基于磁性分离和量子点标记的人肺炎支原体快速检测方法和试剂盒

摘要

本发明提供了一种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支原体抗原的方法，该方法包括（1）制备抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠；（2）制备量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针；（3）将待检样品用PBST缓冲液溶解后，向溶解液中加入抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠，充分混合及反应后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤，向得到的沉淀物中加入量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针，反应后磁分离，以PBST缓冲液洗涤后，使用荧光酶标仪检测荧光值。本发明建立了一套准确、快速、高灵敏度的检测人肺炎支原体的方法，其在人肺炎支原体的临床诊断、病原学鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检 测人肺炎支原体抗原的快速检测方法及检测试剂盒，以及该检测试剂盒的制备及 使用方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是人类支原体肺炎的病原体， 主要经飞沫传染，潜伏期2-3周，发病率以青少年最高。Mp感染在小儿肺炎病原 的发生率高达10-30％，近年来逐渐成为小儿感染呼吸道疾病的主要病原体之一。 该病极易引发咽炎、扁桃体炎等呼吸道感染，甚至可能同时继发脑膜炎、肝炎、 心肌炎等多脏器损伤，严重时也可导致患儿死亡。

由于Mp感染与其它病原体引起的呼吸道感染症状类似，不做病原学检查，很 难将Mp与其它病原体引起的呼吸道感染相区别。Mp无细胞壁，常用的β-内酰胺 类药物对其无效，故其引起的感染的治疗与其它细菌和病毒感染的治疗方案完全 不同，因此建立简便、快速、可行、能早期诊断肺炎支原体感染的方法非常必要。

目前Mp的检测方法主要有3类：一是分离培养法，其是证实感染的“金标准”， 但由于Mp的生长周期极为缓慢，培养周期长，导致该法在临床上不能进行快速诊 断；二是血清学方法，即采用酶联免疫法、胶体金免疫法、微量免疫荧光法和间 接血凝试验等，检测被检者血清中Mp抗体水平，可间接提示Mp感染的存在。然而， 血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，而且有时需要双份血清。另外，抗体出 现的时机不易掌握，儿童、青少年与成人之间又存在Mp特异性抗体的差异，并且， Mp细胞膜上的糖脂抗原与其他微生物及机体组织存在非特异性交叉反应，故现有 血清学方法的检测质量受到一定限制；三是利用分子生物学技术检测MpDNA的存 在，其中最常用的是聚合酶链式反应(PCR)，该方法快速、灵敏、特异，是目前 研究人肺炎支原体感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高， 且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。因此，建立人肺炎支 原体特异性抗原诊断方法十分必要。目前，已公开报道的检测人肺炎支原体抗原 的方法主要为双抗夹心ELISA法、量子点标记免疫层析法、间接免疫荧光法等， 但这些方法虽然灵敏度较高，但是由于人肺炎支原体在临床标本如咽拭子中的含 量极低，导致其临床检测阳性率还是较低，目前均未进行临床实际应用。

发明内容

针对背景技术中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量 子点标记的能简便、快速、高灵敏度的检测人肺炎支原体抗原的检测方法和试剂 盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支原体抗原的方法，其特征在 于：所述该方法包括以下步骤：

1)兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体的制备；

2)鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体的制备；

3)将步骤1)制备得到的兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体与纳米磁珠通 过共价偶联，制备抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠；

4)将步骤2)制备得到的鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体与纳米量子点 通过共价偶联，制备量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针；

5)取人呼吸道分泌物样本(包括但不限于咽拭子)，用PBST缓冲液溶解后， 加入步骤3)制备得到的抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠，充分混合，反应25-45min 后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，向磁分离得到的沉淀物中加入步骤4) 制备得到的量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针，反应25-45min后进行磁分 离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，使用荧光酶标仪读取荧光值；所述PBST缓冲液中 各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄， 0.5ml/LTween-20，所述PBST缓冲液的pH＝7.4；

