一种人源抗创伤弧菌溶血素蛋白(VVH)抗体的制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种人源抗创伤弧菌溶血素蛋白(VVH)抗体的制备方法与应用。本发明的人源抗创伤弧菌溶血素蛋白(VVH)抗体为人源抗体，具有中和创伤弧菌溶血素蛋白VVH的能力。本发明所提供的抗VVH的抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3的自氨基末端第135-260位氨基酸残基，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3的自氨基末端第1-113位氨基酸残基。本发明以固相化创伤弧菌VVH为抗原，运用构建的人源天然大容量噬菌体抗体库，成功地筛选到人源抗创伤弧菌VVH抗体，经ELISA鉴定，本发明的抗VVH的抗体具有很好的特异性，在弧菌感染的治疗中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人源抗创伤弧菌溶血素蛋白(VVH)抗 体的制备方法与应用。

背景技术

创伤弧菌是近海海域致病性较为突出的一种人鱼共患致病弧菌，天然存在于近海 海水及海生动植物中，可经胃肠道粘膜或皮肤开放性创口进入人体，导致蜂窝织炎、 脓毒性休克、多器官衰竭等严重的感染症状，即使用抗生素积极治疗，仍有很高的死 亡率(＞50％)，因此对人体的健康乃至生存以及海洋渔业等都有极大危害。目前国内 外针对创伤弧菌的治疗仍以抗生素传统治疗方法为主，耐药菌株的出现以及药物残留 等问题，使得生物治疗新方法的研究成为当前热点，特别是近年来，以单克隆抗体为 基础的抗感染免疫治疗研究进展迅速，也使得针对创伤弧菌的抗体免疫治疗已成为现 代生物制药的重要内容。

创伤弧菌的致病性与多种毒力因子相关，其中创伤弧菌溶血素(VVH)是一种公 认的由创伤弧菌结构基因vvhA编码的致病因子，是创伤弧菌侵袭人体时释放至胞外 的唯一的一种胞膜穿孔毒素，可以诱导哺乳动物细胞发生坏死、凋亡，在致病过程中 发挥关键作用。目前已研制出针对VVH的检测用抗体制剂，针对创伤弧菌毒素蛋白、 非金属蛋白酶、外膜蛋白等毒力因子中和性抗体也已问世，可在一定程度上有效治疗 感染致死量创伤弧菌的小鼠，提高生存率，且部分抗体疫苗已应用于海洋渔业中鱼病 的防治，并已取得较好的防治效果。但迄今这些创伤弧菌中和抗体均是鼠源或其它动 物源性，属于人体异源蛋白，易使人体产生异源抗原免疫反应，因而限制了其进一步 在人体内的应用。而高亲和力、高抗菌活性的人源化抗体的研制则在很大程度上弥补 了这种缺陷，现已成为未来抗感染生物治疗的主要发展方向。

噬菌体抗体库技术是目前生产全人源化抗体的最主要方法，它能够将全套抗体基 因展示在噬菌体表面，并在体外模拟抗体免疫系统的选择作用，对呈现在噬菌体表面 的抗体在体外用固相化抗原进行筛选。噬菌体展示技术实现了人源抗体制备技术的重 大突破，即不需要免疫动物和细胞融合，可利用抗原直接筛选所需基因。利用抗体库 筛选技术，目前已有针对多种细菌(如抗肺炎链球菌、结核杆菌、鼠疫杆菌、肺炎克 雷伯菌等)及病毒(如呼吸道冠状病毒、登革热病毒等)的ScFv人源单链抗体问世， 但尚未见到抗创伤弧菌人源化抗体的研究报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗创伤弧菌VVH的抗体。

本发明提供的抗创伤弧菌VVH的抗体包括轻链可变区和重链可变区；所述重链 可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第135-260位氨基酸残基，所述 轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第1-113位氨基酸残基。

