基于磁性分离和量子点标记的人流感嗜血杆菌快速检测方法和试剂盒

摘要

本发明提供了一种基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗原的方法，该方法包括（1）制备抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠；（2）制备量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针；（3）将待检样品用PBST缓冲液溶解后，向溶解液中加入抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠，充分混合及反应后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤，向得到的沉淀物中加入量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针，反应后磁分离，以PBST缓冲液洗涤后，使用荧光酶标仪检测荧光值。本发明建立了一套准确、快速、高灵敏度的检测人流感嗜血杆菌的方法，其在人流感嗜血杆菌的临床诊断、病原学鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检 测人流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)抗原的快速检测方法及检测试剂 盒，以及该检测试剂盒的制备及使用方法。

背景技术

流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)是感染人类的一种重要的呼吸道 病原微生物，该菌由波兰细菌学家费佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中发 现的，在随后的时间里被研究者们广泛研究。现仅知人是该病原体的宿主。免疫 力较差的老人和儿童为易感人群，特别是5岁以下的婴幼儿。Hi可引发肺炎、结 膜炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等，在全球每年至少有300万严重病例发生，可 造成患儿致残甚至死亡。Hi分为有荚膜的a、b、c、d、e、f共6个血清型和无荚 膜的不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilusinfluenzae，NTHi)，一度 以荚膜b型Hi最为流行。目前我国开展的Hi血清学检查大多也只针对侵袭力较强 的荚膜b型。而由于该型菌株荚膜多糖疫苗的成功研发与应用，其流行已被有效 控制。近来的研究多显示，在感染Hi的患者中最常见的菌株是NTHi，其分离率 已达50％以上。

临床上由于Hi与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临 床表现、x-射线检查等得出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。婴幼儿疾病的特 点是起病急、转归快，因此敏感、快速、实用的Hi检测对及早进行有效的临床干 预具有非常重要的意义。

尽管流感嗜血杆菌在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试 剂的种类极少。目前，Hi感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体 直接检测法。检测血清中HiIgG、IgA、IgM抗体常用的方法有：微量免疫荧光抗 体检测(MIF)，补体结合试验(CF)，重组酶免疫测定(rEIA)，血清补体结合一酶免 疫测定试验(SeroCF—EIA)等。然而Hi抗体的检出只能说明该个体感染过Hi，却 不能反映体内是否仍有Hi活菌存在，并且血清学特异性抗体检测常需要根据IgM 抗体的动态结果进行判断，需要较长的时间。更重要的是，血清学检测的主要检 测对象为抗荚膜抗体，而NTHi由于没有荚膜，则会造成漏检。同时，这些技术 均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员操作、重复性差、检测时间长、 检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需要。

核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)，核酸杂交检测Hi的特 异性强，但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床 标本的检测；PCR具有较高的敏感性，但PCR实验对实验室有特殊要求，标本 处理、扩增和检测要求严格，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊 断方法。

病原体检测方法主要为病原分离培养法，将标本接种于添加了V和X因子 的巧克力血琼脂培养基上，经24小时培养后，挑取可疑菌落经形态学鉴定后， 用Hi鉴定卡、Vilek一60细菌自动分析系统鉴定到种，系统自动进行生物分型。 但该法存在操作步骤复杂，细胞培养时间长等明显缺陷，并不适合临床应用。更 重要的是，其中的荚膜肿胀实验等仅限于对有荚膜的菌株进行鉴定，而无荚膜型 (NTHi)则全部漏检。

因此，目前建立具高灵敏度、高特异性的人流感嗜血杆菌抗原快速检测法 以满足临床的检测需求就显得非常必要了。

发明内容

针对背景技术中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量 子点标记的能简便、快速、高灵敏度的检测人流感嗜血杆菌抗原的检测方法和试 剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗原的方法，其特征 在于：所述方法包括以下步骤：

1)兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体的制备；

2)鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体的制备；

3)将步骤1)制备得到的兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体与纳米磁 珠通过共价偶联，制备抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠；

4)将步骤2)制备得到的鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体与纳米量 子点通过共价偶联，制备量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针；

5)取人呼吸道分泌物样本(包括但不限于咽拭子)，用PBST缓冲液溶解后， 加入步骤3)制备得到的抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠，充分混合，反应10-45 min后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，向磁分离得到的沉淀物中加入步骤 4)制备得到的量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针，反应10-45min后进行 磁分离，以上述PBST缓冲液洗涤2遍后，使用荧光酶标仪读取荧光值；所述PBST 缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/L Na₂HPO₄，0.3g/LNaN₃，0.5ml/LTween-20；所述PBST缓冲液的pH＝7.4；

