一株具有菲降解功能的根表成膜细菌RS2及其应用

摘要

本发明公开了一株具有菲降解功能的根表成膜细菌RS2及其应用。一株具有菲降解功能的鞘氨醇菌RS2，2015年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC？NO.10982。利用该菌株制备的菌剂在实验室摇瓶培养条件下2d内对初始浓度为100mg·L

说明书

技术领域

本发明属于环境多环芳烃(PAHs)污染生物修复领域，涉及一株具有菲降解功能的根表成膜细菌RS2及其应用。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是由2个或2个以上苯环组成的土壤环境中常见的一类持久性有机污染物，其具有慢性毒性和“三致”效应，疏水性强，难于降解。环境中的PAHs可以通过植物吸收进入植物体内，在植物器官、组织、细胞、和基因水平上对植物的正常生理活动产生影响，引起植物体内的氧化胁迫，甚至导致细胞死亡。此外，PAHs可以通过食物链传递进而威胁人体健康。因而，如何减低植物PAHs污染风险是当前农业环境领域研究的热点之一。

通过添加外源化学试剂可以调控植物对PAHs的吸收代谢和积累，从而控制植物PAHs污染风险，但是外源化学试剂的环境安全性尚待评价。利用微生物降解有机污染物是近几十年兴起的环境污染修复技术。该技术和传统的物理、化学方法相比，具有很多无可比拟的优点，如处理效果好，操作简便，适合有毒有害有机污染物大面积面源污染的修复，修复费用较低，且不产生二次污染等。在国内外，微生物修复技术已经广泛应用于环境有机污染物的清除，而将微生物与植物联合使用通常会得到更好的修复效果，例如菌根真菌和植物内生细菌等。但迄今为止，有关利用根表成膜细菌和植物联合修复有机污染的研究报道很少，该研究仍亟待开拓。

细菌生物膜是附着在载体表面或不同介质界面的高度组织化、系统化的微生物膜性聚合物，是细菌在自然环境中普遍存在的一种生存方式。植物根表普遍存在细菌成膜作用，根表细菌生物膜是很多根际细菌常见的一种生存方式。根表成膜细菌可以产生植物激素，促进作物增产，提高植物对矿物质的吸收，同时能通过产生抗生素等次生代谢产物，协助植物抵御病原菌侵害。根表细菌生物膜的特有结构如EPS可以富集根际环境的有机污染物，而生物膜内多种细菌的协同作用以及功能基因的水平转移等机制则可以强化细菌生物膜对有机污染物的代谢，进而加速有机污染物的降解。但迄今为止，有关利用根表成膜细菌降解PAHs的专利研究和应用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种具有菲降解功能的根表成膜细菌(以下简称功能细菌)。

本发明的另一目的是提供该功能细菌生产的菌剂。

本发明的又一目的是提供该功能细菌在降低植物菲污染风险中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

功能细菌鞘氨醇菌(Sphingobiumsp.)RS2，2015年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.10982。

一种用所述的鞘氨醇菌(Sphingobiumsp.)RS2所生产的功能细菌菌剂，是通过以下方法生产而成：

1)将保藏编号为CGMCCNO.10982的鞘氨醇菌RS2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按5％的接种量(V/V，以培养基体积为基准，下同)接种入种子罐，培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1～1.2，搅拌速度为180～220转/分，培养温度为28～30℃，全流程培养时间为55～60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；

其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：

蛋白胨10.0g·L^‐1，酵母5.0g·L^‐1，NaCl10.0g·L^‐1，pH7.0‐7.4；

5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝1.0，即为所述的降解菌剂。

所述的保藏编号为CGMCCNO.10982的鞘氨醇菌(Sphingobiumsp.)RS2在降解菲的应用；优选所述的鞘氨醇菌(Sphingobiumsp.)RS2在降解水体，土壤以及植物体内菲的应用。

本发明所述的降解菌剂在降解菲中的应用；优选所述的降解菌剂在降解水体，土壤或植物体内菲的应用。

有益效果

本发明筛选获得一株鞘氨醇菌(Sphingobiumsp.)RS2(CGMCCNO.10982)，利用该菌株制备的菌剂在实验室摇瓶培养条件下2d内对初始浓度为100mg·L^-1的菲降解率可达95％以上。菌株RS2具有良好的成膜能力，利用绿色荧光蛋白基因(gfp)对其标记后，以浸种方式将菌株定殖于植物根表后将植物种植于受菲污染的土壤中，发现菌株RS2可在植物根表形成细菌生物膜，且可进入植物内部。菌株RS2在根表的定殖成膜能够有效减低植物体的菲污染风险，在短时间内可使植物根部的菲含量降低40％，且对于植物地上部的去除效果尤为显著，可达60％以上；同时，菲在植物体内的积累量和传导系数也有明显降低。

