从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法

摘要

本发明涉及一种从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法。该方法包括以下步骤：将胎盘去除羊膜和瘀血后，反复冲洗胎盘表面进行消毒处理；剪取胎儿面绒毛膜于玻璃皿中，尽量剔除表面残留的胎盘小叶组织，剪碎至小块；使用网，用大量生理盐水冲洗组织小块，去除其中残留的血细胞；组织消化：使用混合酶，在恒温摇床振荡消化；消化结束后加适量FBS终止，滤网过滤，加大量生理盐水冲洗滤渣，获得尽量多的细胞；离心，弃上清，加盐水洗涤，离心，得单核细胞；磁珠分选(OCT-4阳性、Nanog阳性和STRO-1阴性)，获得目标细胞。本发明还涉及该方法获得的亚全能干细胞以及它们的制药用途。这些亚全能干细胞具有优异的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞领域，涉及一种来源于胎盘胎儿面绒毛膜的亚全能干细胞的方法，还涉及 一种从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法，本发明进一步涉及该亚全能干细胞的用途。 所得的亚全能干细胞还可以进一步地被扩增。

背景技术

哺乳动物生物体是由万亿个细胞构成的。细胞是人体的基本结构单位和功能单位，由干细胞 分化而来，因此干细胞是人体各种组织器官的起源细胞。干细胞具有自我复制和多向分化的特征。 在正常生殖生理过程中，干细胞由受精卵分化而来。受精卵最初发育形成原始胚胎干细胞，后者 具有形成完整个体的全部潜能。原始胚胎干细胞进一步分化增殖形成囊胚样结构，其内层细胞群 的细胞也称胚胎干细胞。囊胚内层的单个胚胎干细胞不能形成一个完整的个体，但具有形成人体 各种组织的全能性。囊胚胚胎干细胞继续分化发育，逐步形成胎儿各器官的功能执行细胞，同时 以不对称分裂增殖的模式在机体组织特别是造血组织，包括连接胎儿和母体的胎盘脐带血、骨髓、 外周血、肝和脾中保留有不同分化潜能的干细胞。在整个胎儿发育到成年这个漫长而复杂的过程 中，干细胞逐级丧失其全能性，形成亚全能干细胞(Pluripotentstemcell，PSC；亦有称为 sub-totipotentstemcells)、多能干细胞(Multipotentstemcell)和专能干细胞(Specializedstemcell)， 后者按分化功能分别称造血干细胞、血管干细胞、皮肤干细胞，等等。这些处于不同发育阶段的 干细胞在人体组织器官的发育生长、损伤修复过程中发挥着决定性的作用，因此干细胞可以用来 新陈代谢、修复组织器官，使机体活力旺盛而保持健康状况。

迄今为止，人们对造血干细胞等专能干细胞的了解和临床使用比较深入，对胚胎干细胞的了 解也有长足的进展，但对亚全能干细胞，即在发育阶段及分化能力上与胚胎干细胞接近，表达胚 胎干细胞的许多特征，又具备多能干细胞的许多生物学特征，移植到体内不产生畸胎瘤，这样一 类干细胞了解甚少。

但是，亚全能干细胞属于成体干细胞范畴，避免了类似胚胎干细胞的医学伦理问题，其在临 床上具有广阔现实的应用前景。因此，亚全能干细胞已经成为干细胞研究的一个热点。

近年来研究表明，在成体胎盘组织中，富含着一种具有多向分化能力的亚全能干细胞。胎盘 是哺乳动物妊娠期间母子间交换物质的过渡性器官，其生理功能已被广泛研究，但是胎盘作为一 种细胞资源，其研究还处在起步阶段。也就是说，上皮层的形成早于内、中、外三个胚层的发生， 因此，胎盘亚全能细胞的分化能力强于其他起源于三个胚层的多能干细胞。根据已有的研究显示， 胎盘亚全能细胞可以向内、中、外三个胚层的细胞进行分化，例如，胎盘亚全能细胞可以诱导分 化成为心肌细胞、神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞等等。此外，多项动物实验表明，胎盘亚全能 细胞可以有效治疗肺纤维化、肝硬化、帕金森和多发性硬化等病症。

胎盘亚全能干细胞是一种重要的细胞资源。因此人胎盘亚全能干细胞属于成体干细胞范畴， 避免了胚胎干细胞的伦理争议，而且胎盘的获取容易，不会对产妇造成二次伤害，具有非常广阔 的市场前景。