6)根据步骤1)-步骤5)的方法分别检测四份经临床确定为人流感嗜血杆菌 阴性的人群的呼吸道分泌物样品，读取荧光值；所述人流感嗜血杆菌阴性的人群 的呼吸道分泌物样品简称人流感嗜血杆菌阴性对照样品；所述四份人流感嗜血杆 菌阴性对照样品的荧光值的平均值与3倍标准差之和即为CUT-OFF值；若步骤5) 中人呼吸道分泌物样本的检测荧光值大于CUT-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物 样本中人流感嗜血杆菌抗原为阳性；若步骤5)中人呼吸道分泌物样本的检测荧 光值小于CUT-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人流感嗜血杆菌抗原为阴 性。

一种基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗原的试剂盒，其特 征在于：所述试剂盒由具有富集人流感嗜血杆菌抗原功能的抗人流感嗜血杆菌免 疫纳米磁珠、量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针、质控品以及PBST缓冲液 所组成；所述质控品包括阳性质控品以及阴性质控品；所述阳性质控品由灭活的 人流感嗜血杆菌干燥结合到拭子上而成；所述阴性质控品是经临床确定为人流感 嗜血杆菌阴性的人群的咽拭子。

一种用于制备基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗原的试 剂盒的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

1)抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠的制备：

1.1)兔及鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG的制备

1.1.1)重组P6-His融合蛋白的制备、纯化：

1.1.1.1)对人流感嗜血杆菌膜蛋白P6进行生物信息学分析，获取其胞外保 守结构域中抗原表位最为丰富的肽段；

1.1.1.2)找到步骤1.1.1.1)中所得到肽段对应的基因编码序列，在上述基 因序列的5’端及3’端引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记记为P6； 其基因序列如序列表所示；

1.1.1.3)将步骤1.1.1.2)中所得到的P6按分子生物学方法克隆入表达载体 pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组P6-His融合蛋白；所述重组P6-His融合 蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中；

1.1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.1.3)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯 度后，以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0.2mg/mL后备用；

1.1.2)兔及鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG的制备：

1.1.2.1)以步骤1.1.1.4)中所得到的重组P6-His融合蛋白为完全抗原，分 别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6抗血清及鼠 抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6抗血清；所述兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6抗血清及 鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6抗血清的间接ELISA效价均大于1×10⁵；

1.1.2.2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6 抗血清及鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6抗血清中的多克隆抗体IgG；

1.1.2.3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.1.2.2)所得到的 二种多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为1mg/mL后备用；

1.2)免疫纳米磁珠的包被：

1.2.1)取5mg磁珠，用1mlMES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进 行磁分离后移除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe₃O₄为内核、粒径为350nm的羧基 磁珠；所述MES缓冲液是质量浓度是2g/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸；所述MES缓冲 液的pH＝6.0；所述纳米磁分离器的磁性强度是0.4T；

1.2.2)依次加入用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是8-12mg/ml的 EDC溶液以及用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是6-12mg/ml的sulfo-NHS 溶液各0.5ml，以10-40rpm/min于旋转混合仪中活化1hr，置于纳米磁分离器 中进行磁分离后移除上清，用1ml步骤1.2.1)中的MES缓冲液重悬，得到活化 后的磁珠；

1.2.3)取5个离心管，在每个离心管中加入200μL步骤1.2.2)所得到的活 化后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用 PBS缓冲液稀释的浓度为50-200μg/ml的由步骤1.1)所制备的兔抗人流感嗜血 杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG溶液各1ml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中 反应2-6h，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml 乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁 珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2 g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，所述PBS缓冲液的pH＝7.4；

1.2.4)封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后 移除上清，各用1ml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下： 8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.5ml/LTween-20， 所述洗涤缓冲液的pH＝7.4；

1.2.5)向各个离心管中分别加入1ml保存缓冲液重悬磁珠，置于4℃保存 备用；所述保存缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.3g/LNaN₃，5g/L牛血清白蛋白(BSA)，所述保 存缓冲液的pH＝7.4；

2)量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针的制备：

其具体制备方法包括：

2.1)向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点、300nmolN-羟 基琥珀酰亚胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亚胺EDC，以磷酸盐缓冲液定容为2 ml，混合溶液，37℃反应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS及 EDC，得到活化后的量子点；所述磷酸盐缓冲液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸 氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠；所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.4；