本发明描述的环境修复菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，可直接用于减低PAHs污染水体，土壤以及植物体内的菲污染风险，具有广阔的产业前景和重要的环境、经济和社会效益。本发明描述的环境修复菌剂为在PAHs污染区生产健康的农产品提供了技术支持，同时对于保障PAHs污染环境下的农产品安全具有重要意义。

附图说明

图1菌株RS2的菌落照片和透射电镜照片

A图为菌株RS2的菌落照片，B图为菌株RS2的透射电镜照片

图2菌株RS2以100mg·L^-1菲为唯一碳源时的生长和降解曲线

图3菌株RS2在LB培养基中的成膜能力

图4菌株45‐RS2的荧光显微照片

图5菌株45‐RS2在紫花苜蓿根表的定殖成膜

生物材料保藏信息

功能细菌RS2，鞘氨醇菌Sphingobiumsp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.10982，保藏日期为2015年6月16日。

具体实施方式

实施例1菌株的分离和鉴定

采集江苏省南京市某芳烃厂排污口区附近的主要代表性健康植物样品(小飞蓬、车前草、蛤蟆草等)。将采集的植物样品用灭菌毛刷轻轻去除植物根表泥土后，将其置于装有5mL灭菌超纯水的离心管中剧烈震荡30s，以破坏根表细菌生物膜结构使细菌游离出来，获得的细菌悬液作为根表生物膜中的细菌群落备用。

以5％的接种量将上述获得的细菌悬液加入到100mL的无机盐培养基中，并添加菲至100mg·L^‐1作为唯一碳源，于30℃，180r·min^‐1摇床培养7d，以5％的接种量转接到相同的培养基中，连续转接三次后，梯度稀释富集液，取10^‐4‐10^‐7稀释度的富集液各0.1mL涂布于添加100mg·L^‐1菲的无机盐平板上，于30℃恒温培养3d后，在紫外灯下观察，挑选菌落周围出现明显水解圈的菌株，通过划线分离纯化得到单菌落。进一步挑取长出的单菌落接种于含有100mg·L^‐1菲的无机盐液体培养基中，于30℃，180rmin^‐1摇床培养7d，验证其对菲的降解效果。无机盐培养基配方为：NH₄NO₃1.0g·L^‐1，KH₂PO₄0.5g·L^‐1，K₂HPO₄1.5g·L^‐1，NaCl1.0g·L^‐1，MgSO₄·7H₂O0.2g·L^‐1，pH7.0；固体培养基加16g·L^‐1琼脂。

降解效果的验证方法：向培养液中加入等体积色谱甲醇后，超声处理30min，使瓶中菲全部溶解，12000rmin^‐1离心去除沉淀后取上清液用滤膜过滤(孔径0.22μm)，用高效液相色谱法测定其中的菲含量。高效液相色谱(岛津LC‐20AT，检测器型号SPD‐20A)设定参数为：InertsilODS‐SP‐C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇:水＝90:10，流速0.90mL·min^‐1，柱温40℃，紫外检测波长245nm，进样量10μl。外标法按峰面积定量。

从富集液中分离到一株菲降解细菌，命名为菌株RS2。菌株RS2降解菲前后的液相色谱检测结果表明菌株RS22d内对初始浓度为100mg·L^‐1的菲降解率大于95％。菌株RS2在固体培养基上生长2d后，菌落为圆形、较小、外形隆起、光滑、边缘整齐、有光泽、呈淡黄色。在透射电子显微镜下该菌呈短杆状，单鞭毛，不形成芽孢。G^‐，好氧生长，其生理生化特性见表1。菌株RS2的形态和生理生化特征和Bergey'smanualofsystematicbacteriology上对鞘氨醇菌(Sphingobiumsp.)的描述是一致的。

以菌株RS2的基因组DNA为模板，用细菌16SrRNA基因序列通用引物进行PCR扩增，得到长度为1400bp的16SrRNA基因序列(GenBank登录号为KP900972)。在RDP数据库(https://rdp.cme.msu.edu/)中进行Blast，结果表明菌株RS2与鞘氨醇菌(Sphingobiumsp.)的同源性最近，序列相似性达到99％以上。结合生理生化特征将该菌鉴定为鞘氨醇菌(Sphingobiumsp.)，将该菌送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCCNO.10982，保藏日期为2015年6月16日。

表1菌株RS2的生理生化特性

注：“+”表示反应为阳性；“‐”表示反应为阴性；“*”表示只产生微弱反应

实施例2修复菌剂的发酵

使用上述菌株RS2生产修复菌剂的工艺为：斜面种——摇瓶种子液——种子罐——产品(包装剂型为液体菌剂)。

1)将保藏编号为CGMCCNO.10982的鞘氨醇菌(Sphingobiumsp.)RS2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按5％的接种量接种入种子罐，培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为200转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；

其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：蛋白胨10.0g·L^‐1，酵母5.0g·L^‐1，NaCl10.0g·L^‐1，pH7.0‐7.4；

5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝1.0，即为功能细菌菌剂，可直接用于植物的浸种处理。