现有技术已有诸多关于亚全能干细胞提取制备方法。例如，CN101748096B(200810240040.8) 公开了一种新的亚全能干细胞制剂生产工艺技术及其用途，该干细胞制剂特征是：从人胎盘或脐 带分离提取CD151+CD31-Sox-2+的亚全能干细胞，在特定培养条件下贴壁生长，传代扩增至20 代仍然基因稳定，注射至动物体内不产生畸胎瘤。这些亚全能干细胞高表达CD151和胚胎干细胞 标志Oct4和Sox-2，以及间叶组织、神经、血管、肝、肌组织细胞的一些特异性标志，不表达CD31、 CD34、CD45、HLA-II。在体外培养和动物体内向人体三个胚层的组织细胞分化，并能修复相应 组织的损伤，改善其功能。本发明建立了PSC的组织分离和培养以及规模化制备工艺技术，制备 出高纯度注射制剂。该亚全能干细胞制剂的有益效果是在动物和人体临床试验中，对许多组织器 官损伤或衰老导致的疾病有良好的疗效，且无毒副作用，异体使用不产生免疫排斥反应。

CN102703380B(201210166714.0)公开了一种亚全能干细胞，其来源于剪断的人类脐带或胎盘， 细胞标志是CD151+OCT4+CD184-，其在培养容器中贴壁生长，能向人体内、中、外胚层组织分 化。本发明也公开了该亚全能干细胞的制备方法，及其用于制备治疗细胞损伤或细胞衰老疾病的 药物中的用途，以及其用作基因治疗药物的载体细胞的用途。

CN103275926B(201310170574.9)公开了一种从胎盘小叶组织中提取亚全能干细胞的方法，特 点是包括胎盘预处理后，利用胎盘小叶组织制备细胞悬液，再利用细胞悬液制备得到亚全能干细 胞分离液的步骤；然后将亚全能干细胞分离液进行原代培养和二代培养，收集二代培养过程中完 全脱落细胞即得到亚全能干细胞的步骤；最后进行程序降温冻存，将温度降至-80～-90.0℃后取出 冻存样本，放入液氮储存罐长期保存即可，优点是传代能力可达20代，不仅具有向成骨、软骨、 脂肪和神经细胞分化的能力，还具有向胰岛细胞和表皮细胞分化的能力，亚全能干细胞均一、稳 定、生长周期短，操作简单，成本低。

CN103966159AB(201410050051.5)公开了一种人胎盘亚全能干细胞，其来源于剥离的人类胎 盘羊膜，针对羊膜的上皮层和间充质层所含有的细胞特点，采用了逐步分离的方法，最大限度地 减少了羊膜间充质层细胞对胎盘亚全能细胞的污染，有效地提高了人胎盘亚全能细胞的干性。该 方法具有成本低、应用前景广阔、可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。本发明还提供了 一种从胎盘羊膜制备人胎盘亚全能干细胞并建立干细胞库的方法。

CN104152408A(201410400235.X)公开了亚全能干细胞的制备方法，包括如下步骤：组织的获 得，消毒处理，组织的分离、洗涤和剪碎，胶原酶消化，亚全能干细胞的获得。本发明公开了一 种从脐带、胎盘羊膜、绒毛膜或基蜕膜组织中分离亚全能干细胞的方法，获得的亚全能干细胞均 一、稳定、生长周期短。

然而，本领域仍然期待有新的提取制备亚全能干细胞的方法，并且期待这种方法具有优异的 效能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的提取制备亚全能干细胞的方法，并且期待这种方法具有优异 的效能。本发明另一目的在于提供一种亚全能干细胞。本发明的再一目的在于提供亚全能干细胞 的用途。

为此，本发明第一方面提供了一种从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法，该方法 包括以下步骤：

(1)从采集盒中取出胎盘于白瓷盘中，去除羊膜和瘀血后，使用生理盐水反复冲洗胎盘表面， 进行消毒处理；

(2)转移至新白瓷盘中，剪取胎儿面绒毛膜于100mm玻璃皿中，尽量剔除表面残留的胎盘小 叶组织，剪碎至0.5～1.5mm³左右的小块；

(3)使用300目筛网，用大量生理盐水冲洗组织小块，去除其中残留的血细胞；

(4)组织消化：使用1～2倍组织体积的混合酶(0.1mg/ml的I型胶原酶，0.1mg/ml的II型胶原 酶，0.1mg/ml透明质酸酶和0.05mg/ml中性蛋白酶)，在37度恒温摇床100rpm振荡消化10～30min；

(5)消化结束后加适量FBS终止，300目滤网过滤，加大量生理盐水冲洗滤渣，获得尽量多的 细胞；

(6)滤液经1000～2000rpm(特别是1500rpm)离心5～15min(特别是10min)后，弃上清，再加生理 盐水洗涤，1000～1500rpm(特别是1200rpm)离心2～10min(特别是5min)，得单核细胞；

