用于癌症治疗的GLA单一疗法

摘要

本发明通常涉及在抗原不存在时使用吡喃葡糖基脂A(GLA)治疗癌症的组合物和方法。

说明书

技术领域

本发明通常涉及使用吡喃葡糖基脂A(GLA)治疗癌症的组合物和方法。

背景技术

先天免疫系统是一种进化上古老的系统，其设计为检测是否存在微生物入侵者并激活保护性反应(Beutler,MoI.Immunol.2004,40,845-859)。其对作为病原体组成部分的化合物快速应答，所述病原体被宿主认为是危险信号。这些分子模式的识别是由多组高度保守的受体介导的(vanAmersfoort等，J.Clin.Microbiol.Rev.2003,16,379)，其激活导致急性炎性应答。这些应答包括生成各种细胞因子和趋化因子、引导针对入侵病原体的局部攻击以及起始激活并调节免疫系统适应性组件的应答(Dabbagh和Lewis,Curr.Opin.Infect.Dis.2003,16,199-204；Bevan,Nat.Rev.Immunol.2004,4,595-602；Pasare和Medzhitov,SeminarsImmunol.2004,16,23-26；Finlay和Hancock,Nat.Rev.Microbiol.2004,2,497-504；Akira等，Nat.Immunol.2001,2,675-680；Pasare和Medzhitov,Immunity2004,21,733-741)。

有证据表明先天免疫应答可用于治疗目的，例如开发用于疫苗和治疗多种疾病(包括哮喘、感染和癌症)的佐剂。然而，这类疗法的一个重要顾虑在于，先天免疫的过度激活可导致感染性休克的临床症状(Pittet等，J.Am.Med.Assoc.1994,271,1598-1601；Rice和Bernard,Anna.Rev.Med.2005,56,225-248)。

长久以来，癌症免疫学领域的一个目标是增强免疫介导的抗肿瘤活性，从而实现肿瘤消退和改进癌症肿瘤选择。显然需要增强抗肿瘤免疫应答以用于癌症治疗的组合物和方法。本发明提高了这个和其他相关优势。

发明内容

本发明的一个方面提供了一种治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给予治疗有效量的包含GLA的组合物，所述组合物包含：

(a)下式的GLA：

其中：R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；且R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烷基；以及

(b)药学上可接受的运载体或赋形剂；该组合物不包含抗原。在上文所述方法的一个实施方式中，R¹、R³、R⁵和R⁶是十一烷基且R²和R⁴是十三烷基。在本文所述方法的另一个实施方式中，该哺乳动物是人。在另一个实施方式中，该组合物是水性制剂，且在某些实施方式中，该组合物的形式是水包油乳液、油包水乳液、脂质体、胶束结构或微粒。

在本文所述方法的某些实施方式中，该癌症包括实体瘤，且可以是癌、肉瘤或淋巴癌。在另一个实施方式中，该实体瘤是原发性实体瘤或可以是继发性实体瘤。这些方法可用于治疗多种癌症，包括但不限于：黑素瘤、梅克尔细胞癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、脑癌和胰腺癌。

在某些实施方式中，该组合物通过皮下、皮内、肌肉内、瘤内或静脉内注射给予。在其他实施方式中，该组合物通过鼻内或肺内给予。

在本文所述方法的另一个实施方式中，该组合物与一种或多种治疗剂或治疗联用。在这方面，在某些实施方式中，该治疗剂是抗癌剂。其他治疗剂或治疗可以是化疗剂、免疫检验点抑制剂或激活共刺激通路的抗体(例如但不限于抗CD40抗体)。多种治疗剂中的任一种都可考虑用于本发明，包括但不限于：泰索帝、卡铂、曲妥珠单抗、表柔比星、环磷酰胺、卡铂、顺铂、多西他赛、多柔比星、依托泊甙、5-FU、吉西他滨、氨甲蝶呤和紫杉醇。在某些实施方式中，一种或多种其他治疗性治疗是放疗。

附图简要说明

图1是使用B16黑素瘤细胞注射后给予盐水或GLA的小鼠中随时间变化的肿瘤尺寸。

图2是存活曲线，显示与单独接受盐水的小鼠相比，接受GLA的小鼠具有改善的存活率。

图3：鼠B16F10小鼠足垫黑素瘤的研发。B16F10小鼠足垫黑素瘤是一种灵活的治疗性肿瘤模型。B16F10肿瘤可容易地观察，治疗终点设为肿瘤体积小于100mm²且动物健康，0.3E5B16F10细胞是推荐的最低肿瘤剂量，根据注射的细胞数目，治疗窗口的范围可以是14-40天–可理论性提高肿瘤剂量以将治疗窗口缩短至小于14天。

图4：通过肌肉内给药途径给予GLA-SE显著(p>0.008)改变BALB/c小鼠中B16F10肿瘤细胞的生长动力学。使用威氏符号秩检验进行统计评价。

图5：通过肌肉内给药途径给予GLA-SE显著(p>0.03)增加具有B16F10肿瘤负荷的BALB/c小鼠的生存期。用GBW检验(Gehan-BreslowWilcoxontest)进行统计分析。

图6是接种肿瘤细胞后肌肉内(i.m.)或瘤内(i.t.)给予赋形剂(2％SE)或GLA-SE的小鼠中随时间变化的肿瘤尺寸。使用斯氏T检验进行组间比较。*p<0.05。

图7：B16F10小鼠黑素瘤模型中GLA+/-检验点抑制剂的疗效。A是肿瘤注射后第4、9或14天开始给予GLA-SE(i.t.)或2％SE赋形剂对照的荷瘤小鼠中随时间变化的肿瘤尺寸。B是肿瘤注射后第4天开始给予GLA-SE(i.t.)或2％SE赋形剂对照加免疫检验点抑制剂(抗PDL1、抗PD1、抗CTLA4或LTF2对照抗体；i.p.)的荷瘤小鼠中随时间变化的肿瘤尺寸。使用斯氏T检验进行组间比较：*p＝0.03；**p＝0.005。

图8：B16F10小鼠黑素瘤模型中GLA+/-抗CD40的疗效。A是肿瘤注射后第4、9或14天开始给予GLA-SE(i.t.)或2％SE赋形剂对照加抗CD40抗体(i.p.)的荷瘤小鼠中随时间变化的肿瘤尺寸。B是肿瘤注射后第8和15天给予GLA-SE(i.t.)或2％SE赋形剂对照加肿瘤注射后第5和12天给予抗CD40(i.t.)的荷瘤小鼠中随时间变化的肿瘤尺寸。使用斯氏T检验进行组间比较：*p＝0.03；ns＝不显著。

发明详述

本发明部分涉及以下惊人发现：癌症建立后单独给予GLA导致B16黑素瘤小鼠模型中小鼠存活的提高。GLA已被用作疫苗佐剂以增强针对多种抗原的免疫应答。然而，在本发明前，GLA未被用作治疗癌症的单一疗法。

本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，“一个(种)抗原”包括多个(种)这类抗原，“一个(种)细胞”或“该细胞”包括本领域技术人员已知的一个(种)或多个(种)细胞和其等同物(例如多个(种)细胞)，等等。类似的，“一个(种)化合物”或“一个(种)组合物”分别包括多个(种)这类化合物或组合物，且指一个(种)或多个(种)化合物组合物，除非本文中另有明确说明。在描述或要求保护方法步骤且这些步骤被描述为以特定顺序发生时，在第二步骤“之前”(即前面)发生(或进行)的第一步骤的描述等同于在第一步骤“之后”发生(或进行)第二步骤。指代数字或数字范围时，术语“约”表示所指数字或数字范围是实验变异性内的约数(或在统计学实验误差内)，且因此该数字或数字范围可在所示数字或数字范围的1％至15％之间变化。术语“包含”(以及相关术语如“包括”或“含有”或“具有”)不旨在排除在某些实施方式中(例如本文所述任何物质组合物、组合物、方法或过程等的实施方式)可“由所述特征组成”或“基本由所述特征组成”。

本发明的方法和组合物适用于治疗任何哺乳动物，包括人。其他哺乳动物包括小家畜，特别是伴侣动物和宠物，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、狗和灵长类动物。可治疗的哺乳动物包括，例如，非人灵长类动物(如猴、大猩猩、黑猩猩等)、啮齿类动物(如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔形目动物、猪科动物(如猪、小型猪)、马科动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物和其他家养、农场和动物园动物。本文所述需要治疗的对象已被诊断为患有癌症，或可具有表明该对象处于发生癌症风险下的过度增殖性疾病迹象。示例性癌症病症在下文中详细描述。