2.2)在步骤2.1)所得到的活化的量子点中，加入4-12nmol的步骤1.1)中 所制备的鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入单端 氨基化聚乙二醇PEG2000-NH₂至终浓度为1％，封闭未反应的活化羧基位点，继续 避光反应1h；

2.3)用0.2μmPES滤器过滤除去步骤2.2)中的抗体聚集物，然后将滤液 转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发 生偶联反应的抗体和反应中的副产物；

2.4)收集步骤2.3)中超滤离心管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2 ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到一个新的50000MW超滤离心管中，以8000 g离心力在4℃下离心15min，收集超滤离心管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液， 溶于1ml磷酸盐保存液中，置于4℃保存备用；所述磷酸盐洗涤液中各成分含量 如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，5ml/L吐温 -20，0.3g/L叠氮钠，所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.4；所述磷酸盐保存液中各成 分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10g/L 牛血清白蛋白，0.3g/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH＝7.4；

3)PBST缓冲液的配制：

其具体配制方法包括：

取8gNaCL，0.2gKCl，0.24KH₂PO₄，1.44gNa₂HPO₄，0.3gNaN₃，0.5ml Tween-20溶解于800ml蒸馏水中，用5MNaOH调整pH至7.4，再定容至1000ml；

4)质控品的制备：

4.1阳性质控品：阳性质控品由灭活的人流感嗜血杆菌干燥结合到拭子上而 成；

4.2阴性质控品：阴性质控品即经临床确定为人流感嗜血杆菌阴性的人群的 咽拭子。

作为优选，本发明在步骤1.2.2)中，依次加入用步骤1.2.1)中的MES缓冲 液配制的浓度是10mg/ml的EDC溶液以及用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓 度是10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以15rpm/min于旋转混合仪中活化1hr， 置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用1ml步骤1.2.1)中的MES缓冲 液重悬，得到活化后的磁珠；

所述步骤1.2.3)中，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的浓度为100μ g/ml的由步骤1.1)所制备的兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG溶液各 1ml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应3h，置于纳米磁分离器中进行 磁分离后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液；

所述步骤2.2)中，在步骤2.1)所得到的活化的量子点中，加入6nmol的步 骤1.1)中所制备的鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG，避光反应2h。

作为优选，本发明所采用的量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性 CdSe/ZnS量子点。

作为优选，本发明所采用的磁珠是以超顺磁性Fe₃O₄为内核、壳材料为聚苯乙 烯、表面官能团为羧基、粒径为350nm的羧基磁珠。

一种基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗原的试剂盒的使 用方法，其特征在于：所述使用方法包括以下步骤：

1)将待检样本用0.5mlPBST缓冲液溶解后将溶解液转入1.5ml普通离心管 中；所述PBST缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄， 1.44g/LNa₂HPO₄，0.3g/LNaN₃，0.5ml/LTween-20；所述PBST缓冲液的pH＝7.4；

2)向步骤1)中的离心管中加入基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜 血杆菌抗原的试剂盒中的抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠50-150μl，室温下以 10rpm/min于旋转混合仪上反应10-45min后取下，将离心管插入纳米磁分离器 磁分离3min，用移液器吸出上清；

3)添加试剂盒中的PBST缓冲液1ml洗涤两遍，采用纳米磁分离器磁分离后 吸出洗涤液，最后用1mlPBS缓冲液重悬磁珠，制得免疫纳米磁珠-菌体抗原复 合物；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄；所述PBS缓冲液的pH＝7.4；

4)取100μl步骤3)得到的免疫纳米磁珠-菌体抗原复合物于另一离心管中， 再加入100μl基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗原的试剂盒 中的量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针，室温下以15rpm/min于旋转混合 仪上反应10-45min，通过量子点上的抗体与免疫纳米磁珠上的菌体抗原的免疫 结合，量子点被标记到菌体抗原表面，形成磁珠-菌体抗原-量子点“三明治”复 合物；

5)反应完成后，采用纳米磁分离器磁分离3min，除去多余的量子点标记的 抗人流感嗜血杆菌纳米探针，用试剂盒中的PBST缓冲液液清洗2遍，复合物重新 分散在100μlPBS缓冲液中，使用荧光酶标仪对其荧光值进行检测；所述PBS 缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/L Na₂HPO₄；所述PBS缓冲液的pH＝7.4；