(7)磁珠分选(OCT-4阳性、Nanog阳性和STRO-1阴性)，获得目标细胞。

根据本发明第一方面的方法，其中还进一步包括如下步骤：

(71)对所得目标细胞取样，细胞计数仪(例如Sysmex)计数，流式细胞仪(例如FC500)检测其活 性。

根据本发明第一方面的方法，其中还进一步包括如下步骤：

(72)采用程序降温仪冻存目标细胞，储备。

根据本发明第一方面的方法，其中还进一步包括如下扩增步骤：

(73)将目标细胞接种至多个T25培养瓶(0.5～2×10⁵细胞/瓶，特别是1×10⁵细胞/瓶)中，添加亚 全能干细胞培养基(DMEM-F12培养基+10％FBS+10ng/ml成纤维细胞生长因子BFGF+10ng/mL人 表皮细胞生长因子)，传至P1代后，收获，冻存，储备，任选地进行流式鉴定。

根据本发明第一方面的方法，其中所用的生理盐水是无菌的。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中将胎儿面绒毛膜剪碎至1mm³左右的小块。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中使用1.5倍组织体积的混合酶。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中的混合酶中还包含0.01～0.03mol/L枸橼酸。特别 是包含0.02mol/L枸橼酸。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，在37度恒温摇床100rpm振荡消化20min。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(73)中，将亚全能干细胞接种到无菌培养瓶内，并加 入培养液，然后置于37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5％的培养箱内开始原代培养3～4天后； 将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培养箱内 继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到75～85％的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将浓度为 0.25％的胰蛋白酶溶液按20％培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃消化1～5分钟后， 将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落的细 胞和培养液倒入离心管内，于1000～2000rpm离心5～10分钟，将离心所得的沉淀用含10％胎牛血 清的培养液混匀沉淀，收集培养过程中完全脱落细胞即得到经扩增的亚全能干细胞。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存是 照如下方法进行的：

将10％胎牛血清的培养液和99％二甲基亚砜(DMSO)按体积比3:1缓慢混匀后配置成冻存液， 放入冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将 冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮 储存罐长期保存。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存中 所用的冻存程序如下：第一步1～12℃，等待；第二步0.5～1.2℃/分钟降至0～-4℃；第三步5～12℃ /分钟降至-15～-25℃；第四步0.5～1.2℃/分钟降至-35～-45℃；第五步5～12℃/分钟降至-80～-90℃后 取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

本发明采用程控降温仪通过设定适合于胎盘亚全能干细胞冻存的降温速度程序对干细胞进 行冻存。在细胞冻存的过程中，液态水转化为冰，细胞代谢停止，同时，水分也随之散失，导致 细胞内盐、代谢物浓度改变，进而造成渗透压失衡，直接影响细胞复苏后活性。过快或过慢降温 都不是合适的方法，冷冻速率太快，细胞内冰晶形成，破坏细胞内超微结构；冷冻速率太慢，细 胞外冰晶形成，容易导致细胞严重脱水皱缩而死亡，两者都不利于细胞存活。不同细胞冷冻在各 个温度区域有最适合的降温速度。通过使用合适的降温速度程序，将冷冻程序分成多段进行，可 安全而迅速地过度冷冻损害温度区以保持干细胞复苏后的活性。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存中 所用的冻存程序选优如下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃ /分钟降至-40.0℃，最后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

根据本发明任一方面，其中所述的胎盘胎儿面绒毛膜是人类的胎盘胎儿面绒毛膜。

进一步地，本发明第二方面提供了一种亚全能干细胞，其是从胎盘胎儿面绒毛膜中提取得到 的，其表达标志分子OCT-4、Nanog，不表达STRO。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其是照如下包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)从采集盒中取出胎盘于白瓷盘中，去除羊膜和瘀血后，使用生理盐水反复冲洗胎盘表面， 进行消毒处理；

(2)转移至新白瓷盘中，剪取胎儿面绒毛膜于100mm玻璃皿中，尽量剔除表面残留的胎盘小 叶组织，剪碎至0.5～1.5mm³左右的小块；

(3)使用300目筛网，用大量生理盐水冲洗组织小块，去除其中残留的血细胞；

(4)组织消化：使用1～2倍组织体积的混合酶(0.1mg/ml的I型胶原酶，0.1mg/ml的II型胶原 酶，0.1mg/ml透明质酸酶和0.05mg/ml中性蛋白酶)，在37度恒温摇床100rpm振荡消化10～30min；