适用于本发明所述应用的GLA化合物包括任何以下化合物。不受本发明理论的束缚，本文所述GLA化合物被认为靶向TLR4。TLR4在TLR家族中的独特之处在于经由MyD88和TRIF依赖性通路发生下游信号转导。总之，这些通路刺激DC成熟、抗原加工/呈递、T细胞初免和细胞因子(如IL-12、IFNα/β和TNFα)生产(参加例如Iwasaki等，Nat.Immunol.5:987(2004))。

一种式(Ia)的吡喃葡糖基脂A(GLA)化合物或其药学上可接受的盐：

其中：R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；且R2和R4是C12-C20烷基；在更具体的实施方式中，该GLA具有上文所列式(Ia)其中R1、R3、R5和R6是C11-C14烷基；且R2和R4是C12-C15烷基；在更具体的实施方式中，该GLA具有上文所列式(Ia)其中R1、R3、R5和R6是C11烷基或十一烷基；且R2和R4是C13烷基或十三烷基；

或一种式(Ib)的GLA化合物或其药学上可接受的盐：

其中：L1、L2、L3、L4、L5和L6相同或不同且独立地选择O、NH和(CH2)；L7、L8、L9和L10相同或不同且在任何情况下可以不存在或是C(＝O)；Y1是酸官能团；Y2和Y3相同或不同且各自独立地选自OH、SH和酸官能团；Y4是OH或SH；R1、R3、R5和R6相同或不同且各自独立地选自C8-C13烷基；且R2和R4相同或不同且各自独立地选自C6-C11烷基。

DSLP是一类GLA型化合物，其含有通过接合选自葡萄糖和氨基取代葡萄糖的两个单糖基团形成的二糖(DS)基团，其中该二糖化学结合到一个磷酸(P)基团和多个脂(L)基团上。更具体地，该二糖可视作由两个单糖单元形成，各单糖单元具有6个碳。在该二糖中，单糖之一将形成还原端，且另一个单糖将形成非还原端。为方便起见，形成还原末端的单糖的碳将表示为位于位置1、2、3、4、5和6处，而形成非还原末端的单糖的相应碳原子将表示为位于位置1’、2’、3’、4’、5’和6’处，其遵循常规碳水化合物命名方法。在DSLP中，非还原末端的1位碳通过醚(-O-)或氨基(-NH-)基团连接至还原末端的6’位碳。该磷酸基团将连接至二糖，优选通过非还原末端的4’碳。各脂基团将通过酰胺(-NH-C(O)-)或酯(-O-C(O)-)连接接合至二糖，其中羰基接合至脂基团。该二糖具有7个位置可连接至酰胺或酯基，即非还原末端的2’、3’和6’位以及还原末端的1、2、3和4位。

例如，该脂基团具有至少3个碳，或至少6个碳，优选至少8个碳，且更优选至少10个碳，其中在各情况下，该脂基团具有不超过24个碳，不超过22个碳，或不超过20个碳。在一个实施方式中，这些脂基团总共提供60-100个碳，优选70-90个碳。脂基团可仅由碳和氢原子组成，即其可以是烃基脂基团，或其可以含有一个羟基，即其可以是羟基取代的脂基团，或其可以含有酯基，该酯基继而通过酯基的羰基(-C(O)-)接合至烃基脂或羟基取代的脂基团，即酯取代的脂。烃基酯基团可以是饱和的或不饱和的，不饱和烃基脂基团将在相邻的碳原子之间具有一个双键。

该DSLP包含3或4或5或6或7个脂基团。在一个方面中，该DSLP包含3-7个脂基团，而在另一个方面中，该DSLP包含4-6个脂基团。在一个方面中，该脂基团独立地选自烃基脂、羟基取代的脂和酯取代的脂。在一个方面中，使用羟基取代1、4’和6’位。在一个方面中，该单糖单元各自是葡糖胺。该DSLP可以是游离酸形式，或盐形式，例如铵盐。

在某些实施方式中，DSLP上的脂如下文所述：使用–O-(CO)-CH2-CH(Ra)(-O-C(O)-Rb)取代3’位；使用–NH-(CO)-CH2-CH(Ra)(-O-C(O)-Rb)取代2’位；使用–O-(CO)-CH2-CH(OH)(Ra)取代3位；使用–NH-(CO)-CH2-CH(OH)(Ra)取代2位；其中，Ra和Rb各自选自癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基，各术语都指饱和烃基。在一个实施方式中，Ra是十一烷基且Rb是十三烷基，该化合物描述于例如美国专利申请公开2008/0131466中作为“GLA”。其中Ra是十一烷基且Rb是十三烷基的化合物可以立体化学限定的形式使用，其可以PHAD^TM佐剂的形式购自例如阿凡提极性脂质制品公司(AvantiPolarLipids)。

在一个方面中，该DSLP是称作3D-MPL的天然衍生化合物的混合物。3D-MPL佐剂由GSK公司(GlaxoSmithKlineCompany)以药物级别生产，作为其MPL^TM佐剂。3D-MPL已被广泛描述于科学和专利文献，参见例如，VaccineDesign:thesubunitandadjuvantapproach(《疫苗设计：亚基和佐剂方法》)，PowellM.F.和Newman，M.J.编，第21章MonophosphorylLipidAasanadjuvant:pastexperiencesandnewdirections(单磷酸脂A作为佐剂：过去的经验和新方向)，J.T.和Myers,K.R.著，普莱南出版社(PlenumPress)，纽约(1995)以及美国专利号4,912,094。

在另一个方面中，该DSLP混合物可描述为包含(i)二葡糖胺主链，其还原末端葡糖胺连接至非还原末端葡糖胺，所述连接是通过非还原末端葡糖胺的己糖胺1位与还原末端葡糖胺的己糖胺6位之间的醚键；(ii)与非还原末端葡糖胺的己糖胺4位相连的O-磷酰基；以及(iii)最多6个脂肪酰基链；这些脂肪酰基链之一通过酯键连接至还原末端葡糖胺的3-羟基，这些脂肪酰基链之一通过酰胺键连接至非还原末端葡糖胺的2-氨基且包含通过酯键连接至超过12个碳原子的烷酰基链的十四烷酰链；且这些脂肪酰基链之一通过酯键连接至非还原末端葡糖胺的3-羟基且包含通过酯键连接至超过12个碳原子的烷酰基链的十四烷酰链。参见例如，美国专利公开号2008/0131466。

在另一个方面中，该GLA化合物可以是具有6个脂基团的合成的二糖，参见美国专利公开号2010/0310602。

在另一个方面中，DSLP如化学式(II)所述：

其中，部分A1和A2独立地选自氢、磷酸酯和磷酸盐。对于磷酸盐而言，钠和钾是示例性抗衡离子。部分R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自具有3-23个碳的烃基(表示为C3-C23)。为更清楚起见，应理解，当一个部分“独立地选自”含有多个成员的特定基团时，第一部分所选成员在任何情况下都不会影响或限制第二部分成员的选择。R1、R3、R5和R6接合的碳原子是不对称的，且因此可以R或S立体化学结构存在。在一个实施方式中，所有那些碳原子都是R立体化学结构，而在另一个实施方式中，所有那些碳原子都是S立体化学结构。

本文中，“烷基”指直链或支链、非环状或环状、不饱和或饱和的脂族烃，其含有1-20个碳原子，且在某些优选实施方式中含有11-20个碳原子。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环烷基包括环戊烯基和环己烯基等。环烷基在本文中也称作“同素环”或“同素环状环”。不饱和烷基在相邻的碳原子之间含有至少一个双键或三键(分别称作“烯基”或“炔基”)。代表性支链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等；而代表性支链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。例如，“C18-13烷基”和“C6-11烷基”表示上文所定义的烷基，分别含有8-13或6-11个碳原子。

本文中，“酸官能团”指能够在水性介质中供给质子的官能团(即布朗斯台德-劳里酸)。供给质子后，酸官能团成为带负电荷的物质(即酸官能团的共轭碱)。酸官能团的示例包括但不限于：-OP(＝O)(OH)₂(磷酸酯)、-OS(＝O)(OH)₂(硫酸酯)、-OS(OH)₂(亚硫酸酯)、-OC(OH)₂(碳酸酯)、-OC(＝O)CH(NH₂)CH₂C(＝O)OH(天冬氨酸酯)、-OC(＝O)CH₂CH₂C(＝O)OH(琥珀酸酯)以及-OC(＝O)CH₂OP(＝O)(OH)₂(羧甲基磷酸酯)。

本文中，“烃基”指完全由氢和碳形成的化学部分，其中碳原子的排列可以是直链或支链、非环状或环状，且相邻碳原子之间的连接可以完全是单键，即提供饱和烃基，或者两个相邻碳原子之间可存在双键或三键，即提供不饱和烃基，且烃基中碳原子的数目是3-24个碳原子。该烃基可以是烷基，代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；而支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环烃基包括环戊烯基和环己烯基等。不饱和烃基在相邻的碳原子之间含有至少一个双键或三键(如果该烃基是非环状的，分别称作“烯基”或“炔基”，如果该烃基是至少部分环状的，分别称作环烯基和环炔基)。代表性支链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等；而代表性支链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。