6)按上述同样的方法检测试剂盒中提供的四份阴性质控品样品及一份阳性 质控品样品，分别读取荧光值；四份阴性质控品样品的荧光读数的平均值与3倍 标准差之和即为CUT-OFF值；若步骤5)中待检样本的检测荧光值若大于CUT-OFF 值即判断为待检样本中人流感嗜血杆菌抗原为阳性，反之则判断为待检样本中人 流感嗜血杆菌抗原为阴性；若阳性质控品样品的荧光值小于CUT-OFF值，则表明 试剂盒失效。

作为优选，本发明所提出的步骤2)中，向步骤1)中的离心管中加入基于磁 性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗原的试剂盒中的抗人流感嗜血杆 菌免疫纳米磁珠100μl，室温下以10rpm/min于旋转混合仪上反应20min后取 下，将离心管插入磁力架分离3min，用移液器吸出上清；

所述步骤4)中，取100μl步骤3)得到的免疫纳米磁珠-菌体抗原复合物于 另一离心管中，再加入100μl基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆 菌抗原的试剂盒中的量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针，室温下以15 rpm/min于旋转混合仪上反应20min，通过量子点上的抗体与免疫纳米磁珠上的 菌体抗原的免疫结合，量子点被标记到菌体抗原表面，形成磁珠-菌体抗原-量子 点“三明治”复合物。

作为优选，本发明所提供的待检样本包括但不限于咽拭子。

本发明所需的羧基水溶性纳米量子点、350nm羧基磁珠，可到相关专业的研 究单位、公司购买或定制；所需的仪器、设备、药品均有市售。

本发明相比现有技术具有如下优点：

1、本发明利用了免疫纳米磁珠对样品的可富集性、分离的速度快、效率高 等优点，同时结合量子点光化学稳定性高、荧光强度高等特性，使得检测体系具 备多重信号协同放大的效果，从而具有超高的检测灵敏度(其对人流感嗜血杆菌 的检测底线为1×10³CFU/ml，低于目前任何一种已报道的检测方法，用其对临 床样品的检测结果与目前对该病原体的检测“金标准”-培养法的相比无统计学 差异。

2、本发明所用的抗体是识别人流感嗜血杆菌特异性P6表面抗原胞外保守区 的多克隆抗体，其特异性高，同时其较目前最广泛使用的单克隆抗体而言制备成 本低廉，因此，本发明检测成本较低。

3、本发明检测方法简单，检测快速，易于判定，检测成本低廉，克服了现 有技术检测阳性率低、成本高、操作复杂繁琐、耗时长、无法进行临床应用的不 足。

4、由于检测试剂盒检测的是人流感嗜血杆菌抗原而非抗体(抗体的出现需 要感染几周以后)，故而可进行早期诊断和防治，临床诊断符合率高。该方法在 人流感嗜血杆菌的临床诊断、病原学鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用 价值。

5、由于本发明首次以人流感嗜血杆菌所独有的外膜蛋白P6作为抗原标靶， 而该抗原不仅存在于所有类型的流感嗜血杆菌细胞表面，包括有荚膜及无荚膜 型，且保守性高(菌株间蛋白质保守性为100％)，属于流感嗜血杆菌特异性抗原， 因此本发明可高度特异性的检测所有类型人流感嗜血杆菌的感染。而市场上目前 未见任何一种与本发明一样能快速检测所有类型人流感嗜血杆菌的工具存在。

6、本发明检测方法所用的临床样本为呼吸道分泌物如痰液等，而非血液， 可免除婴幼儿患者抽血检查的痛苦与家长的心理负担，故较易于推广。

具体实施方式

本发明是根据免疫学中的双抗夹心原理，利用免疫纳米磁珠对样品的可富集 性、分离的速度快、效率高等优点，结合量子点光化学稳定性高、荧光强度高等 特性，建立的一套具备多重信号协同放大、具有超高灵敏度及高度特异性的快速 检测人流感嗜血杆菌的新方法，具有广阔的市场应用前景。

本发明通过以下实施例作进一步具体描述。

各种试剂的配制及所需材料的说明

1.PBS缓冲液：称取1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，8g氯化钠， 0.2g氯化钾，溶解于900ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.4后用去离 子水定容至1000ml。

2.兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS缓 冲液稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为1mg/ml。

3.鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS缓 冲液稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为1mg/ml。

4.量子点：本发明中所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性 CdSe/ZnS量子点，其发射波长为565nm，自武汉珈源量子点技术开发有限公司购 买，产品名称为羧基水溶性量子点-565。