(5)消化结束后加适量FBS终止，300目滤网过滤，加大量生理盐水冲洗滤渣，获得尽量多的 细胞；

(6)滤液经1000～2000rpm(特别是1500rpm)离心5～15min(特别是10min)后，弃上清，再加生理 盐水洗涤，1000～1500rpm(特别是1200rpm)离心2～10min(特别是5min)，得单核细胞；

(7)磁珠分选(OCT-4阳性、Nanog阳性和STRO-1阴性)，获得目标细胞。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中还进一步包括如下步骤：

(71)对所得目标细胞取样，细胞计数仪(例如Sysmex)计数，流式细胞仪(例如FC500)检测其活 性。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中还进一步包括如下步骤：

(72)采用程序降温仪冻存目标细胞，储备。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中还进一步包括如下步骤：

(73)将目标细胞接种至多个T25培养瓶(0.5～2×10⁵细胞/瓶，特别是1×10⁵细胞/瓶)中，添加亚 全能干细胞培养基(DMEM-F12培养基+10％FBS+10ng/ml成纤维细胞生长因子BFGF+10ng/mL人 表皮细胞生长因子)，传至P1代后，收获，冻存，储备，任选地进行流式鉴定。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中所用的生理盐水是无菌的。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中步骤(2)中将胎儿面绒毛膜剪碎至 1mm³左右的小块。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中步骤(4)中使用1.5倍组织体积的混合 酶。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中步骤(4)中的混合酶中还包含 0.01～0.03mol/L枸橼酸。特别是包含0.02mol/L枸橼酸。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中步骤(4)中，在37度恒温摇床100rpm 振荡消化20min。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中步骤(73)中，将亚全能干细胞接种到 无菌培养瓶内，并加入培养液，然后置于37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5％的培养箱内开始 原代培养3～4天后；将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液， 置于上述培养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到75～85％的融合度后，倒掉无菌培养瓶内 培养液；将浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液按20％培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃ 消化1～5分钟后，将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落， 将完全脱落的细胞和培养液倒入离心管内，于1000～2000rpm离心5～10分钟，将离心所得的沉淀 用含10％胎牛血清的培养液混匀沉淀，收集培养过程中完全脱落细胞即得到经扩增的亚全能干细 胞。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能 干细胞进行的冻存是照如下方法进行的：

将10％胎牛血清的培养液和99％二甲基亚砜(DMSO)按体积比3:1缓慢混匀后配置成冻存液， 放入冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将 冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮 储存罐长期保存。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行 的冻存中所用的冻存程序如下：第一步1～12℃，等待；第二步0.5～1.2℃/分钟降至0～-4℃；第三 步5～12℃/分钟降至-15～-25℃；第四步0.5～1.2℃/分钟降至-35～-45℃；第五步5～12℃/分钟降至 -80～-90℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

本发明采用程控降温仪通过设定适合于胎盘亚全能干细胞冻存的降温速度程序对干细胞进 行冻存。在细胞冻存的过程中，液态水转化为冰，细胞代谢停止，同时，水分也随之散失，导致 细胞内盐、代谢物浓度改变，进而造成渗透压失衡，直接影响细胞复苏后活性。过快或过慢降温 都不是合适的方法，冷冻速率太快，细胞内冰晶形成，破坏细胞内超微结构；冷冻速率太慢，细 胞外冰晶形成，容易导致细胞严重脱水皱缩而死亡，两者都不利于细胞存活。不同细胞冷冻在各 个温度区域有最适合的降温速度。通过使用合适的降温速度程序，将冷冻程序分成多段进行，可 安全而迅速地过度冷冻损害温度区以保持干细胞复苏后的活性。

根据本发明第二方面的亚全能干细胞，其中所述方法中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能 干细胞进行的冻存中所用的冻存程序选优如下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃，然后以10.0℃/分钟降 至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液 氮储存罐长期保存。

另外，取本发明下文实施例使用本发明方法制备得到的全部亚全能干细胞(OCT-4阳性率95％ 以上、Nanog阳性率95％以上、STRO-1阴性率2％以下)，照CN102703380B说明书[0108]至[0163] 段所记载的方法进行试验，结果显示：本发明所得的亚全能干细胞在除了在支持造血 (CN102703380B实施例11方法)方面外，其它方面均与CN102703380B的CD151⁺CD184^-Oct4⁺干 细胞(本发明人照CN102703380B实施例1制备得到)相当，且结果均与CN102703380B上记载的 结果相当；但是，出人意料的是，对于“支持造血”方面的效果，本发明实施例所得全部亚全能 干细胞(OCT-4阳性率95％以上、Nanog阳性率95％以上、STRO-1阴性率2％以下)在维持10周后 仍然明显地有集落形成，而CN102703380B的干细胞在7周时基本没有集落形成。