上述抗体中，所述抗创伤弧菌VVH的抗体为人源抗创伤弧菌VVH的抗体，所述抗 创伤弧菌VVH的抗体为单链抗体。

上述抗体中，所述抗体为如下1)或2)所示的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供上述抗体的编码DNA分子。

本发明提供了上述抗体的重链可变区的核苷酸序列为序列表中序列2的第405-780 位核苷酸分子；所述抗体的轻链可变区的核苷酸序列为序列表中序列2的第1-339位核 苷酸分子。

上述编码DNA分子中，所述编码DNA分子为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；

2)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA分子杂交且编码上述抗体的DNA 分子；

3)与1)的DNA分子具有90％以上的同源性且编码上述抗体的DNA分子。

本发明还有一个目的是提供含有上述编码DNA分子的重组表达载体或表达盒或 转基因细胞系或重组菌。

上述抗体在如下a)-d)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

a)制备特异性结合创伤弧菌VVH的产品；

b)制备特异性结合游离的VVH抗原的产品；

c)制备治疗或辅助治疗创伤弧菌的产品；

d)作为创伤弧菌疫苗。

本发明的最后一个目的是提供一种治疗或辅助治疗抗弧菌感染的产品。

本发明提供的治疗或辅助治疗抗弧菌感染的产品的活性成分为上述抗体。

上述应用或上述抗体中，所述产品为药物。

本发明选择创伤弧菌向胞外释放的唯一的细胞毒素VVH为靶抗原，利用天然大 容量人源噬菌体抗体库筛选技术制备的人源抗创伤弧菌VVH抗体，其抗体结构与种 类与现有报道的创伤弧菌检测及治疗性抗体不相同，该抗体特点是具有较高的中和创 伤弧菌VVH的能力，与国内外现有抗体比较，此抗体为完全人源抗体，从理论上讲 不会诱发明显过敏反应；且体内循环半衰期短、穿透力强，不会像抗生素类药品有残 留污染，在创伤弧菌感染的治疗中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为不同抗VVH噬菌体抗体与游离抗原的竞争抑制率。

图2为抗VVH噬菌体抗体的中和活性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的原始噬菌体抗体库在文献“乔媛媛，王琰，陈晓穗，王欲晓，化冰. 大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定,中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(3),194-197. 中国人民解放军海军总医院”中公开过，公众可从中国人民解放军海军总医院获得。

下述实施例中的BS1365细胞在文献“王琰,王欲晓,陈晓穗,化冰,刘晓林,用于大容 量噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定,中国免疫学杂志,2003,19(2),93-96.中国人 民解放军海军总医院”中公开过，公众可从中国人民解放军海军总医院获得。

下述实施例中的大肠杆菌HB2151在文献“王琰,刘群英,化冰,陈宇萍,朱迎春,陈晓 穗,从半合成抗体库克隆抗TNF-α人单链抗体,免疫学杂志,1999,15(4):87-89.”中公开 过，公众可从中国人民解放军海军总医院获得。

下述实施例中的用于筛选的VVH抗原在文献“魏杰,郭建巍,马骢等.创伤弧菌溶血 素基因的高效表达与鉴定.第四军医大学学报,2008,29(14):1249-1252.”和文献“付凯 飞，马骢，郭建巍等.抗创伤弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定.细胞 与分子免疫学杂志，2012，28(3):279-281.”中公开过，公众可以从海军总医院检验科 获得。

下述实施例中的超级营养肉汤(Superbroth,SB)培养液的溶剂为水，溶质及其在 SB培养液中的浓度为：胰蛋白胨30g/L,酵母粉20g/L,3-(N-吗啉代)丙磺酸10g/L。

实施例1、抗VVH抗体的制备方法

一、大容量人源噬菌体抗体库的制备

参考文献“SblatteroD,BradburyA.Exploitingrecombinationinsinglebacteriato makelargephageantibodylibraries.NatBiotechnol,2000；18:74.”中的方法制备大容量 人源噬菌体抗体库，具体步骤如下：