5.磁珠：本发明中所用磁珠是以超顺磁性Fe₃O₄为内核、壳材料为聚苯乙烯、 表面官能团为羧基、粒径为分别为50nm、180nm、350nm、1150nm、3μm的羧 基磁珠，可从陕西北美基因股份有限公司、上海奥润微纳新材料科技有限公司购 买。

6.人流感嗜血杆菌：购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC 53781。

7.本发明所用到的微生物样品均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

实施例1兔及鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG的制备

(一)重组P6-His融合蛋白的制备、纯化

1.相关基因的克隆

对人流感嗜血杆菌膜蛋白P6(其NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber 为AAA24994)进行生物信息学分析，获取其胞外保守结构域中抗原表位最为丰富 的肽段，找到其对应的DNA编码序列，同时在序列5’引入酶切位点NdeI、3’端 引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后化学合成全基因序列(全序列合成交由金斯 瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段连于载体pUC57上)，记为 P6。其基因全序列如序列表所示。具体的说，P6基因编码的蛋白质序列为天然人 流感嗜血杆菌膜蛋白P6(accessionnumber:AAA24994)的48-153aa。将含有该 段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及XhoI进行双酶切后按常规方法回收 目的片段，备用。同时采用NdeI及XhoI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规 方法将经双酶切后获得的P6基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10， 构建pET-P6表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重 组P6-His融合蛋白。

2.重组P6-His融合蛋白的表达与纯化

将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coli BL21(DE3)plysS中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上， 按常规方法筛选表达菌株。挑取pET-P6转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌 落并接种入100mLLB培养基中，于30℃培养过夜。取出菌液后，按1：100接种 于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于30℃培养至OD₆₀₀＝0.6时，加 入1mol/LIPTG至终浓度为1mmol/L，于30℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱 导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用20mL磷酸盐缓冲液(8 g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄pH＝7.4)洗涤3 次并用10mL上样缓冲液(20mMNa₃PO₄，0.5MNaCl；30mM咪唑，pH7.4)重 悬后进行超声破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100 次。超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发 现重组P6-His融合蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中。

将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用HisTrap affinitycolumns(GEhealthcare公司产品)，按照说明书的方法进行重组 P6-His融合蛋白的纯化。具体方法如下：

1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器 连接上，以1mL/min流速洗柱。

2)用10mL上样缓冲液平衡，1mL/min流速。

3)将融合蛋白上样，1mL/min流速。

4)用10mL上样缓冲液，以1mL/min流速洗柱。

5)用10mL洗脱缓冲液(20mMNa₃PO₄，0.5MNaCl，300mM咪唑，pH7.4)， 以1mL/min流速洗脱，分管收集，每管1ml，12％SDS-PAGE检测，合并洗脱组分 中含有目的蛋白的样品。经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为 0.2mg/mL。

(二)兔及鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG的制备

1.兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG的制备

用步骤(一)纯化的重组P6-His融合蛋白按照200μg(1mL)与1mL弗氏完 全佐剂混匀乳化后免疫雄性新西兰大白兔(由湖北省疾病预防控制中心提供)， 于背部皮下多点注射，间隔7d后再免疫一次，再过14d后用上述纯化的重组 P6-His融合蛋白按照200μg(1mL)与1mL弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行加 强免疫，加强免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次。7d后取血分析抗体 滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意(用ELISA法 测定抗体效价大于1×10⁵)。若满意则心脏采血，分离血清，以ProteinG亲和层 析柱(GEhealthcare公司产品)，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用 凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液(8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄pH＝7.4)调整为1mg/mL，-20℃ 保藏备用，至此制得兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG。Westenblot 试验表明，此多克隆抗体IgG能特异性识别人流感嗜血杆菌全长膜蛋白P6。

2.鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG的制备

用步骤(一)纯化的重组P6-His融合蛋白作为完全抗原免疫豚鼠(由湖北省 疾病预防控制中心提供)，肩胛下注射抗原200μg/只。基础免疫为等体积的抗 原与弗氏完全佐剂进行乳化，每隔2周进行一次加强免疫，加强免疫用等体积抗 原与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，总共免疫4次。末次免疫10d后取血分析 抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意(用ELISA 法测定抗体效价大于1×10⁵)。若满意则处死豚鼠取血清，以ProteinG亲和层析 柱(GEhealthcare公司产品)，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯 基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液(8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄pH＝7.4)调整为1mg/mL，备 用，至此制得鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG。Westenblot试验表 明，此多克隆抗体IgG能特异性识别人流感嗜血杆菌全长膜蛋白P6。