为此，本发明第三方面提供了本发明第一方面任一实施方案制备得到的亚全能干细胞或者本 发明第二方面任一实施方案所述亚全能干细胞的制药用途。

具体地说，本发明第三方面提供了本发明第一方面任一实施方案制备得到的亚全能干细胞或 者本发明第二方面任一实施方案所述亚全能干细胞在制备用于基因治疗的药物中作为载体细胞的 用途。

本发明第三方面提供了本发明第一方面任一实施方案制备得到的亚全能干细胞或者本发明 第二方面任一实施方案所述亚全能干细胞在制备用于治疗细胞损伤或细胞衰老疾病的药物中的用 途。

本发明第三方面提供了本发明第一方面任一实施方案制备得到的亚全能干细胞或者本发明 第二方面任一实施方案所述亚全能干细胞在制备促进干细胞向成脂细胞、成骨细胞、成软骨、心 肌细胞、神经细胞、肝细胞转化及刺激造血的药物中的用途。

本发明第三方面提供了本发明第一方面任一实施方案制备得到的亚全能干细胞或者本发明 第二方面任一实施方案所述亚全能干细胞在制备用于治疗免疫调节异常疾病的药物中的用途。

本发明第三方面提供了本发明第一方面任一实施方案制备得到的亚全能干细胞或者本发明 第二方面任一实施方案所述亚全能干细胞在制备用于治疗大脑损伤疾病的药物中的用途。

本发明第三方面提供了本发明第一方面任一实施方案制备得到的亚全能干细胞或者本发明 第二方面任一实施方案所述亚全能干细胞在制备用于治疗移植物抗宿主病⁽aGVHD)的药物中的用 途。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.经过对胎盘不同部位分别消化研究，发现胎儿面绒毛膜其为胎盘亚全能干细胞的富集区域。 消化富集区域组织，而避免了处理整个胎盘，大大减少了人力和物力。

2.采用了混合酶消化配方，结合恒温摇床，消化时间短，细胞得率高，且细胞活性在90％以 上。

3.细胞活性检测采用了7-aad染色，FC500细胞计数仪上样检测。代替了传统的台盼兰染色法， 结果更准确。

4.胎儿面绒毛膜中也含有间充质干细胞，内皮细胞等其它种类细胞，如果不去除在后续培养 过程中会影响亚全能干细胞的贴壁生长。所以我们通过磁珠分选(OCT-4+Nanog+STRO-1-)筛除这 类细胞。Oct-4和Nanog是多潜能干细胞特定的转录因子，间充质干细胞表达STRO-1抗体，筛 选STRO-1阴性细胞可进一步去除间充质干细胞。

5.亚全能干细胞的流式鉴定方法：我们选取了几个关键性阳性抗体(CD90-PC5、OCT-4-FITC、 NanogPC7)和阴性抗体(CD34-PE、CD45-PE、STRO-1-PE)四色上样，结果良好。

此外，经检测，本发明得到的胎盘亚全能干细胞的CD73、CD90、CD105、CD151、CD200、 Oct-4、HLA-G表达率均在90％以上，而CD14、CD45、CD79α、HLA-DR、CD184表达率均在 2％以下，说明我们分离得到的是胎盘亚全能干细胞而不是其他细胞。

本发明的干细胞经集落培养后，形成的集落种类较多，比如：CFU-E(红细胞形成单位)、 CFE-G(粒细胞集落形成单位)、CFU-GEMM(粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞－集落形成单 位)、CFU-GM(粒细胞、巨噬细胞-集落形成单位)、CFU-M(巨细胞-集落形成单位)，并且形成的集 落数较多。

本发明得到的胎盘亚全能干细胞传代能力可达20代，不仅具有向成骨、软骨、脂肪和神经 细胞分化的能力，还具有向胰岛细胞和表皮细胞分化的能力。

综上所述，本发明是一种实用简单的从胎儿面绒毛膜中大量分离胎盘亚全能干细胞的方法， 操作简单，方便实用，能得到大量的亚全能干细胞。

附图说明

图1～图4分别是本发明实施例1所得亚全能干细胞的流式检测图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实 施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行 各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽 然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可 能详细的描述。