1、从原始噬菌体抗体库中取出7×10¹²cfu(克隆形成单位)的噬菌体颗粒超感染 BS1365细胞，感染复数(multiplicityofinfection，MOI为100/1，具体步骤参照文献 “王琰,王欲晓,陈晓穗,化冰,刘晓林.用于大容量噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴 定,中国免疫学杂志,2003,19(2),93-96.”中的方法，37℃水浴1h，以使多副本载体进 入同一细胞，通过cre-loxp介导的定位重组使同一细胞内不同载体之间的轻、重链随 机交换配对，得到感染体系。

2、向上述步骤1的感染体系中加入含氨苄青霉素(100ug/ml)的2×YT培养液(溶 剂为水，溶质及其在培养液中的质量分数为：蛋白胨1.6％的、酵母提取物1％的和氯 化钠0.5％)至400mL，37℃振荡培养至对数生长期(OD＝0.5)。

3、向步骤2培养后的感染体系中加入5ml辅助病毒VCSM13(pfu＝1.7×10¹²) (MerckST200251)，30℃低温诱导培养过夜，次日离心上清，PEG8000(购自Promege 公司)回收沉淀，并测定噬菌体滴度，再以MOI≤1的比例感染对数生长期的XL1-Blue 菌(1000ml)(Stratagen,货号:200228)，37℃静止30min。

4、取10μl铺于含氨苄青霉素的培养盘计算库容，加入氨苄青霉素使其终浓度为 100g/ml，再加入10ml辅助噬菌体VCSM13(pfu＝1.7×10¹²)，30℃低温诱导培养过 夜，次日回收上清，PEG8000回收沉淀，获得大容量重组噬菌体抗体工作库(大容量 人源噬菌体抗体库)，并计算大容量重组噬菌体抗体工作库的库容和滴度。

结果表明：大容量人源噬菌体抗体库的库容为7×10¹⁰，滴度为3×10¹²cfu/ml。

二、抗VVH噬菌体抗体的筛选、制备及ELISA检测

1、抗VVH噬菌体抗体的筛选

抗VVH噬菌体抗体的筛选参照文献“王琰，刘群英，化冰等.从人源性噬菌体 抗体库分离出1株含有异常序列的抗HBsAgFab克隆.中国免疫学杂志，1998，14(1): 115-119.”和文献“王欲晓，乔媛媛，周丽君等.从大容量抗体库中筛选抗TNF-α人 单链抗体.细胞与分子生物学杂志，2008，24(9):878-880.”中的方法。具体步骤如下：

(1)将VVH抗原用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液(PH9.6)稀释至50μg/ml，得到 VVH抗原溶液。

(2)取1mlVVH抗原溶液包被免疫管，4℃过夜，用2.5％的脱脂奶粉封闭2h， 加入1ml上述步骤一制备的大容量人源噬菌体抗体库(约3×10¹²cfu)，37℃孵育2h。

(3)用PBST将步骤(2)的产物洗涤15次(第2-4轮洗涤20次以上)，蒸馏水 洗涤1次，然后加入1ml新鲜的XL1-Blue菌直接感染，37℃孵育15min，再转入10ml 超级营养肉汤(Superbroth,SB)培养液(含20μg/ml氨苄青霉素)中。

(4)向步骤(3)的产物中加入1ml甘氨酸洗脱缓冲液(0.1mol/LHCl，甘氨酸 调pH值至2.2，加入BSA至其质量分数为0.1％)，37℃静置15min后，洗脱回收， 得到洗脱液。

(5)用2mol/LTris将上述步骤(4)的洗脱液中和至pH7.0，加入10ml的XL1-Blue 菌，37℃静置15min，再加入10ml的SB培养液。

(6)将适量步骤(5)得到的菌液铺于含氨苄青霉素的培养盘，测定滴度，其余 菌液37℃培养3～4h后加入含有氨苄青霉素培养液至100ml，再加入辅助病毒VCSM13 (2×10¹²cfu)，30℃振荡培养过夜。次日回收上清，PEG8000沉淀，得到次级噬菌体 抗体库。