实施例3培养基中菌株RS2对菲的生物降解实验

在无机盐培养基(同实施例1)中加入终浓度为100mg·L^‐1的菲，以5％接种量接入菌株RS2(CGMCCNO.10982)，设接种灭活的菌株RS2对照，30℃恒温摇床振荡培养。定时取样检测菌株RS2以100mg·L^‐1的菲为唯一碳源生长时的生长情况以及对菲的降解情况，结果见图2。菌株RS2可以菲为唯一碳源生长良好，且在2d内对初始浓度为100mg·L^‐1的菲的降解率达到95％以上。

实施例4功能细菌的成膜能力检测和gfp标记

将菌株RS2的过夜培养物用无菌水稀释至OD_600nm＝0.3，按1％接种量将其接入含300μL新鲜LB培养基的1.5mL离心管中，扣紧管盖，于30℃静置培养，每隔24h取样测定生物膜含量：将形成的细菌生物膜移至一新的离心管，经无菌水漂洗后，加入400μL0.1％(W/V)的结晶紫染液染色20min，弃去染液，再用无菌水漂洗两次后，将已被结晶紫着色的细菌生物膜溶解于500μL95％的乙醇中，于波长590nm处检测吸光值。菌株RS2在LB中的成膜能力见图3。菌株RS2能在120h内形成稳定的生物膜。

采用三亲接合方式对菌株RS2进行gfp标记。以pBBRGFP‐45为供体质粒，pRK2013为辅助质粒，菌株RS2为受体菌进行三亲接合，将混合菌液涂布于含50mg·L^‐1链霉素和卡那霉素的含菲无机盐平板上，30℃培养过夜，筛选阳性结合子。结果显示，含gfp基因的供体质粒pBBRGFP‐45能够成功转入受体菌RS2体内并可以稳定地传代和表达，将经gfp标记的菌株命名为菌株45‐RS2(图4)。

实施例5功能细菌菌剂的应用

通过温室盆栽实验，采用浸种定殖方式，将gfp标记菌株45‐RS2定殖到紫花苜蓿根表，具体试验步骤如下：

(1)试验设计

紫花苜蓿种子用10％的双氧水消毒后，冲洗干净，置于4℃冰箱过夜，放置恒温培养箱避光催芽，待3d出芽后移栽到装有300g土样的盆钵中，一周后间苗，每盆留苗6株。盆栽置于温室培养，设置平均温度为昼夜25/20℃。试验期间植物定期浇水，每2d随机交换盆钵位置。

试验设计6个处理。UG：无污染土种植紫花苜蓿不接菌；UGS：无污染土种植紫花苜蓿浸种处理；CK：污染土；CM：污染土接菌处理；CG：污染土种植紫花苜蓿不接菌；CGS：污染土种植紫花苜蓿浸种处理。每个处理设置6个重复。

(2)标记菌株的接种

将gfp标记菌株45‐RS2在含抗生素(链霉素50mg·L^‐1和卡那霉素50mg·L^‐1)的LB培养基中扩大培养，配制OD_600nm为1.0的菌悬液。接菌方法分为浸种法：种子催芽后，将种子置于菌悬液中浸泡2h，晾干后播种。

(3)标记菌株的荧光检测

接种功能菌株5d后采集植物样品，用灭菌毛刷轻轻去除紫花苜蓿根表的土壤，取植株根系放在载玻片上，用双面刀片进行徒手切片(纵切)。在载玻片上滴一滴无菌水，将切片铺展其中，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察菌株45‐RS2在植物根表的定殖成膜状况。

(4)植物样品中菲的提取与测定

提取与测定具体方法：植物样品经低温冷冻干燥、粉碎、混匀后，称取一定量样品于25mL玻璃离心管中，用30mL(V/V＝1/1)的二氯甲烷和正己烷溶液分3次，每次10mL超声萃取30min；将萃取液收集后过无水硫酸钠柱‐硅胶柱净化，用12mL的二氯甲烷和正己烷(V/V＝1/1)混合液洗脱；洗脱液收集至旋转蒸发瓶后，40℃恒温下浓缩至干，用甲醇定容到5mL，过0.22μm孔径滤膜后，用HPLC定量分析。HPLC分析条件：色谱柱为Φ4.6mm×150mm烷基C18反相柱；流动相为甲醇/水(V/V＝90/10)，流速1mL·min^‐1；柱温40℃；进样量20μL。

结果表明，经浸种处理，菌株45‐RS2能有效定殖到紫花苜蓿根表，形成细菌生物膜(图5)。菌株45‐RS2在植物根表的定殖成膜可以有效减低植物体内菲的浓度、积累量和转运能力。如表2所示，浸种处理后，紫花苜蓿根和茎叶内菲含量分别降低了40％和63％，而积累量则分别降低了44％和60％。同时，菲在植物体内的传导系数也有明显降低。

表2菌株45‐RS2浸种处理对紫花苜蓿吸收积累菲的影响

注：表中同一植物组织的同列不同字母表示差异达到显著水平(P<0.05)。