实施例1、从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞，并检测、扩增

(1)从采集盒中取出人类的胎盘于白瓷盘中，去除羊膜和瘀血后，使用生理盐水(无菌，下同) 反复冲洗胎盘表面，进行消毒处理；

(2)转移至新白瓷盘中，剪取胎儿面绒毛膜于100mm玻璃皿中，尽量剔除表面残留的胎盘小 叶组织，剪碎至0.5～1.5mm³左右(本例为1mm³左右)的小块；

(3)使用300目筛网，用大量生理盐水冲洗组织小块，去除其中残留的血细胞；

(4)组织消化：使用1～2倍(本例为1.5倍)组织体积的混合酶(0.1mg/ml的I型胶原酶，0.1mg/ml 的II型胶原酶，0.1mg/ml透明质酸酶和0.05mg/ml中性蛋白酶，其中还添加了0.02mol/L枸橼酸)， 在37度恒温摇床100rpm振荡消化10～30min(本例为20min)；

(5)消化结束后加适量FBS终止，300目滤网过滤，加大量生理盐水冲洗滤渣，获得尽量多的 细胞；

(6)滤液经1000～2000rpm(本例是1500rpm)离心5～15min(本例是10min)后，弃上清，再加生理 盐水洗涤，1000～1500rpm(本例是1200rpm)离心2～10min(本例是5min)，得单核细胞；

(7)磁珠分选(OCT-4阳性、Nanog阳性和STRO-1阴性)，获得目标细胞。

针对上述所得目标细胞，取样，细胞计数仪(Sysmex)计数，流式细胞仪(FC500)检测其活性。

针对上述所得目标细胞，采用程序降温仪冻存目标细胞，储备。其中的冻存照如下步骤进行： 将10％胎牛血清的培养液和99％二甲基亚砜(DMSO)按体积比3:1缓慢混匀后配置成冻存液，放入 冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存 管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存 罐长期保存。其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存中所用的冻存程序如 下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最 后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

针对上述所得目标细胞，进行如下扩增步骤：将目标细胞接种至多个T25培养瓶(0.5～2×10⁵细胞/瓶，本例是1×10⁵细胞/瓶)中，添加亚全能干细胞培养基(DMEM-F12培养基+10％FBS+10ng/ml 成纤维细胞生长因子BFGF+10ng/mL人表皮细胞生长因子)，传至P1代后，收获，冻存，储备， 任选地进行流式鉴定。具体的扩增步骤是：将亚全能干细胞接种到无菌培养瓶内，并加入培养液， 然后置于37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5％的培养箱内开始原代培养3～4天后；将无菌培养 瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培养箱内继续培养直 至无菌培养瓶内细胞达到75～85％的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将浓度为0.25％的胰蛋 白酶溶液按20％培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃消化2.5分钟后，将无菌培养液 倒入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落的细胞和培养液倒 入离心管内，于1500rpm离心7.5分钟，将离心所得的沉淀用含10％胎牛血清的培养液混匀沉淀， 收集培养过程中完全脱落细胞即得到经扩增的亚全能干细胞。其中的冻存照如下步骤进行：将10％ 胎牛血清的培养液和99％二甲基亚砜(DMSO)按体积比3:1缓慢混匀后配置成冻存液，放入冰水混 合物中预冷17.5min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存管放入 程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期 保存。其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存中所用的冻存程序如下：以 1.0℃/分钟降至-3.0℃，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最后以10.0℃ /分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

对本实施例步骤(7)所得目标细胞进行流式检测，典型的结果见图1-4，结果显示，本发明所 得亚全能干细胞的OCT-4、CD90和Nanog阳性率大于95％，而STRO-1的阴性率小于0.8％。另 外，在一个补充实例中，参照上述实施例1的方法，不同的仅是在步骤(4)组织消化中，所用的混 合酶中不添加枸橼酸，结果所得亚全能干细胞的STRO-1的阴性率达5.7％。另外，在一个补充实 例中，参照上述实施例1的方法，不同的仅是分别采用胎盘、胎盘小叶、胎盘羊膜、脐带为原材 料，分别在步骤(4)中得到四种目标细胞，经测定，这四种细胞的STRO-1的阴性率达4.9％～9.1％。 下面各个照本发明方法进行的实施例所得目标细胞亦具有类似结果，即OCT-4、CD90和Nanog 阳性率均大于95％，而STRO-1的阴性率均小于1.0％。

实施例2、从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞，并检测、扩增

(1)从采集盒中取出人类的胎盘于白瓷盘中，去除羊膜和瘀血后，使用生理盐水(无菌，下同) 反复冲洗胎盘表面，进行消毒处理；

(2)转移至新白瓷盘中，剪取胎儿面绒毛膜于100mm玻璃皿中，尽量剔除表面残留的胎盘小 叶组织，剪碎至0.5mm³左右的小块；

(3)使用300目筛网，用大量生理盐水冲洗组织小块，去除其中残留的血细胞；

(4)组织消化：使用1倍组织体积的混合酶(0.1mg/ml的I型胶原酶，0.1mg/ml的II型胶原酶， 0.1mg/ml透明质酸酶和0.05mg/ml中性蛋白酶，其中还添加了0.01mol/L枸橼酸)，在37度恒温 摇床100rpm振荡消化30min；