式(II)的化合物可通过本领域已知的合成方法获得，例如PCT国际公开号WO2009/035528(其通过引用纳入本文)以及WO2009/035528中提及的出版物(其也各自通过引用纳入本文)中公开的合成方法。还可通过购买获得某些这类化合物。

该DSLP化合物可通过本领域已知的合成方法获得，例如PCT国际公开号WO2009/035528(其通过引用纳入本文)以及WO2009/035528中提及的出版物(其也各自通过引用纳入本文)中公开的合成方法。化学合成的DSLP化合物(如式(II)的化合物)可以基本均匀的形式制备，其表示该制剂相对于存在的DSLP分子(如式(II)的化合物)是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少96％、97％、98％或99％纯。给定制剂纯度的测定可由熟悉适当分析化学方法的技术人员容易地完成，例如通过气相色谱、液相色谱、质谱和/或核磁共振分析。获自天然来源的DSLP化合物通常不能容易地制备为化学纯形式，且因此优选合成制备的化合物用于本文所述治疗癌症的组合物和方法。如前文所述，可通过购买获得某些DSLP化合物。一种这类DSLP化合物是阿凡提极性脂质制品公司(阿拉巴马州阿拉巴斯特)的产品目录中的产品号699800，参见下文与E10联用的E1。

在多个实施方式中，该化合物具有式(II)的化学结构但部分A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5和R6选自前文针对这些部分提供的选项的子集，这些子集在下文中鉴定为E1、E2等。

E1：A1是磷酸酯或磷酸盐且A2是氢。

E2：R1、R3、R5和R6是C3-C21烷基；且R2和R4是C5-C23烃基。

E3：R1、R3、R5和R6是C5-C17烷基；且R2和R4是C7-C19烃基。

E4：R1、R3、R5和R6是C7-C15烷基；且R2和R4是C9-C17烃基。

E5：R1、R3、R5和R6是C9-C13烷基；且R2和R4是C11-C15烃基。

E6：R1、R3、R5和R6是C9-C15烷基；且R2和R4是C11-C17烃基。

E7：R1、R3、R5和R6是C7-C13烷基；且R2和R4是C9-C15烃基。

E8：R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；且R2和R4是C12-C20烃基。

E9：R1、R3、R5和R6是C11烷基；且R2和R4是C13烃基。

E10：R1、R3、R5和R6是十一烷基；且R2和R4是十三烷基。

在某些实施方式中，E2至E10各自与实施方式E1联用，和/或E2至E9的烃基是烷基，优选直链烷基。

美国专利公开号2008/0131466提供了制剂，如GLA化合物的水性制剂(AF)和稳定的乳液制剂(SE)，这些制剂可针对任意式(I)的化合物使用。

本发明提供了刺激癌症患者中免疫应答的组合物。通常，可通过多种熟知参数中的任一种检测免疫应答，包括但不限于体内或体外测定以下物质：可溶性免疫球蛋白或抗体；可溶性介导物如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等以及其他可溶性小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介导物；通过免疫系统细胞的功能或结构性质改变而测定的细胞激活状态变化，例如细胞增殖、改变的移动性、特殊活性(如特定基因表达或细胞裂解行为)的诱导；免疫系统细胞的细胞分化，包括表面抗原表达特化的变化或开始凋亡(程序性细胞死亡)；细胞毒性T细胞、激活的巨噬细胞或天然杀伤细胞的增加；或者可检测是否存在免疫应答的任何其他标准。

进行这些和类似试验的方法是熟知的且可参见，例如，Lefkovits，ImmunologyMethodsManual:TheComprehensiveSourcebookofTechniques(《免疫方法手册：全面的技术来源资料》)，1998；也可参见CurrentProtocolsinImmunology(《新编免疫学实验手册》)；也可参见Weir，HandbookofExperimentalImmunology(《实验免疫学手册》)，1986，布莱克威尔科学公司(BlackwellScientific)，马萨诸塞州波士顿；Mishell和Shigii(编)SelectedMethodsinCellularImmunology(《细胞免疫学的选用方法》)，1979，弗里曼出版公司(FreemanPublishing)，加利福尼亚州旧金山；Green和Reed,1998Science281:1309以及本文中引用的参考文献。

可通过多种已知技术实现肿瘤反应性T细胞增殖的检测。例如，可通过测量DNA合成速率来检测T细胞增殖，并可通过控制候选肿瘤反应性T细胞接触的刺激(例如特定所需肿瘤或对照抗原脉冲的抗原呈递细胞)来测定肿瘤特异性。经刺激增殖的T细胞表现出DNA合成速率提高。测量DNA合成速率的通常方法是例如通过将T细胞与氚标记的胸苷(一种掺入新合成的DNA中的核苷前体)进行脉冲标记培养。掺入的氚标记的胸苷的含量可使用液体闪烁分光光度仪测定。检测T细胞增殖的其他方法包括测量白介素-2(IL-2)生成、Ca²⁺通量或染料摄取，例如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑盐。或者，可测量淋巴因子(如干扰素γ)的合成或定量可对特定抗原应答的T细胞的相对数目。

抗体生产(如肿瘤特异性抗体生产)的检测可通过例如使用体外方法(如放射性免疫试验(RIA)、酶连免疫吸附试验(ELISA)、平衡透析或固相免疫印迹包括Western印迹)测试来自宿主的样品(如含有免疫球蛋白的样品，如血清、血浆或血液)，所述宿主试验本发明所述的GLA组合物治疗。在优选的实施方式中，ELISA试验还可包括使用特异性针对抗原的固相单克隆抗体对目标肿瘤抗原进行肿瘤抗原捕获固定，从而例如增强试验的灵敏度。还可通过酶连免疫吸附试验(ELISA)容易地测定可溶性介导物(例如细胞因子、趋化因子、淋巴因子、前列腺素等)的细化(Elaboration)，例如使用可容易购得的试剂、设备和方法(例如西格玛公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯；还参见RD系统公司(R&DSystems)2006目录，RD系统公司，明尼苏达州明尼阿波利斯)。

可使用本领域熟知的常规试验监测任意数目的其他免疫参数。这些参数可包括，例如，抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)试验、二级体外抗体应答、使用已良好建立的标志物抗原系统对多种外周血或淋巴单核细胞亚群体进行流式免疫细胞荧光分析、免疫组化或其他相关试验。这些和其他试验可参见，例如，Rose等(编)，ManualofClinicalLaboratoryImmunology(《临床实验室免疫学手册》)，第5板，1997，美国微生物协会，华盛顿特区。

因此，考虑本发明提供的GLA将能够在癌症患者中引发或增强至少一种免疫应答，所述免疫应答选自T_H1型T淋巴细胞应答、T_H2型T淋巴细胞应答、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、抗体应答、细胞因子应答、淋巴因子应答、趋化因子应答和炎性应答。在某些实施方式中，该免疫应答可包括抑制调节性T细胞，例如CD4+FoxP3+T调节细胞的数目减少。在另一个实施方式中，该免疫应答包括瘤内CD8+T效应细胞数目的增加。在某些实施方式中，该免疫应答可包括以下至少一种：生成一种或多种细胞因子(所述细胞因子选自干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α))、生成一种或多种白介素(所述白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18和IL-23)、生成一种或多种趋化因子(所述趋化因子选自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4和CCL5)和淋巴细胞应答(其选自记忆T细胞应答、记忆B细胞应答、效应T细胞应答、细胞毒性T细胞应答和效应B细胞应答)。参见，例如，WO94/00153；WO95/17209；WO96/02555；U.S.6,692,752；U.S.7,084,256；U.S.6,977,073；U.S.6,749,856；U.S.6,733,763；U.S.6,797,276；U.S.6,752,995；U.S.6,057,427；U.S.6,472,515；U.S.6,309,847；U.S.6,969,704；U.S.6,120,769；U.S.5,993,800；U.S.5,595,888；Smith等，1987JBiolChem.262:6951；Kriegler等，1988Cell53:4553；Beutler等，1986Nature320:584；U.S.6,991,791；U.S.6,654,462；U.S.6,375,944。