实施例2抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠的制备

1.抗人流感嗜血杆菌多克隆抗体偶联磁珠反应条件的优化：

以偶联了抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体的磁珠作为固相载体，量子 点标记的抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体作为检测抗体，通过双抗夹心法 原理检测人流感嗜血杆菌抗原，观察磁珠与多抗的偶联情况。分别对磁珠的粒径， 以及EDC/NHS活化剂浓度、偶联抗体浓度、偶联时间、封闭剂种类等偶联条件进 行了一系列的优化选择。

1.1磁珠粒径的选择

选择粒径为50nm、180nm、350nm、1150nm、3μm的羧基磁珠，均加入含 4mg/mlEDC及4mg/mlNHS的PBS缓冲液进行活化反应后，分别与实施例1所描 述的兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG进行偶联反应。分别将制备好 的免疫纳米磁珠检测10⁴CFU/mL的人流感嗜血杆菌(ATCC编号53781)，荧光显微 镜下观察结果，选择荧光强度大，背景荧光干扰少，以及在磁场作用下分离速度 较快者为最适磁珠粒径。结果表明粒径350nm的磁珠最符合本发明的要求，确定 最适磁性微球粒径为350nm。

1.2EDC/NHS活化剂浓度的选择

将反应体系中EDC和NHS浓度各自设为l～10mg/ml后进行浓度梯度组合，分 别活化粒径350nm的羧基磁珠。将制备好的免疫纳米磁珠检测104CFU/mL的人流 感嗜血杆菌(ATCC编号53781)，选择荧光最强者为EDC和NHS溶液的最适活化浓度。 结果表明当EDC浓度为5mg/ml、NHS浓度为5mg/ml时偶联效果最好。

1.3偶联抗体浓度的选择

将20μg、40μg、60μg、80μg、100μg、120μg、140μg的兔抗人流感嗜 血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG分别与1mg按上述最优方法活化的粒径为350nm 的磁珠进行偶联。将制备好的免疫纳米磁珠检测10⁴CFU/mL的人流感嗜血杆菌 (ATCC编号53781)，结果发现，当抗体的投放量小于100μg/mg时，荧光强度随 着抗体的浓度增加而增加，而当抗体的质量浓度大于100μg/mg时，荧光强度基 本不变甚至略有减小，因此本实施例选择兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗 体IgG的偶联量为100μg/mg。

1.4偶联时间的选择

确定磁珠的粒径、EDC/NHS活化剂浓度及抗体偶联量后，将抗体与磁珠的偶 联反应时间分别设为0.5h、1h、2h、3h、4h、5h，将制备好的免疫纳米磁珠检测 10⁴CFU/mL的人流感嗜血杆菌(ATCC编号53781)。结果发现，当偶联时间>3h时， 荧光强度趋于稳定，此后再延长偶联时间，荧光不再增强。因此，确定兔抗人流 感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG与磁珠的最适偶联反应时间为3h。偶联时 间远少于传统ELISA法的24h。

1.5封闭剂的选择

按照上述确定的最优条件选择磁珠的粒径、EDC/NHS活化剂浓度、抗体偶联 量及偶联时间后进行偶联反应。偶联结束后，选择BSA，乙醇胺，Tris和D-氨基 葡萄糖盐酸盐作为免疫纳米磁珠封闭剂，制得成品免疫纳米磁珠。将制备好的免 疫纳米磁珠检测10⁴CFU/mL的人流感嗜血杆菌(ATCC编号53781)。结果发现，采 用乙醇胺作为封闭剂的免疫纳米磁珠的检测荧光值最高。我们推测由于乙醇胺的 分子较小，可以较好的消耗由于空间位阻未与抗体结合的表面羧基，使封闭更为 完全，并且有效减少空间位阻效应对已连接抗体的结构影响。