(5)消化结束后加适量FBS终止，300目滤网过滤，加大量生理盐水冲洗滤渣，获得尽量多的 细胞；

(6)滤液经2000rpm离心5min后，弃上清，再加生理盐水洗涤，1000rpm离心2min，得单核 细胞；

(7)磁珠分选(OCT-4阳性、Nanog阳性和STRO-1阴性)，获得目标细胞。

针对上述所得目标细胞，取样，细胞计数仪(Sysmex)计数，流式细胞仪(FC500)检测其活性。

针对上述所得目标细胞，采用程序降温仪冻存目标细胞，储备。其中的冻存照如下步骤进行： 将10％胎牛血清的培养液和99％二甲基亚砜(DMSO)按体积比3:1缓慢混匀后配置成冻存液，放入 冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存 管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存 罐长期保存。其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存中所用的冻存程序如 下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最 后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

针对上述所得目标细胞，进行如下扩增步骤：将目标细胞接种至多个T25培养瓶(0.5～2×10⁵细胞/瓶，本例是0.5×10⁵细胞/瓶)中，添加亚全能干细胞培养基(DMEM-F12培养基 +10％FBS+10ng/ml成纤维细胞生长因子BFGF+10ng/mL人表皮细胞生长因子)，传至P1代后，收 获，冻存，储备，任选地进行流式鉴定。具体的扩增步骤是：将亚全能干细胞接种到无菌培养瓶 内，并加入培养液，然后置于37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5％的培养箱内开始原代培养3～4 天后；将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培 养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到75～85％的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将 浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液按20％培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃消化1分钟 后，将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落 的细胞和培养液倒入离心管内，于2000rpm离心5分钟，将离心所得的沉淀用含10％胎牛血清的 培养液混匀沉淀，收集培养过程中完全脱落细胞即得到经扩增的亚全能干细胞。其中的冻存照如 下步骤进行：将10％胎牛血清的培养液和99％二甲基亚砜(DMSO)按体积比3:1缓慢混匀后配置成 冻存液，放入冰水混合物中预冷15min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管 中，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放 入液氮储存罐长期保存。其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存中所用的冻 存程序如下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至 -40.0℃，最后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

实施例3、从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞，并检测、扩增

(1)从采集盒中取出人类的胎盘于白瓷盘中，去除羊膜和瘀血后，使用生理盐水(无菌，下同) 反复冲洗胎盘表面，进行消毒处理；

(2)转移至新白瓷盘中，剪取胎儿面绒毛膜于100mm玻璃皿中，尽量剔除表面残留的胎盘小 叶组织，剪碎至1.5mm³左右的小块；

(3)使用300目筛网，用大量生理盐水冲洗组织小块，去除其中残留的血细胞；

(4)组织消化：使用2倍组织体积的混合酶(0.1mg/ml的I型胶原酶，0.1mg/ml的II型胶原酶， 0.1mg/ml透明质酸酶和0.05mg/ml中性蛋白酶，其中还添加了0.03mol/L枸橼酸)，在37度恒温 摇床100rpm振荡消化10min；

(5)消化结束后加适量FBS终止，300目滤网过滤，加大量生理盐水冲洗滤渣，获得尽量多的 细胞；

(6)滤液经1000离心15min后，弃上清，再加生理盐水洗涤，1500rpm离心10min，得单核细 胞；

(7)磁珠分选(OCT-4阳性、Nanog阳性和STRO-1阴性)，获得目标细胞。

针对上述所得目标细胞，取样，细胞计数仪(Sysmex)计数，流式细胞仪(FC500)检测其活性。

针对上述所得目标细胞，采用程序降温仪冻存目标细胞，储备。其中的冻存照如下步骤进行： 将10％胎牛血清的培养液和99％二甲基亚砜(DMSO)按体积比3:1缓慢混匀后配置成冻存液，放入 冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存 管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存 罐长期保存。其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存中所用的冻存程序如 下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最 后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