药物组合物、递送和使用方法

在各实施方式的实施例中，本发明所述GLA化合物在组合物中的含量为0.1-10μg/剂量，或0.1-20剂量，0.1-30μg/剂量，0.1-40μg/剂量，或0.1-50μg/剂量，或1-20μg/剂量，或1-30μg/剂量，或1-40μg/剂量，或1-50μg/剂量，或0.2-5μg/剂量，或含量为0.5-2.5μg/剂量，或含量为0.5-8μg/剂量或0.5-15μg/剂量。剂量可以是，例如，0.5μg/剂量、0.6μg/剂量、0.7μg/剂量、0.8μg/剂量、0.9μg/剂量、1.0μg/剂量、2.0μg/剂量、3.0μg/剂量、3.5μg/剂量、4.0μg/剂量、4.5μg/剂量、5.0μg/剂量、5.5μg/剂量、6.0μg/剂量、6.5μg/剂量、7.0μg/剂量、7.5μg/剂量、8.0μg/剂量、9.0μg/剂量、10.0μg/剂量、11.0μg/剂量、12.0μg/剂量、13.0μg/剂量、14.0μg/剂量或15.0μg/剂量。可根据对象的血液体积、体重、身体面积、重量或递送途径来调节剂量。在一些实施方式中，瘤内给予1ml中2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg或12μg的GLA。在该方面中，可在肿瘤的多个区域等量注射1mL剂量的GLA。在某些实施方式中，将给予约0.01μg/kg至约100mg/kg体重的GLA，通常通过皮内、瘤内、皮下、肌肉内或静脉内途径，或通过其他途径。在某些实施方式中，GLA的剂量是约0.1μg/kg至约1mg/kg，且在某些实施方式中，范围是约0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.3μg/kg、0.4μg/kg、0.5μg/kg、0.6μg/kg、0.7μg/kg、0.8μg/kg、0.9μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、7μg/kg、8μg/kg、9μg/kg、10μg/kg至约200μg/kg。对于本领域技术人员而言显而易见的是，给药的次数和频率将取决于宿主的应答。如本文所述，适当剂量还可取决于患者(例如人)的状态，例如疾病的阶段、总体健康状态，以及年龄、性别和体重，和医疗领域技术人员熟悉的其他因素。如本文他处所述，本发明所述GLA组合物不包含抗原。

可针对任何适当给药方式配制药物组合物，包括例如局部、口服、肠道、鼻(即鼻内)、吸入、鞘内、直肠、阴道、眼内、结膜下、含服、舌下、肺内、皮内、结内、瘤内、透皮或胃肠道外给药，包括皮下、经皮、静脉内、肌肉内、胸骨内、海绵窦内、耳道内、瘤内、颅内、脊柱内或尿道内注射或输注。本文中更详细地描述了给药方法。

包含本发明所述GLA且任选还包含一种或多种其他治疗剂的组合物可配制为用于通过任何途径递送，这些途径提供有效剂量的GLA或一种或多种其他治疗剂。这类给药方法包括口服给药或通过注射递送且可以是液体的形式。液体药物组合物可包含例如，以下一种或多种物质：无菌稀释剂如注射用水，盐水溶液，优选生理盐水，林格氏溶液，等张氯化钠，可用作溶剂或悬浮介质的非挥发油，聚乙二醇，甘油，聚丙二醇或其他溶剂；抗菌剂；抗氧化剂；螯合剂；缓冲剂和用于调节张力的试剂如氯化钠或右旋糖。胃肠道外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。优选使用生理盐水，且可注射药物组合物优选是无菌的。

该GLA组合物还可包含至少一种生理上(或药学上)可接受或合适的赋形剂。用于药物组合物的本领域技术人员已知的任何生理上或药学上合适的赋形剂或运载体(即不干扰活性成分活性的非毒性材料)都可用于本发明所述的组合物。示例性赋形剂包括维持蛋白质稳定性和完整性的稀释剂和运载体。用于治疗应用的赋形剂是熟知的，且描述于例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(《雷明顿：药物科学和实践》)(Gennaro，第21版，马克出版公司(MackPub.Co)，宾夕法尼亚州伊斯顿(2005))，且在本文中更详细地描述。

用于治疗应用的“药学上可接受的运载体”也是药学领域所熟知的，并描述在例如Remington’sPharmaceuticalSciences(《雷明顿药物科学》)，麦克出版公司(MackPublishingCo.)(A.R.Gennaro编，1985)。例如，可使用生理pH下的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。药物组合物可包含防腐剂、稳定剂、染料、甚至是调味剂。例如，可添加苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯作为防腐剂(同上，1449页)。此外，可以使用抗氧化剂和助悬剂(同上)。

“药学上可接受的盐”指本发明的化合物的盐，其衍生自这类化合物和有机或无机酸(酸加成盐)或有机或无机碱(碱加成盐)的组合。本发明的组合物可以游离碱或盐的形式使用，这两种形式都被认为在本发明的范围内。

该药物组合物可以是允许将组合物给予患者的任何形式。例如，该组合物可以是固体、液体或气体(气凝胶)的形式。该药物组合物可通过任何途径给予。典型的给药途径包括但不限于：口服、舌下、经颊、局部、胃肠道外、直肠、阴道、鼻内(例如以喷雾形式)和肺内给药。本文所用属于胃肠道外包括离子电渗(iontophoretic)(例如U.S.7,033,598；7,018,345；6,970,739)、超声波电渗(sonophoretic)(例如U.S.4,780,212；4,767,402；4,948,587；5,618,275；5,656,016；5,722,397；6,322,532；6,018,678)、热(例如U.S.5,885,211；6,685,699)、被动透皮(例如U.S.3,598,122；3,598,123；4,286,592；4,314,557；4,379,454；4,568,343；5,464,387；UK专利号2232892；U.S.6,871,477；6,974,588；6,676,961)、微针(例如U.S.6,908,453；5,457,041；5,591,139；6,033,928)给药且还包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内、海绵窦内、鞘内、节点内、耳道内、尿道内、瘤内注射或输注技术。在具体的实施方式中，本发明所述组合物可通过选自下组的技术皮内给予：离子电渗、微空泡(microcavitation)、超声波电渗或微针。

该药物组合物配制为允许其中含有的活性成分在将组合物给予患者后是生物可利用的。将给予患者的组合物可使用一种或多种剂量单位的形式，例如片剂可以是单个剂量单位，且气凝胶形式的本发明的一种或多种组合物的容器可含有多个剂量单位。

对于口服给药，可存在赋形剂和/或粘结剂。示例是蔗糖、高岭土、甘油、淀粉糊精、海藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。可操作着色剂和/或调味剂。可使用包衣外壳。

该组合物可以是液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个示例，该液体可以是用于口服给药或用于通过注射递送。旨在进行口服给药时，优选的组合物含有一种或多种甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和风味增强剂。对于旨在通过注射给药的组合物，可包含一种或多种表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等张剂。

本发明中使用的液体药物组合物(无论是溶液、悬浮液或其他形式)可包含一种或多种以下运载体或赋形剂：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、优选生理盐水，林格氏溶液，等张氯化钠，非挥发油如角鲨烯，角鲨烷，矿物油，二缩甘露醇一油酸，胆固醇，和/或合成的单甘油酯或双甘油酯(其用作溶剂或悬浮介质)，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。胃肠道外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。可注射的药物组合物优选是无菌的。

在一个具体的实施方式中，本发明的组合物包含小于0.2um的稳定水性悬浮液且还包含选自下组的至少一种组分：磷脂、脂肪酸、表面活性剂、去垢剂、皂苷、含氟脂质等。这类稳定的水性制剂可以是胶束制剂。

在另一个实施方式中，以可被气凝胶化的方式配制本发明的组合物，可配制为粉末或液体制剂。

还可能需要在药物组合物中包含其他组分，例如包括但不限于：油包水乳液、生物可降解油载剂、水包油乳液、脂质体、胶束组分、微颗粒、生物可降解微胶囊和脂质体。

在某些实施方式中，如美国专利号8,273,361；8343,512所述或如公开的国际申请WO2008/153541；WO2009/143457所述配制这些GLA组合物，不同之处在于本发明中不包含抗原。其他合适的制剂描述于WO2013/119856，同样不包含任何抗原。

在具体实施方式中，本文所述包含GLA的组合物包含稳定的水包油乳液或可代谢油。在具体的实施方式中，本发明的组合物包含水包油乳液，其中GLA被纳入油相中。在某些实施方式中，该乳液的油相包含可代谢油。术语可代谢油的含义是本领域熟知的。可代谢可定义为“能够通过代谢转化”(Dorland'sillustratedMedicalDictionary(《道式说明性医学词典》)，WBS公司(W.B.SaundersCompany)，第25版(1974))。该油可以是任何植物性油、植物油、鱼油、动物油或合成油，其对接受者是无毒性的且能够通过代谢转化。坚果(如花生油)、种子和谷粒是植物油的常见来源。也可使用合成油。

在某些实施方式中，本发明所述组合物可包含其他免疫刺激性物质，其可包括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-异谷酰胺(MDP)、葡聚糖、IL12、GMCSF、干扰素γ和IL12。