2.偶联过程：

取5mg磁珠(以超顺磁性Fe₃O₄为内核、粒径为350nm的羧基磁珠)于1.5ml 普通离心管中，用1mlMES缓冲液(2g/LMES，pH6.0)洗涤三次，置于纳米磁 分离器中进行磁分离(0.4T)后移除上清，依次加入用上述MES缓冲液配制的浓度 为10mg/ml的EDC溶液及用上述MES缓冲液配制的浓度为10mg/ml的sulfo-NHS溶 液各0.5ml，以15rpm/min于旋转混合仪中活化1hr，磁分离后移除上清，用1ml 上述的MES缓冲液重悬；取5个离心管，每个离心管中加入200μL上述活化的磁 珠，磁分离后吸出上清，向各管中加入用PBS缓冲液(8g/LNaCL，0.2g/LKCl， 0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，pH7.4)稀释的浓度为100μg/ml的实施例 1所制备的兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG溶液各1ml，室温下以15 rpm/min于旋转混合仪中反应3h，磁分离移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙 醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠 上未与抗体反应的羧基。磁分离后移除各管上清，各用1ml洗涤缓冲液(8g/L NaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.5ml/LTween-20， pH7.4)洗涤三遍，最后各用1ml保存缓冲液(8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24 g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.3g/LNaN₃，5g/LBSA，pH7.4)重悬磁珠， 置于4℃保存备用。

实施例3量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针的制备

1.纳米羧基量子点标记鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG反应 条件的优化：

1.1、羧基量子点标记抗体探针最佳标记pH的确定

将标记反应中磷酸盐缓冲液pH分别设为5，6，7，8，9，对标记产物利用全 光谱仪进行荧光强度测定，观察不同pH值对偶联反应的影响，确定了量子点标记 多抗反应的最佳pH为7.0-8.0。本实验选择pH7.4。

1.2、羧基量子点标记抗体探针最佳标记量的确定

将量子点摩尔浓度与多抗浓度之比分别设置为1:1，1:2，1:3及1:4，进行标 记反应后，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察二者不同浓度比对 偶联反应的影响，确定量子点标记鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG 反应的最佳摩尔浓度比为量子点与抗体摩尔比为1:3。本实验选择该最优浓度比 来确定标记量。

1.3、羧基量子点标记抗体探针最佳封闭剂种类的确定

以乙醇胺、Tris、PEG2000-NH₂或者BSA作为封闭剂，进行标记反应后，对标 记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察不同的封闭剂对于标记反应的影 响，结果发现，PEG2000-NH₂为最佳封闭剂，其可显著提高标记复合物的胶体稳 定性及免疫活性。

2.标记过程：

向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点、300nmolN-羟基琥珀 酰亚胺(sulfo-NHS)和300nmol碳二亚胺(EDC)，以磷酸盐缓冲液(2.9g/L 磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，pH7.4)定容为2ml，不停 地混合溶液，37℃反应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS与 EDC。在活化的量子点中，加入6nmol的实施例1所制备的鼠抗人流感嗜血杆菌膜 蛋白P6多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入单端氨基化聚乙二醇(PEG2000-NH₂) 至终浓度为1％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h。用0.2μmPES 滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g 离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物。收 集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液(2.9g/L 磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，5ml/L吐温-20，0.3g/L叠 氮钠，pH7.4)中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心 力在4℃下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于1ml 磷酸盐保存液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10 g/LBSA，0.3g/L叠氮钠，pH7.4)中，置于4℃保存备用。

实施例4免疫纳米磁珠对人流感嗜血杆菌抗原进行免疫捕获条件的优化

以偶联了兔抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体IgG的免疫纳米磁珠作为 固相载体，量子点标记的鼠抗人流感嗜血杆菌膜蛋白P6多克隆抗体作为检测抗 体，通过双抗夹心法原理，建立人流感嗜血杆菌抗原的检测体系。分别对检测体 系中免疫纳米磁珠的用量，捕获时间等条件进行了一系列的优化选择。

1.免疫纳米磁珠加入量的选择

将20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl、140μl的由实施例2所 制备好的免疫纳米磁珠分别加入到0.5ml含10⁴CFU/mL的人流感嗜血杆菌(ATCC 编号53781)的PBST缓冲液(8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44 g/LNa₂HPO₄，0.3g/LNaN₃，0.5ml/LTween-20；pH7.4)中，进行免疫捕获， 再由实施例3所描述的量子点标记探针进行检测，记录荧光值。结果发现，随着 免疫纳米磁珠加入量的增加，荧光值逐渐增大，当免疫纳米磁珠加入量达到100 μl时，荧光值达到最大。再继续增加免疫纳米磁珠的量，荧光值反而降低。这可 能是由于免疫纳米磁珠过多，磁分离时对菌体造成损伤，从而导致捕获率下降。 故本实验选择100μl作为免疫纳米磁珠的最佳加入量。