(7)将上述次级噬菌体抗体库再进行下一轮的筛选，并在次轮筛选中使VVH包 被抗原的浓度逐轮递减10μg/ml。测定每轮筛选后次级库的滴度，并计算噬菌体抗体 的回收率，作为特异性VVH噬菌体抗体富集指标。

噬菌体抗体库各轮筛选结果如表1所示：从表1中可以看出：特异性VVH噬菌 体抗体的富集效果良好，富集倍数为100。

表1、噬菌体抗体库各轮筛选结果

注:回收率＝回收噬菌体/投入噬菌体

(8)从第三、第四轮筛选富集的培养盘集落中随机挑取85个克隆，分别于2×YT 培养液中培养过夜，次日取50μl菌液加入2mlSB培养液中，37℃培养至对数生长期， 再加入辅助噬菌体VCSM13(pfu＝1.7×10¹²)，30℃培养过夜，收集上清，分别得到抗 VVH噬菌体抗体。

2、抗VVH噬菌体抗体的ELISA检测

分别将上述步骤1获得的抗VVH噬菌体抗体溶液进行ELISA检测，同时以卵清 蛋白(OVA)(购自Sigma公司)和牛血清白蛋白(BSA)(购自Sigma公司)作为对 照鉴定其抗原抗体反应的特异性。具体步骤如下：

(1)包被：在96孔酶标板中加入50μLVVH抗原溶液(1μg/ml)，37℃包被过夜。

(2)封闭：3％脱脂奶-PBS封闭2h；

(3)加抗体：加入上述步骤2制备的待测抗VVH噬菌体抗体50μL，37℃孵育 1h；PBST洗涤三次；

(4)加二抗：向孔中加入50μL的HRP-抗M13鼠单抗(购自GE公司27-9420-01)， 37℃孵育3h；

(5)显色：每孔加入50μL底物显色液(购自上海麦约尔生物技术公司，货号： 1A001)：进行显色5min。测A490nm处OD值。

将显色为阳性的克隆再分别以卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)和铁蛋白 (Fer)(购自Sigma公司)作为抗原，按照上述方法进行特异性检测，实验设三次重 复。

结果表明：上述步骤2中挑取的85个克隆中，能与VVH蛋白结合的阳性克隆有 22个，阳性率25.9％。其中3个结合活性高的克隆的ELISA检测结果如图2所示。

表2、噬菌体抗体与不同抗原反应的ELISA检测

三、可溶性抗VVH抗体的获得与ELISA鉴定

1、可溶性抗VVH抗体的获得

用2×YT培养液将上述步骤二ELISA鉴定出的22个特异性的阳性抗VVH噬菌体 抗体进行10⁸倍稀释后感染大肠杆菌HB2151，37℃孵育15min，接种培养盘，并挑取 单个集落放入2×YT培养液中培养过夜，次日取50μl过夜培养的菌液加入1.5mL的 SB培养液中，37℃培养至对数生长期后，加入IPTG(1mmol/L)(购自Promege公司)， 30℃培养过夜，抗VVH的单链抗体以游离可溶的形式在非抑制表型菌HB2151中表达， 培养得到的上清即为可溶性抗VVH抗体。

2、可溶性抗VVH抗体的ELISA鉴定

将上述获得的可溶性抗VVH抗体进行ELISA检测，同时以卵清蛋白(OA)和牛 血清白蛋白(BSA)作为对照。ELISA检测方法同上述步骤二中的3，步骤(3)中的 抗体为可溶性抗VVH抗体，步骤(4)中的二抗为HRP-抗V5抗体(Invitrogen，R961-25)。 测A490处OD值。实验设三次重复。