6)根据步骤1)-步骤5)的方法分别检测四份经临床确定为人肺炎支原体阴 性的人群的呼吸道分泌物样品，读取荧光值；所述人肺炎支原体阴性的人群的呼 吸道分泌物样品简称人肺炎支原体阴性对照样品；所述四份人肺炎支原体阴性对 照样品的荧光值的平均值与3倍标准差之和即为CUT-OFF值；若步骤5)中人呼吸 道分泌物样本的检测荧光值大于CUT-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人 肺炎支原体抗原为阳性；若步骤5)中人呼吸道分泌物样本的检测荧光值小于 CUT-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人肺炎支原体抗原为阴性。

一种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支原体抗原的试剂盒，其特征 在于：所述试剂盒由具有富集人肺炎支原体抗原功能的抗人肺炎支原体免疫纳米 磁珠、量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针、质控品以及PBST缓冲液所组成； 所述质控品包括阳性质控品以及阴性质控品；所述阳性质控品由灭活的人肺炎支 原体干燥结合到拭子上而成；所述阴性质控品是经临床确定为人肺炎支原体阴性 的人群的咽拭子。

一种用于制备基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支原体抗原的试剂 盒的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

1)抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠的制备：

1.1)兔及鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG的制备

1.1.1)重组P1-His融合蛋白的制备、纯化：

1.1.1.1)对人肺炎支原体膜蛋白P1进行生物信息学分析，获取其胞外结构 域中抗原表位最为丰富的肽段；

1.1.1.2)找到步骤1.1.1.1)中所得到肽段对应的基因编码序列，根据大肠 杆菌中密码子的偏好性，对步骤1.1.1.1)中所得到基因编码序列进行密码子优 化；

1.1.1.3)在步骤1.1.1.2)中所得到的基因序列的5’端及3’端引入酶切位 点并化学合成全基因序列，同时标记记为p1；其基因序列如序列表所示；

1.1.1.4)将步骤1.1.1.3)中所得到的p1按分子生物学方法克隆入表达载体 pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组P1-His融合蛋白；所述重组P1-His融合 蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中；

1.1.1.5)用镍柱纯化步骤1.1.1.4)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯 度后，以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0.2mg/mL后备用；

1.1.2)兔及鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG的制备：

1.1.2.1)以步骤1.1.1.5)中所得到的重组P1-His融合蛋白为完全抗原，分 别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人肺炎支原体P1蛋白抗血清及鼠抗人 肺炎支原体P1蛋白抗血清；所述兔抗人肺炎支原体P1蛋白抗血清及鼠抗人肺炎支 原体P1蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×10⁵；

1.1.2.2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗人肺炎支原体P1蛋白抗血 清及鼠抗人肺炎支原体P1蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；

1.1.2.3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.1.2.2)所得到的 二种多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为1mg/mL后备用；

1.2)免疫纳米磁珠的包被：

1.2.1)取5mg磁珠，用1mlMES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进 行磁分离后移除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe₃O₄为内核、粒径为180nm的羧基 磁珠；所述MES缓冲液是质量浓度是2g/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸；所述MES缓冲 液的pH＝6.0；所述纳米磁分离器的磁性强度是0.4T；

1.2.2)依次加入用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是8-12mg/ml的 EDC溶液以及用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是6-10mg/ml的sulfo-NHS 溶液各0.5ml，以10-40rpm/min于旋转混合仪中活化1hr，置于纳米磁分离器 中进行磁分离后移除上清，用1ml步骤1.2.1)中的MES缓冲液重悬，得到活化 后的磁珠；

1.2.3)取5个离心管，在每个离心管中加入200μL步骤1.2.2)所得到的活 化后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用 PBS缓冲液稀释的浓度为50-200μg/ml的由步骤1.1)所制备的兔抗人肺炎支原 体P1蛋白多克隆抗体IgG溶液各1ml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应 2-6h，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml 乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁 珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2 g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，所述PBS缓冲液的pH＝7.4；

1.2.4)封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后 移除上清，各用1ml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下： 8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.5ml/LTween-20， 所述洗涤缓冲液的pH＝7.4；