虽然本领域普通技术人员已知的任何合适运载体都可用于本发明的药物组合物，但运载体的类型将根据给药方式和释放需要缓释而变化。对于胃肠道外给药，如皮下注射，该运载体优选包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服给药，可以使用任何上述运载体或固体运载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解微球(如聚乳酸半乳糖(polylacticgalactide))也可用作本发明的药物组合物的运载体。合适的生物可降解微球公开于例如美国专利号4,897,268和5,075,109。在这方面，该微球优选大于约25微米。

包含GLA的组合物还可含有稀释剂(如缓冲剂)、抗氧化剂(如抗坏血酸)、碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(如EDTA)、谷胱甘肽和其他稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是示例性适当的稀释剂。优选地，用合适赋形剂溶液(如蔗糖)为稀释剂将产物可以配制成冻干物。

这些GLA组合物可旨在用于局部给药，其中运载体可合适地包含溶液、乳液、油膏或凝胶基底。例如，该基底可包含一种或多种以下物质：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂(如水和醇)，以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可存在于药物组合物中用于局部给药。如果旨在进行透皮给药，该组合物可包含透皮贴或离子电渗装置。

本发明提供的组合物可以是多种形式，例如，固体、液体、粉末、水性或冻干形式。

本发明所述包含GLA的组合物还可在给予一种或多种其他治疗剂的同时、之前或之后进行给药。在这方面中，一种或多种其他治疗剂不包含抗原，如肿瘤抗原。因此，本发明所述的GLA组合物可包含其他治疗剂和/或可接受的运载体，但这些组合物不包含抗原且不与抗原联用。对于使用一种或多种治疗剂、运载体或赋形剂配制本发明所述GLA组合物的程度，这类配制的组合物不包含抗原(例如，抗原不作为制剂组分添加)。

这类组合治疗可包括给予单一药物剂型，其含有GLA和一种或多种其他活性剂，并且以其自身的单独药物剂型给予本发明的包含GLA的组合物和各活性剂。例如，包含GLA和其他活性剂的组合物可合并在单个肠内(如口服)剂量组合物(如片剂或胶囊)中给予患者，或以单独的肠内(如口服)剂量制剂给予各试剂。类似地，包含GLA和其他活性剂的组合物可合并在单个胃肠道外(例如已知且在本文中描述的任何胃肠道外途径，例如皮下、皮内、结内、瘤内或肌内)剂量组合物中给予患者(例如在盐水溶液或其他生理上可接受的溶液中)，或以单独的胃肠道外剂量制剂给予各试剂。可通过相同途径或使用不同途径给予本发明所述的组合疗法(例如，瘤内GLA注射与一种或多种其他治疗剂的瘤内注射联用；或瘤内GLA注射与一种或多种其他治疗剂的肌内、静脉内、皮下或其他途径的给药联用；任何给药途径的组合都考虑用于本发明所述的组合疗法)。使用单独的剂量制剂时，包含GLA和一种或多种其他活性剂的组合物可在基本相同时间(即同时)给予，或在单独的交错时间(即依次)并以任意顺序给予；应理解组合疗法包括所有这些方案。

因此，在某些实施方式中，还考虑将本发明的包含GLA的组合物与一种或多种其他治疗剂(如其他抗癌剂或其他缓和性或辅助性疗法)联用。在某些实施方式中，本领域中可接受这类治疗剂作为本文所述特定癌症的标准治疗方法。考虑的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎药、免疫检查点抑制剂、化疗剂、放疗剂或其他活性和辅助性试剂。

在一个实施方式中，包含GLA的组合物与一种或多种癌症治疗剂(包括一种或多种化疗剂)联用。癌症治疗剂的示例包括烷化剂，如塞替哌和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)包含六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲基三聚氰胺；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺甲二氯二乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如阿柔比星、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、C放线菌素、卡奇霉素、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、D放线菌素、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、去甲氧柔红霉素(idambicin)、马赛罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、波非罗霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、块菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物、如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺素剂，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如叶烷酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群；伊达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋胺；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐糖(sizofran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；硫替派；紫杉醇类，如紫杉醇(新泽西州普林斯顿的布里斯托-迈尔斯施贵宝公司(Bristol-MyersSquibbOncology，Princeton，NJ))和多西他赛(法国安东尼市的罗纳普朗克乐安公司(Rhone-PoulencRorer，Antony，France))；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；曲妥珠单抗、多西他赛、铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；二羟基蒽醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如Targretin^TM(蓓萨罗丁)、Panretin^TM(阿利维A酸)；ONTAK^TM(地尼白介素)；埃斯培拉霉素；卡培他滨；和上述任意药物的药学上可接受盐、酸或衍生物。该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、凯奥昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和法乐通(Fareston)；和抗雄激素剂，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述药物的药学上可接受盐、酸或衍生物。其他癌症治疗剂包括索拉非尼和其他蛋白激酶抑制剂，如阿法替尼、阿西替尼、贝伐单抗、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、埃罗替尼、福斯塔玛替尼(fostamatinib)、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、冷瓦替尼(lenvatinib)、木利替尼、尼罗替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼钠、兰尼单抗、鲁索替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、维罗非尼和舒尼替尼；西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司和其他mTOR抑制剂。

在另一个实施方式中，本发明的GLA组合物与另一种免疫刺激剂联用。这类免疫刺激剂包括但不限于：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(MDP)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、干扰素γ和抗CD40抗体或结合并激活共刺激通路的其他抗体(例如CD28、ICOS、OX40、CD27等)。

在一个实施方式中，本发明所述的这些GLA组合物与一种或多种免疫检验点抑制剂联用。免疫检验点指免疫系统的多个抑制性通路，其对于维持自身耐受性至关重要且用于调控免疫应答的持续时间和幅度。肿瘤使用某些免疫检验点通路作为免疫耐受的主要机制，特别是针对特异性针对肿瘤抗原的T细胞(参见，例如，Pardoll,2012Nature12:252；Chen和Mellman2013Immunity39:1)。本发明提供了可与GLA组合物联用且不含抗原的免疫检验点抑制剂。这类组合疗法协同作用以增强抗癌免疫应答。某些病毒还发展出了吸纳(co-opt)免疫检验点通路的机制。因此，在某些实施方式中，这类组合疗法可用于增强抗病毒免疫应答。

免疫检验点抑制剂包括以统计学显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制性通路的任何试剂。这类抑制剂可包括小分子抑制剂或可包括抗体或其可以结合片段(其结合并阻断或抑制免疫检验点受体)或结合并阻断或抑制免疫检验点受体配体的抗体。可靶向用于阻断或抑制的说明性免疫检验点分子包括但不限于：CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族并表达在所有NK、γδ和记忆CD8⁺(αβ)T细胞上)、CD160(也称作BY55)和CGEN-15049。免疫检验点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段或其他结合蛋白，其结合并阻断或抑制以下一种或多种的活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160和CGEN-15049。说明性免疫检验点抑制剂包括特姆单抗(Tremelimumab)(CTLA-4阻断抗体)、抗OX40、PD-L1单克隆抗体(抗B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、尼弗单抗(Nivolumab)(抗PD1抗体)、CT-011(抗PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PDL1抗体)、BMS-936559(抗PDL1抗体)、MPLDL3280A(抗PDL1抗体)、MSB0010718C(抗PDL1抗体)和易普利姆玛/伊匹单抗(抗CTLA-4检验点抑制剂)。

在其他实施方式中，本发明的GLA组合与其他TLR4激动剂或TLR8激动剂或TLR9激动剂联用。这类激动剂可选自肽聚糖、聚I:C、CpG、3M003、鞭毛蛋白和真核细胞核糖体延长和起始因子4a的利什曼原虫同源物(LeIF)。

在另一个实施方式中，本发明的GLA组合物与细胞因子联用。“细胞因子”是由一个细胞群体释放的蛋白质的统称，其作用于另一细胞作为细胞间介导物。这类细胞因子的示例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒管抑制剂；小鼠促性腺素-相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板-生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CgP(GM-CSP)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、1L-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语“细胞因子”包括天然来源或重组细胞培养物来源的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。

在某些实施方式中，本文所述包含GLA的组合物可与氯喹联用，氯喹是一种趋溶酶体剂，其阻止内体酸化并抑制肿瘤细胞诱导的自噬以在加速的细胞生长和营养物消耗中存活下来。更一般地，本文所述包含GLA的组合物可与用作自噬抑制剂、放射致敏剂或化疗致敏剂的治疗剂联用，例如氯喹、米索硝唑、甲硝唑和缺氧性细胞毒素，如替拉扎明。在这一方面，GLA与氯喹或其他放射或化疗致敏剂或自噬抑制剂的这类组合还可与其他癌症治疗剂或化疗联用。