ELISA检测结果表明22个阳性克隆中共有12株克隆有活性，与VVH有特异结 合活性的克隆有8个。将其中3个结合活性高的克隆的可溶性抗VVH抗体分别命名 为抗体株1、抗体株2和抗体株3。抗体株1、抗体株2和抗体株3与不同抗原反应的 ELISA检测结果如表3所示。

表3、可溶性抗体与不同抗原反应的ELISA检测结果

四、抗体的竞争抑制及中和活性测定

1、选取步骤三获得的活性较好的抗体株1、抗体株2和抗体株3，分别用竞争抑 制ELISA方法测定其中和活性。具体步骤如下：

将VVH抗原溶液(1μg/ml)包被酶标板，以3％脱脂奶封闭，每孔加入50μl结合 活性较好的抗VVH抗体，同时分别加入50μl不同浓度的游离VVH抗原(稀释浓度 为1:100、1:500、1:5000)，以OVA抗原为对照，37℃孵育1h，PBST洗涤三次后与 HRP-抗噬菌体抗体(1:2000稀释)反应，用OPD显色，H₂SO₄终止后，测定490nm 处OD值。对照组为抗VVH抗体+无关游离抗原组；实验组为抗VVH抗体+竞争抑制 VVH抗原组。中和活性抑制率(％)＝(对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100％。

结果如图1所示：获得的3株可溶性抗VVH抗体均能特异性结合游离的VVH抗 原，产生抑制效应，其抑制效应随游离抗原的增加而增大，剂量呈正相关。选择效果 好的抗体株1进行中和活性测定。

2、VVH人源抗体中和活性检测

采用竞争抑制ELISA法对抗体株1的噬菌体抗体进行中和活性进行检测。具体步 骤如下：

(1)用常规免疫法制备小鼠抗创伤弧菌血清，采用超声破碎法裂解菌体后，将菌 体蛋白与等量完全弗氏佐剂混匀，常规腹腔注射免疫BALB/c小鼠(8周龄，180μg/ 只)，每3周免疫1次，共免疫4次，末次免疫后3d眼球取血，分离血清，检测效价 后-20℃保存备用；

(2)将VVH抗原包被酶标板，以3％脱脂奶封闭，每孔加入50ul的抗体株1的 噬菌体抗体，同时分别加入50ul梯度稀释(1:100,1:500,1:2500,1:12500)的小鼠抗创 伤弧菌血清，37℃孵育1h，PBST洗涤3次后与HRP-羊抗鼠IgG(1:2000稀释)反 应，用OPD显色，H₂SO₄终止后，测定490nm处OD值。无关噬菌体抗体(TNF-α抗 体)+抗创伤弧菌血清作为阴性对照。中和活性抑制率(％)＝(阴性对照A490-实验 样品A490)/阴性对照A490×100％。

结果如图2所示：小鼠抗创伤弧菌血清倍比稀释后，对抗VVH抗体的中和活性 抑制率分别为43.90％、38.67％、21.23％和5.53％，而加入抗TNF-α抗体时则无抑制 效应。说明本发明的抗VVH抗体能特异性结合创伤弧菌VVH。

五、抗VVH抗体可变区的基因序列分析

选取特异性结合活性高并且具有中和活性的抗体株1送诺赛公司进行基因序列测 定，利用PCGENE软件对该克隆的可变区进行序列分析。

结果表明：本发明获得的抗VVH抗体(抗体株1)为人源抗体，其中抗VVH抗 体的轻链可变区基因来自VKII亚群，重链可变区基因来自VH3亚群，该抗VVH抗 体的氨基酸序列如序列1所示，其中自氨基末端第135-260位为重链可变区，自氨基 末端第1-113位为轻链可变区；编码该抗VVH抗体的核苷酸序列如序列表中序列2 所示，其中第405-780为重链可变区的编码基因序列，第1-339为轻链可变区的编码 基因序列。