1.2.5)向各个离心管中分别加入1ml保存缓冲液重悬磁珠，置于4℃保存 备用；所述保存缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.3g/LNaN₃，5g/L牛血清白蛋白(BSA)，所述保 存缓冲液的pH＝7.4；

2)量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针的制备：

其具体制备方法包括：

2.1)向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点、300nmolN-羟 基琥珀酰亚胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亚胺EDC，以磷酸盐缓冲液定容为2 ml，混合溶液，37℃反应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS及 EDC，得到活化后的量子点；所述磷酸盐缓冲液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸 氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠；所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.4；

2.2)在步骤2.1)所得到的活化的量子点中，加入4-12nmol的步骤1.1)中 所制备的鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入单端氨基 化聚乙二醇PEG2000-NH₂至终浓度为1％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光 反应1h；

2.3)用0.2μmPES滤器过滤除去步骤2.2)中的抗体聚集物，然后将滤液 转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发 生偶联反应的抗体和反应中的副产物；

2.4)收集步骤2.3)中超滤离心管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2 ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到一个新的50000MW超滤离心管中，以8000 g离心力在4℃下离心15min，收集超滤离心管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液， 溶于1ml磷酸盐保存液中，置于4℃保存备用；所述磷酸盐洗涤液中各成分含量 如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，5ml/L吐温 -20，0.3g/L叠氮钠，所述磷酸盐洗涤液的pH＝7.4；所述磷酸盐保存液中各成 分含量如下：2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10g/L 牛血清白蛋白，0.3g/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH＝7.4；

3)PBST缓冲液的配制：

其具体配制方法包括：

取8gNaCL，0.2gKCl，0.24KH₂PO₄，1.44gNa₂HPO₄，0.3gNaN₃，0.5ml Tween-20溶解于800ml蒸馏水中，用5MNaOH调整pH至7.4，再定容至1000ml；

4)质控品的制备：

4.1阳性质控品：阳性质控品由灭活的人肺炎支原体干燥结合到拭子上而 成；

4.2阴性质控品：阴性质控品即经临床确定为人肺炎支原体阴性的人群的咽 拭子；

作为优选，本发明在步骤1.2.2)中，依次加入用步骤1.2.1)中的MES缓冲 液配制的浓度是10mg/ml的EDC溶液以及用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓 度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以15rpm/min于旋转混合仪中活化1hr， 置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用1ml步骤1.2.1)中的MES缓冲 液重悬，得到活化后的磁珠；

所述步骤1.2.3)中，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的浓度为100μ g/ml的由步骤1.1)所制备的兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG溶液各1 ml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应3h，置于纳米磁分离器中进行磁 分离后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液；

所述步骤2.2)中，在步骤2.1)所得到的活化的量子点中，加入6nmol的步 骤1.1)中所制备的鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h。

作为优选，本发明所采用的量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性 CdSe/ZnS量子点。

作为优选，本发明所采用的磁珠是以超顺磁性Fe₃O₄为内核、壳材料为聚苯乙 烯、表面官能团为羧基、粒径为180nm的羧基磁珠。

一种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支原体抗原的试剂盒的使用 方法，其特征在于：所述使用方法包括以下步骤：

1)将待检样本用0.5mlPBST缓冲液溶解后将溶解液转入1.5ml普通离心管 中；所述PBST缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄， 1.44g/LNa₂HPO₄，0.3g/LNaN₃，0.5ml/LTween-20；所述PBST缓冲液的pH＝7.4；

2)向步骤1)中的离心管中加入基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支 原体抗原的试剂盒中的抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠50-150μl，室温下以10 rpm/min于旋转混合仪上反应25-45min后取下，将离心管插入纳米磁分离器磁 分离3min，用移液器吸出上清；

3)添加试剂盒中的PBST缓冲液1ml洗涤两遍，采用纳米磁分离器磁分离后 吸出洗涤液，最后用1mlPBS缓冲液重悬磁珠，制得免疫纳米磁珠-支原体抗原 复合物；所述PBS缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄；所述PBS缓冲液的pH＝7.4；

