上文提及， 应了解，本文的方法可部分或组合实践以凭经验确定所要WD_E、WD_E1和 DOF_E值。因此，可能通过使用近焦面PFF确定BOFE的一个边界(例如， WD_E)，且可能随后通过使用远焦面DFF确定另一边界WD_E1。存在用以考 虑所经历标准偏差以便确定何时给定焦面到达BOFE的边界的移动与方式 的许多组合，且本发明不限于本文教导的用于样本的初始定位和移动的特定 方法或受其限制。这些方法展示为有效，因为其提供单一初始位置、分析单 一焦面上的所投影图像，且在一致方向上移动以确定DOF_E。

已规定，本发明尤其适用于样本比物镜的景深厚的情形。在此类 样本的情况下且在已知WD_E和WD_E1的值的情况下，有可能通过相对于物镜 18选择性定位样本而在近焦面PFF下方用户界定的深度处或在远焦面DFF 上方用户界定的高度处使样本成像。在图14中，WD_E、WD_E1和DOF_E已如 上文所确定。如果样本的近焦面PFF被带至WD_E，那么样本的等于DOF_E的深度将被成像，但如果需要使小于DOF_E的深度成像，现在可鉴于已凭经 验确定的WD_E、WD_E1和DOF_E而准确地实现此目的。为使近焦面PFF下方 的所要深度Z₁成像，将近焦面PFF放置在距物镜18等于WD_E1减去Z₁的距 离处。利用例如微定位器和纳米定位器等准确的电机和驱动机构，有可能在 非常小的深度处准确地成像。在图14的示意说明中，样本S是透明的且50 处的缺陷将处于焦点对准且因此清晰地成像，在所确立所要深度Z₁内，而 52处的缺陷将脱离焦点对准。为在远焦面DFF上方用户界定的高度Z₂处成 像，远焦面DFF可放置在WD_E下方的距离Z₂处(即，WD_E加上Z₂处)。

值得注意的是，一些或所有过程可由处理器32自动化。在特定实 施方案中，初始定位由处理器32在用户输入日期或不输入日期的情况下自 动实行。举例来说，用户可供应制造商陈述的工作距离WD_M，且处理器32 可移动样本以确保焦面放置在适当位置ΔD₁处，如上文描述。随后的所有移 动和分析也可由处理器32自动执行，处理器32控制驱动机构30、F制光圈 24、图像传感器26和图像的对比度分析以确定何时样本处于焦点对准。在 一些实施方案中，应了解，基于驱动机构30对台16的定位，物镜18与台 16的顶部表面之间的距离可为系统的已知值。因此，在一或多个实施方案中， 用户将WD_M和样本S的高度输入到处理器32中，且显微镜系统10可接着 自动(a)将样本S移动到适当位置以将近焦面PFF或远焦面DFF放置在景深 外部的必要偏移处，(b)投影F制光圈，且(c)移动样本并监视所投影图像的 标准偏差以确定经验工作距离值。处理器32可考虑样本的高度以确定近焦 面PFF的位置。用户还可输入近焦面PFF下方的所要用户界定的深度或远 焦面DFF上方的所要用户界定的高度以成像，且处理器32和相关联机构可 将样本S移动到适当位置以准确地使深度/高度成像。因此，本发明可自动 且唯一地确定待成像的所关注区域，仅所要图像深度待由操作者输入。自动 化程序是有益的还在于，显微镜系统10可适于相对于物镜横向(以及向上和 向下)移动样本以便使大于一个传感器图像的整个样本成像。在这些较大区 域上成像若由其它非自动装置进行将麻烦且耗时。