在另一个实施方式中，本文所述包含GLA的组合物可与小分子药物联用，这些小分子药物已知导致杀死肿瘤细胞并随后激活免疫应答，称作“免疫原性细胞死亡”，例如环磷酰胺、多柔比星、奥沙利铂和米托蒽醌。此外，还可与已知增强肿瘤细胞免疫原性的药物联用，例如帕土匹龙(大环内酯B)、靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体7A7.27、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(例如伏立诺他、罗咪酯肽、帕比司他、贝林诺特(belinostat)和恩替诺特)、n3-多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸、其他蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米)、紫草素(紫草根的主要成分)和溶瘤细胞病毒(如TVec(talimogenelaherparepvec))。在其他实施方式中，本文所述包含GLA的组合物可与表观遗传疗法联用，例如DNA甲基转移酶抑制剂(如地西他滨，5-氮杂-2'-脱氧胞苷)，其可局部或全身给予#。

在另一个实施方式中，本文所述包含GLA的组合物可与一种或多种提高DC对肿瘤的ADCC摄取的抗体联用。因此，本发明考虑将包含GLA的组合物与诱导或增强肿瘤细胞消化的任何分子或其片段联用，所述消化是通过抗原呈递细胞并随后将肿瘤抗原呈递至免疫系统。这些分子包括诱导受体结合(如Fc或甘露糖受体)并运输至抗原呈递细胞的试剂，例如抗体、抗体样分子、多特异性多价分子和聚合物。这类分子可与包含GLA的组合物联用进行瘤内给药，或通过不同途径给予。例如，本文所述包含GLA的组合物可与瘤内注射利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、坎帕斯、帕尼单抗、奥法木单抗、布图昔单抗(brentuximab)、帕妥珠单抗、Ado曲妥珠单抗埃姆他辛(Ado-trastuzumabemtansine)、奥比珠单抗(Obinutuzumab)、抗HER1、HER2或HER3抗体(如MEHD7945A；MM-111；MM-151；MM-121；AMG888)、抗EGFR抗体(如尼妥珠单抗，ABT-806)或其他抗体联用进行瘤内给药。能够啮合Fc受体和其他诱导内化的受体的任何多价骨架都可与本发明所述组合疗法联用，例如能够结合与Fc片段连接的目标的肽和/或蛋白质或能够啮合受体的聚合物。

在某些实施方式中，GLA与这类抗体的组合还可与促进共刺激信号的抗体(如抗CTLA-4)联用(例如通过阻断抑制性通路)或与激活共刺激通路的抗体(如抗CD40、抗CD28、抗ICOS、抗OX40、抗CD27抗体)联用。

包含GLA的组合物可单独给予或与其他已知的癌症治疗联用，所述癌症治疗是例如放疗、免疫检查点抑制剂、化疗或其他癌症治疗剂、移植、免疫治疗、激素治疗、光动力治疗等。这些组合物还可与抗生素联用。

本发明涉及以下发现：GLA可用作癌症治疗的单一疗法(例如不是作为疫苗佐剂)。因此，本发明提供了一种治疗患有癌症的哺乳动物的方法，包括给予有效量的包含GLA的组合物，该组合物不包含抗原(例如不包含肿瘤抗原)。根据本发明，短语“不包含一种抗原”或“不包含抗原”指不包含用于引发抗原特异性免疫应答目的的抗原。为此，本发明考虑基本不含抗原的组合物或包含痕量抗原的组合物，前提是存在的抗原量不足以引发针对该抗原的特异性免疫应答。

本发明所述GLA组合物可用于治疗多种癌症。在一个实施方式中，这些本发明所述包含GLA的组合物(其中组合物不包含抗原)可用于治疗多种实体瘤，即癌、肉瘤和淋巴瘤。在某些实施方式中，该癌症是原发性实体瘤，且在某些实施方式中，该癌症是转移性或继发性实体瘤。在某些相关实施方式中，该癌症选自：黑素瘤、肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、输卵管癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、脑癌、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假性粘液瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、梅克尔细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌和威尔姆氏肿瘤。在某些其他相关实施方式中，该癌细胞起源于选自下组的癌症：睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、表皮癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、浆细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症或其他癌症。因此，本发明所述方法包括治疗癌症、缓解癌症症状和抑制癌症转移的方法，包括给予有效量的本文所述包含GLA的组合物，该组合物不包括抗原。如本文所述，本发明所述方法包括治疗癌症、缓解癌症症状和抑制癌症转移的方法，包括给予有效量的本文所述包含GLA的组合物，该组合物不包括抗原，该组合物与治疗有效量的一种或多种其他治疗剂联用。在一个实施方式中，本发明的方法包括一种治疗癌症的方法，包括给予包含GLA的组合物(该组合物不包含抗原)和包含检验点抑制剂或刺激共刺激通路的抗体的组合物。在一个实施方式中，该方法涉及瘤内注射包含GLA的组合物，该组合物不包含抗原，并瘤内共同给予一种或多种其他治疗剂，例如检验点抑制剂或刺激共刺激通路的抗体(如CD40抗体)。在该方法的一个实施方式中，GLA组合物和治疗剂(如检验点抑制剂)同时给予。在该方法的另一个实施方式中，GLA组合物和治疗剂(例如检验点抑制剂、刺激共刺激通路的抗体、细胞因子或其他治疗剂)在单独的时间瘤内给予，其中，例如该检验点抑制剂在注射GLA组合物之前或之后给予。在另一个实施方式中，该方法涉及瘤内注射包含GLA而不含有抗原的组合物，并注射治疗剂(例如但不限于检验点抑制剂或抗CD40抗体)，给药在大约同时进行但通过不同途径(例如腹膜内、i.v.、i.m.)。因此，在本发明的某些实施方式中，GLA组合物和其他治疗剂(例如但不限于检验点抑制剂或抗CD40抗体组合物)可同时或以任意顺序依次给予并通过相同途径在同一位点给予或通过不同途径在不同位点给予。

试剂盒可含有一次或多次剂量的GLA组合物(任选在容器中，如药瓶或泡罩或胶囊或预填充的注射器)和任选的一种或多种其他治疗剂。试剂盒还可含有说明书。说明书统称描述给药方法，包括用于确定对象的适当状态、适当剂量和适当给药方法的方法，从而用于给予组合物。说明书还可包括用于在治疗期间监测对象的指南。

本发明提供的试剂盒还可包括用于向对象给予各本发明所述组合物的装置。用于给药的本领域已知的多种装置中的任一种都可包含在本发明提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于：皮下针头、静脉内针头、微针、导管、无针注射装置、雾化器、吸入器或喷雾器或喷瓶或微喷装置，以及液体分散器，如点眼药器。通常，用于给予组合物的装置与试剂盒的活性组分相容。

本发明实施方式包括但不限于：

1.一种治疗含有癌症的哺乳动物的方法，包括给予有效量的包含GLA的组合物，所述组合物包含：

(a)下式的GLA：

其中：

R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；且

R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烷基；以及

(b)药学上可接受的运载体或赋形剂；

所述组合物不含抗原。

2.一种有效量的包含GLA的组合物，所述组合物包含：

(a)下式的GLA：

其中：

R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；且

R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烷基；以及

(b)药学上可接受的运载体或赋形剂；

所述组合物不包含抗原；用于治疗哺乳动物中的癌症。

3.有效量的包含GLA的组合物的应用，所述组合物包含：

(a)下式的GLA：

其中：

R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；且

R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烷基；以及

(b)药学上可接受的运载体或赋形剂；

所述组合物不包含抗原；用于生产治疗哺乳动物中癌症的药物。

4.前述实施方式中的任一种，其中，R¹、R³、R⁵和R⁶是十一烷基且R²和R⁴是十三烷基。

5.前述实施方式中的任一种，所述哺乳动物是人。

6.前述实施方式中的任一种，所述组合物是水性制剂。

7.前述实施方式中的任一种，所述组合物的形式是水包油乳液、油包水乳液、脂质体、胶束结构或微粒。

8.前述实施方式中的任一种，所述癌症包括实体瘤。本文所述实施方式中的任一种，所述实体瘤是癌、肉瘤或淋巴癌。本文所述实施方式中的任一种，所述实体瘤是原发性或继发性实体瘤。

9.前述实施方式中的任一种，所述癌症选自黑素瘤、梅克尔细胞癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、脑癌和胰腺癌。