4)取100μl步骤3)得到的免疫纳米磁珠-支原体抗原复合物于另一离心管 中，再加入100μl基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支原体抗原的试剂 盒中的量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针，室温下以15rpm/min于旋转混合 仪上反应25-45min，通过量子点上的抗体与免疫纳米磁珠上的支原体抗原的免 疫结合，量子点被标记到支原体表面，形成磁珠-支原体抗原-量子点“三明治” 复合物；

5)反应完成后，采用纳米磁分离器磁分离3min，除去多余的量子点标记的 抗人肺炎支原体纳米探针，用试剂盒中的PBST缓冲液液清洗2遍，复合物重新分 散在100μlPBS缓冲液中，使用荧光酶标仪对其荧光值进行检测；所述PBS缓冲 液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄； 所述PBS缓冲液的pH＝7.4；

6)按上述同样的方法检测试剂盒中提供的四份阴性质控品样品及一份阳性 质控品样品，分别读取荧光值；四份阴性质控品样品的荧光读数的平均值与3倍 标准差之和即为CUT-OFF值；若步骤5)中待检样本的检测荧光值若大于CUT-OFF 值即判断为待检样本中人肺炎支原体抗原为阳性，反之则判断为待检样本中人肺 炎支原体抗原为阴性；若阳性质控品样品的荧光值小于CUT-OFF值，则表明试剂 盒失效。

作为优选，本发明所提出的步骤2)中，向步骤1)中的离心管中加入基于磁 性分离和量子点标记的检测人肺炎支原体抗原的试剂盒中的抗人肺炎支原体免 疫纳米磁珠100μl，室温下以10rpm/min于旋转混合仪上反应30min后取下， 将离心管插入磁力架分离3min，用移液器吸出上清；

所述步骤4)中，取100μl步骤3)得到的免疫纳米磁珠-支原体抗原复合物 于另一离心管中，再加入100μl基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支原 体抗原的试剂盒中的量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针，室温下以15 rpm/min于旋转混合仪上反应30min，通过量子点上的抗体与免疫纳米磁珠上的 支原体抗原的免疫结合，量子点被标记到支原体表面，形成磁珠-支原体抗原- 量子点“三明治”复合物。

作为优选，本发明所提供的待检样本包括但不限于咽拭子。

本发明所需的羧基水溶性纳米量子点、180nm羧基磁珠,可到相关专业的研 究单位、公司购买或定制；所需的仪器、设备、药品均有市售。

本发明相比现有技术具有如下优点：

1、本发明利用了免疫纳米磁珠对样品的可富集性、分离的速度快、效率高 等优点，同时结合量子点光化学稳定性高、荧光强度高等特性，使得检测体系具 备多重信号协同放大的效果，从而具有超高的检测灵敏度(其对人肺炎支原体P1 膜蛋白的检测底线为0.2ng/ml，低于目前任何一种已报道的检测方法，如ELISA 法的2μg/ml)，用其对临床样品的检测结果与目前对该病原体的检测“金标准” -培养法的相比无统计学差异。

2、本发明所用的抗体是识别人肺炎支原体特异性P1抗原胞外保守区的多克 隆抗体，其特异性高，同时其较目前最广泛使用的单克隆抗体而言制备成本低廉， 因此，本发明检测成本较低。

3、本发明检测方法简单，检测快速，易于判定，检测成本低廉，克服了现 有技术检测阳性率低、成本高、操作复杂繁琐、耗时长、无法进行临床应用的不 足。

4、由于检测试剂盒检测的是人肺炎支原体抗原而非抗体(抗体的出现需要 感染几周以后)，故而可进行早期诊断和防治，临床诊断符合率高。该方法在人 肺炎支原体的临床诊断、病原学鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。

5、本发明检测方法所用的临床样本为呼吸道分泌物如痰液等，而非血液， 可免除婴幼儿患者抽血检查的痛苦与家长的心理负担，故较易于推广。

具体实施方式

本发明是根据免疫学中的双抗夹心原理，利用免疫纳米磁珠对样品的可富集 性、分离的速度快、效率高等优点，结合量子点光化学稳定性高、荧光强度高等 特性，建立的一套具备多重信号协同放大、具有超高灵敏度及高度特异性的快速 检测人肺炎支原体的新方法，具有广阔的市场应用前景。