针对上述所得目标细胞，进行如下扩增步骤：将目标细胞接种至多个T25培养瓶(0.5×10⁵细 胞/瓶，本例是2×10⁵细胞/瓶)中，添加亚全能干细胞培养基(DMEM-F12培养基+10％FBS+10ng/ml 成纤维细胞生长因子BFGF+10ng/mL人表皮细胞生长因子)，传至P1代后，收获，冻存，储备， 任选地进行流式鉴定。具体的扩增步骤是：将亚全能干细胞接种到无菌培养瓶内，并加入培养液， 然后置于37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5％的培养箱内开始原代培养3～4天后；将无菌培养 瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培养箱内继续培养直 至无菌培养瓶内细胞达到75～85％的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将浓度为0.25％的胰蛋 白酶溶液按20％培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃消化5分钟后，将无菌培养液倒 入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落的细胞和培养液倒入 离心管内，于1000rpm离心10分钟，将离心所得的沉淀用含10％胎牛血清的培养液混匀沉淀， 收集培养过程中完全脱落细胞即得到经扩增的亚全能干细胞。其中的冻存照如下步骤进行：将10％ 胎牛血清的培养液和99％二甲基亚砜(DMSO)按体积比3:1缓慢混匀后配置成冻存液，放入冰水混 合物中预冷20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存管放入程 控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保 存。其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存中所用的冻存程序如下：以1.0℃ /分钟降至-3.0℃，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最后以10.0℃/ 分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

实施例4、从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞，并检测、扩增

(1)从采集盒中取出人类的胎盘于白瓷盘中，去除羊膜和瘀血后，使用生理盐水(无菌，下同) 反复冲洗胎盘表面，进行消毒处理；

(2)转移至新白瓷盘中，剪取胎儿面绒毛膜于100mm玻璃皿中，尽量剔除表面残留的胎盘小 叶组织，剪碎至1.2mm³左右的小块；

(3)使用300目筛网，用大量生理盐水冲洗组织小块，去除其中残留的血细胞；

(4)组织消化：使用1.2倍组织体积的混合酶(0.1mg/ml的I型胶原酶，0.1mg/ml的II型胶原 酶，0.1mg/ml透明质酸酶和0.05mg/ml中性蛋白酶，其中还添加了0.025mol/L枸橼酸)，在37度 恒温摇床100rpm振荡消化25min；

(5)消化结束后加适量FBS终止，300目滤网过滤，加大量生理盐水冲洗滤渣，获得尽量多的 细胞；

(6)滤液经15000rpm离心12in后，弃上清，再加生理盐水洗涤，1500rpm离心6min，得单核 细胞；

(7)磁珠分选(OCT-4阳性、Nanog阳性和STRO-1阴性)，获得目标细胞。

针对上述所得目标细胞，取样，细胞计数仪(Sysmex)计数，流式细胞仪(FC500)检测其活性。

针对上述所得目标细胞，采用程序降温仪冻存目标细胞，储备。其中的冻存照如下步骤进行： 将10％胎牛血清的培养液和99％二甲基亚砜(DMSO)按体积比3:1缓慢混匀后配置成冻存液，放入 冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存 管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存 罐长期保存。其中步骤(72)和步骤(73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存中所用的冻存程序如 下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃，然后以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最 后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

针对上述所得目标细胞，进行如下扩增步骤：将目标细胞接种至多个T25培养瓶(1.25×10⁵细胞/瓶)中，添加亚全能干细胞培养基(DMEM-F12培养基+10％FBS+10ng/ml成纤维细胞生长因子 BFGF+10ng/mL人表皮细胞生长因子)，传至P1代后，收获，冻存，储备，任选地进行流式鉴定。 具体的扩增步骤是：将亚全能干细胞接种到无菌培养瓶内，并加入培养液，然后置于37℃、饱和 湿度、CO2体积分数为5％的培养箱内开始原代培养3～4天后；将无菌培养瓶内培养液和未贴壁 的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞 达到75～85％的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液按20％培养 液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃消化3分钟后，将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止 消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落的细胞和培养液倒入离心管内，于1600rpm 离心8分钟，将离心所得的沉淀用含10％胎牛血清的培养液混匀沉淀，收集培养过程中完全脱落 细胞即得到经扩增的亚全能干细胞。其中的冻存照如下步骤进行：将10％胎牛血清的培养液和99％ 二甲基亚砜(DMSO)按体积比3:1缓慢混匀后配置成冻存液，放入冰水混合物中预冷17min，将预 冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始 冻存程序，将温度降至-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。其中步骤(72)和步骤 (73)中所述的对亚全能干细胞进行的冻存中所用的冻存程序如下：以1.0℃/分钟降至-3.0℃，然后 以10.0℃/分钟降至-20.0℃，再以1.0℃/分钟降至-40.0℃，最后以10.0℃/分钟降至-90.0℃后取出 冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在 本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的 保护范围以权利要求书为准。