10.前述实施方式中的任一种，所述组合物通过皮下、皮内、肌肉内、瘤内或静脉内注射给予。

11.前述实施方式中的任一种，所述组合物通过鼻内或肺内给予。

12.前述实施方式中的任一种，所述组合物与一种或多种治疗剂或治疗联用。

13.实施方式12，所述治疗剂是免疫检验点抑制剂。

14.实施方式12或13，所述治疗剂是激活协同刺激通路的抗体。一种示例性这类抗体是抗CD40抗体。

15.实施方式12或13，所述治疗剂是癌症治疗剂，例如化疗剂。

16.实施方式15，所述癌症治疗剂选自：泰索帝、卡铂、曲妥珠单抗、表柔比星、环磷酰胺、顺铂、多西他赛、多柔比星、依托泊甙、5-FU、吉西他滨、氨甲蝶呤，和紫杉醇、米托蒽醌、帕土匹龙(大环内酯B)、靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体7A7.27、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(伏立诺他和罗咪酯肽)、n3-多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米)、紫草素(紫草根的主要成分)和溶瘤细胞病毒(如TVec(talimogenelaherparepvec))。

17.前述实施方式中的任一种，还包括放疗。

18.实施方式12，其中，一种或多种其他治疗性治疗是放疗。

19.实施方式19包括一种治疗患有癌症的哺乳动物的方法，所述癌症包括实体瘤，包括瘤内给予有效量的包含GLA的组合物，所述组合物包含：

(a)下式的GLA：

其中：

R¹、R³、R⁵和R⁶是十一烷基且R²和R⁴是十三烷基。

(b)药学上可接受的运载体或赋形剂；

所述组合物不含抗原。

20.实施方式19，还包括给予免疫检查点抑制剂。

21.实施方式19，还包括给予抗CD40抗体。

22.实施方式19-21，还包括给予放疗。

其他实施方式和应用在本发明公开内容的基础上对于本领域技术人员而言显而易见。提供了以下实施例，仅作为多个实施方式的示例，而不应理解为以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1

小鼠B16黑素瘤模型中GLA的体内抗肿瘤作用

该实施例显示，在小鼠B16黑素瘤模型中，与盐水治疗相比，GLA有效地降低肿瘤尺寸并增加存活百分比。

B16黑素瘤模型是一种针对实体瘤形成以及转移的已被接受的动物模型(参见例如CurrProtocImmunol.2001年5月；第20章：20.1单元.doi:10.1002/0471142735.im2001s39)。在该研究中，在第-9天时使用3X10⁵个B16细胞皮下接种小鼠(每组n＝10)。在第0天、第9天和第14天使用盐水或5μgGLA-SE肌肉内注射治疗小鼠。

如图1所示，与单独使用盐水相比，GLA-SE治疗降低了小鼠中的肿瘤尺寸。如图2所示，与单独使用盐水相比，GLA-SE治疗提高了小鼠的存活百分比。

因此，这些实验显示，在癌症建立后，单独使用的GLA在已接受的动物肿瘤模型中具有体内抗癌作用，并支持GLA可用作癌症治疗的单一疗法的概念。

实施例2

小鼠B16黑素瘤模型中GLA的体内抗肿瘤作用

使用B16模型进行确认性实验(如下文详述)以进一步确认GLA-SE给药是否降低C57BL/6小鼠中B16F10肿瘤生长。B16足垫黑素瘤模型已在本领域中良好地建立。足垫中的肿瘤生长容易监测，因为B16黑素瘤细胞是黑色的。如图3所示建立该模型。简言之，如下文详述的那样将高(1E6)或低(1E5)剂量的B16F10细胞注射至8周龄C57BL/6J雌性小鼠的足垫中。通过多种途径每3天注射一次GLA-SE(5μg/2％油)，直至处死小鼠(当肿瘤区域达到100mm²时)。

方法：

(第-4天)：培养B16F10细胞；在37℃水浴中使冷冻保存的细胞解冻；B16F10储液，1小瓶：B16-F10ATCC批号59123188；对细胞计数并以2-3E6个细胞/T225烧瓶接种→37℃、5％CO2下孵育。

(第0天)：收获细胞；使用指数生长期中的细胞(约50％融合，10-12E6个细胞/T225烧瓶)；在适当提及的HBSS中胰蛋白酶消耗和重悬细胞以用于表1列举的剂量(通常不超过50ul体积)；在冰水将收获的细胞运输至动物房。

(第0天)：接种小鼠；小鼠：C57BL/6J雌性(注射时8¹/₂周龄)。麻醉小鼠；耳号编码小鼠用于鉴定；皮下注射表1列举的细胞剂量，通过左小鼠足垫；将小鼠放回笼。

(第0+3天，开始)：给予GLA-SE或载剂对照(2％油)；麻醉小鼠；皮下注射GLA-SE(5μg/2％油)或载剂对照至左小鼠足垫(接种肿瘤的同一足垫)或在大腿中肌肉内注射或在尾基部处皮下注射；将小鼠放回笼。

每周记录肿瘤生长2-3次。当肿瘤达到100mm²时通过二氧化碳窒息处死小鼠。

该实验的治疗组列于下文表1：

通过隔天或每天注射GLA来进行其他实验。还可修改GLA-SE剂量和/或制剂。

除上述实验外，还使用本领域技术人员已知的多种不同肿瘤模型系统进行肿瘤模型中GLA单一疗法的进一步确认性实验和表征。使用多种皮下异种移植肿瘤模型、原位肿瘤模型、转移肿瘤模型和同源小鼠肿瘤模型以进一步表征GLA作为癌症中的单一疗法试剂。作为非限制性示例，使用H22、Hepa1-6、P388D1或S180的鼠同源模型系被用于评价肝、白血病和肉瘤肿瘤模型中的GLA单一疗法。多种转移模型也被用于评价GLA单一疗法且非限制性示例包括HCCLM3(肝癌；胃和淋巴结转移)、MKN-45(胃癌；肝和淋巴结转移)、HT-29(结肠癌；转移至肝和淋巴结)、HCT-116(结肠癌；转移至肝和淋巴结)和PC-3(前列腺癌；转移至骨)。多种这类动物模型是市售可得的，例如购自GS公司(GenScript)(新泽西州皮斯卡特维)或查尔斯河实验室公司(CharlesRiverLaboratories)(马萨诸塞州威尔明顿)。适用于测试的其他模型包括但不限于以下癌症的模型：黑素瘤、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、白血病和淋巴瘤。

在这类模型中，使用已建立的细胞剂量通过适当途径(例如皮下、静脉内或模型中通常接受的其他途径)接种肿瘤细胞。每天、隔天、每三天、每周或隔周肌肉内接种一次GLA-SE。盐水可用作对照。在某些情况下，需要使用SE作为额外的对照。评估肿瘤生长和向局部淋巴结的扩散。通过测量淋巴细胞上细胞表面标记物(如CD26、CD27、CD30、CDw137(4-1BB)、CD152(CTLA-4)、CD154(gp39)、CD134(OX-40)、CD95L(Fas配体)、CD45R/B220和Ly-6E(TSA，sca-2))和/或细胞因子表达水平(如IL-2、IFN-γ、IL-17、IL-4、IL-13、IL-10)来针对激活状态评估GLA-SE对PBMC的作用。

实施例3

小鼠B16黑素瘤模型中GLA的体内抗肿瘤作用

进行额外的实验以确认和进一步表征鼠B16黑素瘤模型中GLA的抗癌作用。

在研究的第-6天将5x10⁶个B16F10细胞接种至小鼠(每组n＝10)肋部。随后在第0天、第5天、第15天和第24天使用GLA-SE或安慰剂(盐水)接种小鼠。每三天测量一次个体小鼠的肿瘤尺寸。还比较通过肿瘤尺寸达到400mm²或肿瘤发生损伤时进行安乐死测得的小鼠存活率。该研究的结果显示，使用GLA-SE治疗的小鼠具有显著减小的肿瘤尺寸(p>0.008)，其中在第10天观察到各组间的清晰差异(图4)。使用GLA-SE治疗的小鼠还具有显著(p>0.03)增加的存活时间，其中在第17天后观察到各组间的清晰差异(图5)。

实施例4

鼠肿瘤模型中GLA的体内抗癌作用

该实施例显示，在某些鼠肿瘤模型中，与载剂治疗相比，GLA有效地延缓肿瘤生长。测试的肿瘤模型是B16黑素瘤、CT26结肠癌、4T1乳腺癌和P815肥大细胞瘤。

在该研究中，在第0天时，使用相应数量的肿瘤细胞接种以下小鼠组(每组n＝5)：C57BL/6，5X10⁵个B16F10细胞，在右足垫中皮下接种；BALB/c，5X10⁵个CT26细胞，在右足垫中皮下接种；BALB/c，1X10⁵个4T1细胞，在第4右乳腺脂肪垫内；DBA/2，1X10⁴个P815细胞，在右肋部中皮下接种。在第4天开始并在之后每隔3-4天向小鼠肌肉内(i.m.)或瘤内(i.t.)给予载剂对照(2％SE)或5μgGLA-SE/2％SE，直至研究结束。