本发明通过以下实施例作进一步具体描述。

各种试剂的配制及所需材料的说明

1.PBS缓冲液：称取1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾,8g氯化钠， 0.2g氯化钾，溶解于900ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.4后用去离 子水定容至1000ml。

2.兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS缓冲液 稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为1mg/ml。

3.鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG：为本发明自制，用PBS缓冲液 稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为1mg/ml。

4.量子点：本发明中所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性 CdSe/ZnS量子点，其发射波长为565nm，自武汉珈源量子点技术开发有限公司购 买，产品名称为羧基水溶性量子点-565。

5.磁珠：本发明中所用磁珠是以超顺磁性Fe₃O₄为内核、壳材料为聚苯乙烯、 表面官能团为羧基、粒径为分别为50nm、180nm、350nm、1150nm、3μm的羧 基磁珠，可从陕西北美基因股份有限公司、上海奥润微纳新材料科技有限公司购 买。

6.人肺炎支原体：购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC 15531。

7.本发明所用到的微生物样品均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

实施例1兔及鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG的制备

(一)重组P1-His融合蛋白的制备、纯化

1.相关基因的克隆

对人肺炎支原体膜蛋白P1(其NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber为 AAK92040)进行生物信息学分析，获取其胞外保守结构域中抗原表位最为丰富的 肽段，找到其对应的DNA编码序列，再根据大肠杆菌密码子偏好性，对其进行密 码子优化，同时在其5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点 XhoI后化学合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交 货时人工合成的基因片段连于载体pUC57上)，记为p1。其基因全序列如序列表所 示。具体的说，p1基因编码的蛋白质序列为天然人肺炎支原体膜蛋白P1 (accessionnumber:AAK92040)的1310-1523aa。将含有该段人工合成的DNA片段 的载体pUC57用NdeI及XhoI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时 采用NdeI及XhoI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规方法将经双酶切后获得 的p1基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-P1表达载体。 经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组P1-His融合蛋白。

2.重组P1-His融合蛋白的表达与纯化

将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coli BL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常 规方法筛选表达菌株。挑取pET-P1转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接 种入100mLLB培养基中，于37℃培养过夜。取出菌液后，按1：100接种于100mL 含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导4h后于 8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用20mL磷酸盐缓冲液(8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄pH7.4)洗涤3次并用10mL 上样缓冲液(20mMNa₃PO₄,0.5MNaCl；30mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超声 破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成 后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组P1-His 融合蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中。

重组P1-His融合蛋白的纯化步骤如下：

将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用HisTrap affinitycolumns(GEhealthcare公司产品)，按照说明书用同样的方法进行 纯化。具体方法如下：

1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器 连接上，以1mL/min流速洗柱。

2)用10mL上样缓冲液平衡，1mL/min流速。

3)将融合蛋白上样，1mL/min流速。

4)用10mL上样缓冲液，以1mL/min流速洗柱。

5)用10mL洗脱缓冲液(20mMNa₃PO₄，0.5MNaCl，300mM咪唑，pH7.4)， 以1mL/min流速洗脱，分管收集，每管1ml，12％SDS-PAGE检测，合并洗脱组分 中含有目的蛋白的样品。经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为 0.2mg/mL。

(二)兔及鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG的制备

1.兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG的制备

用步骤(一)纯化的重组P1-His融合蛋白按照200μg(1mL)与1mL弗氏完 全佐剂混匀乳化后免疫雄性新西兰大白兔(由湖北省疾病预防控制中心提供)， 于背部皮下多点注射，间隔7d后再免疫一次，再过14d后用上述纯化的重组 P1-His融合蛋白按照200μg(1mL)与1mL弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行加 强免疫，加强免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次。7d后取血分析抗体 滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意(用ELISA法 测定抗体效价大于1×10⁵)。若满意则心脏采血，分离血清，以ProteinG亲和层 析柱(GEhealthcare公司产品)，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用 凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液(8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄pH＝7.4)调整为1mg/mL，-20℃ 保藏备用，至此制得兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG。Westenblot试验 表明，此多克隆抗体IgG能特异性识别人肺炎支原体全长P1蛋白。