2.免疫捕获时间的选择

确定磁珠的加入量后，取四份实施例2所制备好的免疫纳米磁珠，在室温下 以10r/min，对10⁴CFU/mL的人流感嗜血杆菌(ATCC编号53781)进行10min、 15min、20min、30min、45min及60min的免疫捕获，再由实施例3所描述的 量子点标记探针进行检测，记录荧光值。结果发现，荧光值在免疫捕获20min 时即达到最大值，故本实验选择20min作为免疫捕获的最佳时间。

实施例5PBST缓冲液的配制

取8gNaCL，0.2gKCl，0.24KH₂PO₄，1.44gNa₂HPO₄，0.3gNaN₃，0.5ml Tween-20溶解于800ml蒸馏水中，用5MNaOH调整pH至7.4，再定容至1000ml。

实施例6质控品的制备

1.阳性质控品：将用1％甲醛灭活的人流感嗜血杆菌(0.5μg)干燥结合到拭 子上，即为阳性质控品。

2.阴性质控品：阴性质控品即经临床确定为人流感嗜血杆菌阴性的人群的咽 拭子样品。

实施例7试剂盒的制备

由实施例2所描述的抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠、实施例3所描述的量子 点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针、实施例5所描述的PBST缓冲液、实施例6 所描述的质控品共同组成基于磁性分离和量子点标记的检测人流感嗜血杆菌抗 原的试剂盒。

实施例8试剂盒的使用方法

按常规临床手段获得人咽拭子，用0.5ml试剂盒中的PBST缓冲液溶解咽拭 子上的临床样本后，将溶解液转入1.5ml普通离心管中，向该离心管中加入试剂 盒中的抗人流感嗜血杆菌免疫纳米磁珠100μl，室温下以10rpm/min于旋转混 合仪上反应20min后取下，将离心管插入磁力架分离3min，用移液器吸出上清。 添加试剂盒中的PBST缓冲液1ml洗涤两遍，磁分离后吸出洗涤液，最后用1mLPBS 缓冲液重悬磁珠。取100μl上述的免疫纳米磁珠-菌体抗原复合物于另一离心管 中，再加入100μl试剂盒中的量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针，室温下 以15rpm/min于旋转混合仪上反应20min，通过量子点上的抗体与免疫纳米磁珠 上的菌体抗原的免疫结合，量子点被标记到菌体抗原表面，形成磁珠-菌体抗原- 量子点“三明治”复合物。反应完成后，磁分离3min，除去多余的量子点标记 探针，并用PBST缓冲液清洗2遍，复合物重新分散在100μlPBS缓冲液中，使用 荧光酶标仪(Ex＝405nm，Em＝565nm)对其荧光值进行检测。

按上述同样的方法检测试剂盒中提供的四份阴性质控品及一份阳性质控品 样品，分别读取荧光值；四份阴性质控品样品的荧光读数的平均值与3倍标准差 之和即为CUT-OFF值；若上述临床人咽拭子样本的检测荧光值若大于CUT-OFF值即 判断为此份临床咽拭子中人流感嗜血杆菌抗原为阳性，反之则判断为此份临床人 咽拭子样本中人流感嗜血杆菌抗原为阴性；若阳性质控品样品的荧光值小于 CUT-OFF值，则表明试剂盒失效。

实施例9试剂盒的检测敏感性和特异性试验

将人流感嗜血杆菌(ATCC编号53781)样品用PBST缓冲液进行系列稀释后， 用实施例7所述试剂盒进行检测，结果表明其检测底限为1×10³CFU/ml。同时， 用解脲支原体(ATCC编号27618)、人型支原体(ATCC编号23114)、肺炎支原体(ATCC 编号15531)、肺炎链球菌(ATCC编号49619)人腺病毒3型(GB株，ATCC编号VR-3)、 人腺病毒7型(Gomen株，ATCC编号VR-7)、人甲型流感病毒(H1N1，ATCC编号 VR-1743)、人乙型流感病毒(ATCC编号VR-790)、肺炎衣原体(AR-39株，ATCC 编号53592)、卡他莫拉菌(ATCC编号25238)等进行检测，试剂盒检测含这些微 生物的PBST缓冲液都为阴性。

实施例10临床测试例

以流感嗜血杆菌检测金标准-培养法作为参照，取88例呼吸科下呼吸道感染 者的咽拭子标本用实施例7所描述的试剂盒进行检测，培养法阳性率为20.5％ (18/88)，本试剂盒为22.7％(20/88)，2种方法的符合率为95.5％(84/88)。具 体结果如表1所示。

表1临床标本的检测结果

需要指出的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发 明，凡在本发明精神和原则之内所做的任何修改、等同替换等均应包含在本发明 的保护范围之内。