如图6所示，与肌肉内给药相比，瘤内给予GLA-SE在多个鼠癌症模型中更有效地延缓小鼠中肿瘤生长。与单独的载剂相比，瘤内给予GLA-SE以统计学显著的方式延缓B16F10和P815肿瘤生长。瘤内给予GLA-SE还延缓4T1肿瘤生长，但这不是统计学显著的。在这三个肿瘤模型中，瘤内注射比肌肉内更有效。虽然肌肉内给予GLA-SE对于B16F10肿瘤生长没有效果，但其轻微延缓了4T1和P815肿瘤生长。瘤内或肌肉内给予的GLA-SE对于CT26肿瘤生长没有作用。

上述数据显示，在癌症建立后，以单一试剂形式使用的GLA在已接受的动物肿瘤模型中具有统计学显著的体内抗癌作用，并支持GLA可用作癌症治疗的单一疗法的概念。

实施例5

B16F10鼠肿瘤模型中与检查点抑制剂联用的GLA的体内抗癌作用

该实施例显示，与载剂治疗相比，在GLA存在时添加某些免疫检查点抑制剂(CPI)进一步延缓了肿瘤生长。

为测定开始GLA给药的最佳时间，在第0天时在右足垫中使用5x10⁵个B16F10个细胞皮下接种雌性C57BL/6小鼠(每组n＝5)。在第4天、第9天或第14天并在之后每隔3-4天向小鼠瘤内(i.t.)给予5μgGLA-SE/2％SE(或2％SE载剂对照)，直至研究结束。当GLA给药在肿瘤注射后4天(而非9或14天)内开始时，其延缓小鼠中的B16F10肿瘤生长(图7A)。

为测定添加CPI是否进一步延缓肿瘤生长，在第0天时在右足垫中使用5x10⁵个B16F10个细胞皮下接种雌性C57Bl/6小鼠(每组n＝5)。在第4天开始并在之后每隔3-4天向小鼠瘤内给予5μgGLA-SE/2％SE(或2％SE载剂对照)加腹膜内(i.p.)给予CPI(抗PDL1、抗PD1、抗CTLA4(克隆9H10)、抗CTLA4(克隆9D9)，或LTF2对照抗体)，直至研究结束。GLAalonedelayedB16F10tumorgrowthinmice(Fig.7B).与单独的SE载剂相比，在GLA存在时添加抗PDL1、抗PD1(p＝0.03)或抗CTLA4(克隆9D9；p＝0.005)进一步延缓肿瘤生长。抗CTLA4(克隆9H10)对于B16F10肿瘤生长没有额外作用，但克隆9D9显示其自身的治疗作用，暗示不同抗体克隆之间的疗效差异。

上述数据显示，在GLA存在时添加免疫检查点抑制剂统计学显著地增强总体体内抗肿瘤作用。

实施例6

B16F10鼠肿瘤模型中与抗CD40共刺激抗体联用的GLA的体内抗癌作用

该实施例显示，与载剂治疗相比，在GLA存在时添加抗CD40进一步延缓了肿瘤生长。

CD40表达于抗原呈递细胞上并且是一种重要的共刺激分子，用于激活T细胞、B细胞、树突细胞和巨噬细胞。先前已证明抗CD40通过激活先天免疫应答(例如移动巨噬细胞)而具有抗肿瘤作用(BuhtoiarovIN等，JImmunother2005；174:6013-6022)。

为测定添加抗CD40是否进一步延缓肿瘤生长，在第0天时在右足垫中使用5x10⁵个B16F10个细胞皮下接种雌性C57Bl/6小鼠(每组n＝5)。在第4天开始并在之后每隔3-4天向小鼠以100μg瘤内给予5μgGLA-SE/2％SE(或2％SE载剂对照)加腹膜内给予抗CD40(或2A3对照抗体)，直至研究结束(图8A)。单独的GLA或抗CD40都延缓了小鼠中的B16F10肿瘤生长。与使用对照抗体的GLA-SE相比并与SE对照相比，GLA和抗CD40的组合进一步延缓了肿瘤生长且该延缓是统计学上显著的。

为确定抗CD40释放在肿瘤微环境中发挥抗肿瘤效果，在肿瘤注射后第8和15天向荷瘤小鼠瘤内给予2μgGLA-SE/2％SE(或2％SE载剂对照)并在肿瘤注射后第5和12天向荷瘤小鼠瘤内给予50μg抗CD40(或2A3对照抗体)。给予GLA和抗CD40的次优剂量以避免掩蔽可能的组合协同效应。虽然单独的GLA或抗CD40都延缓肿瘤生长，但局部注射至肿瘤的GLA和抗CD40的组合不进一步延缓生长。腹膜内和瘤内给予抗CD40之间所观察到的疗效差异表明：系统性或局部激活先天免疫应答的1)治疗方案或2)靶向可以是诱导抗肿瘤效果的关键因素。

上述数据表明，系统性添加抗CD40(腹膜内)在体内统计学显著地增强瘤内施用的GLA的抗肿瘤作用。

实施例7

人患者的梅克尔细胞癌中瘤内注射GLA-SE的体内抗癌作用

该实施例描述了对瘤内给予GLA-SE的第一名人患者的初步观察。

梅克尔细胞癌(MCC)是一种罕见但具有高侵袭性的皮肤癌，其死亡率比恶性黑素瘤高得多。虽然对于局部区域MCC患者使用手术或辐射，但复发率高且不存在已建立的佐剂疗法。梅克尔细胞多瘤病毒(MCPyV)是一种常见的病毒，存在于十分之八的MCC中并被认为涉及该疾病的病因。

已对三名MCC患者进行治疗作为名称为“梅克尔细胞癌患者中瘤内注射GLA-SE的概念验证临床试验”的I期临床试验的一部分。该研究中包括的患者具有生物活检确认的梅克尔细胞癌以及转移性或局部区域性疾病。患者必须具有至少一个可注射病变，其定义为可通过触摸精确定位、稳定化的可容易触摸的浅表性病变(皮肤、皮下或淋巴结)，且足够潜以允许进行瘤内(i.t.)注射。招募后，对患者使用5ugGLA-SE(1mL)直接注射至肿瘤两至三次，如实验方案中详述的那样。

一名具有局部区域性疾病的患者在股淋巴结中在第1和8天瘤内接受2次剂量的GLA-SE。出乎意料地，在第21天的手术切除时，通过病理检查接触的病变，发现患者在经治疗的肿瘤中具有完全应答而不具有癌症迹象。初始观察显示肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的富集。作为标准护理的一部分，患者将接受手术后佐剂化疗。

还治疗了两名显示具有转移性疾病的其他患者。一名患者在第一周期期间没有明显应答且疾病进展。该患者目前已结束研究。另一名患者也具有转移性疾病并在第三次剂量后在两个注射位点处具有炎症。对于该患者，未提供关于未注射病变的信息且目前无法得到其他信息。

该实施例首次描述了来自I期临床试验的人中的结果，该I期临床试验研究外源性抗原不存在时GLA的瘤内注射。完全出乎意料的是该类型癌症中的完全应答，所述癌症在历史上对治疗具有相当的耐性。虽然这些结果是初步的且初次应答在单个患者中观察到，但其表明瘤内注射的GLA-SE具有抗癌作用且进一步支持以下概念，即可以在不使用抗原的情况下将GLA用于癌症治疗。

实施例8

用于治疗滤泡性低级NHL的瘤内GLA、抗CTLA-4和利妥昔单抗

该实施例描述了以下研究，即GLA与抗CTLA-4和利妥昔单抗联用用于治疗癌症。

使用瘤内注射GLA、抗CTLA-4和利妥昔单抗在单个种类位点处治疗患者，剂量为每周重复一次，持续8-10周。检查了两种不同的剂量水平。进行II期试验用于低对比高剂量的GLA与固定剂量的抗CTLA-4和利妥昔单抗的随机化研究。在基线处并每周进行分期研究，持续八周。终点包括注射位点处的直接应答、远端的远位应答、总体应答(完全应答/部分应答)、距离进展的时间/无进展存活和距离下一治疗的时间。

这些研究将测试GLA与抗CTLA4抗体和提高树突细胞或其他抗原呈递细胞至肿瘤抗原的ADCC摄取的抗体(如利妥昔单抗)的组合是否能够增强抗肿瘤免疫应答并对癌症患者提供治疗益处。

可以组合上文所述各种实施方式以提供进一步的实施方式。本说明书引用的和/或申请数据单中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用全文纳入本文。所述实施方式的各方面可被修改，必要时可应用各种专利、申请和出版物的概念，以提供更多的实施方式。

对所述实施方式的这些和其它变化可以根据以上详述的提示作出。通常，在下文实施方式中，使用的术语不应理解为将权利要求限制为说明书和权利要求中公开的特定实施方式，而应理解为根据权利要求要求的等同形式的全部范围包括所有可能的实施方式。因此，权利要求书不局限于具体公开。