2.鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG的制备

用步骤(一)纯化的重组P1-His融合蛋白作为完全抗原免疫豚鼠(由湖北省 疾病预防控制中心提供)，肩胛下注射抗原200μg/只。基础免疫为等体积的抗 原与弗氏完全佐剂进行乳化，每隔2周进行一次加强免疫，加强免疫用等体积抗 原与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，总共免疫4次。末次免疫10d后取血分析 抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意(用ELISA 法测定抗体效价大于1×10⁵)。若满意则处死豚鼠取血清，以ProteinG亲和层析 柱(GEhealthcare公司产品)，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯 基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液(8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄pH＝7.4)调整为1mg/mL，备 用，至此制得鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG。Westenblot试验表明， 此多克隆抗体IgG能特异性识别人肺炎支原体全长P1蛋白。

实施例2抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠的制备

1.抗人肺炎支原体多克隆抗体偶联磁珠反应条件的优化：

以偶联了抗人肺炎支原体多克隆抗体的磁珠作为固相载体，量子点标记的抗 人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体作为检测抗体，通过双抗夹心法原理检测人肺炎 支原体抗原，观察磁珠与多抗的偶联情况。分别对磁珠的粒径，以及EDC/NHS 活化剂浓度、偶联抗体浓度、偶联时间、封闭剂种类等偶联条件进行了一系列的 优化选择。

1.1磁珠粒径的选择

选择粒径为50nm、180nm、350nm、1150nm、3μm的羧基磁珠，均加入含 4mg/mlEDC及4mg/mlNHS的PBS缓冲液进行活化反应后，分别与实施例1所描 述的兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG进行偶联反应。分别将制备好的免 疫纳米磁珠检测10⁴CFU/mL的人肺炎支原体(ATCC编号15531)，荧光显微镜下观 察结果，选择荧光强度大，背景荧光干扰少，以及在磁场作用下分离速度较快者 为最适磁珠粒径。结果表明粒径180nm的磁珠最符合本发明的要求，确定最适磁 性微球粒径为180nm。

1.2EDC/NHS活化剂浓度的选择

将反应体系中EDC和NHS浓度各自设为l～10mg/ml后进行浓度梯度组合，分 别活化粒径180nm的羧基磁珠。将制备好的免疫纳米磁珠检测10⁴CFU/mL的人肺 炎支原体(ATCC编号15531)，选择荧光最强者为EDC和NHS溶液的最适活化浓度。 结果表明当EDC浓度为5mg/ml、NHS浓度为4mg/ml时偶联效果最好。

1.3偶联抗体浓度的选择

将20μg、40μg、60μg、80μg、100μg、120μg、140μg的兔抗人肺炎支 原体P1蛋白多克隆抗体IgG分别与1mg按上述最优方法活化的粒径为180nm的磁 珠进行偶联。将制备好的免疫纳米磁珠检测10⁴CFU/mL的人肺炎支原体(ATCC 编号15531)，结果发现，当抗体的投放量小于100μg/mg时，荧光强度随着抗体 的浓度增加而增加，而当抗体的质量浓度大于100μg/mg时，荧光强度基本不变 甚至略有减小，因此本实施例选择兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG的偶 联量为100μg/mg。

1.4偶联时间的选择

确定磁珠的粒径、EDC/NHS活化剂浓度及抗体偶联量后，将抗体与磁珠的偶 联反应时间分别设为0.5h、1h、2h、3h、4h、5h，将制备好的免疫纳米磁珠检测 10⁴CFU/ml的人肺炎支原体(ATCC编号15531)。结果发现，当偶联时间>3h时， 荧光强度趋于稳定，此后再延长偶联时间，荧光不再增强。因此，确定兔抗人肺 炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG与磁珠的最适偶联反应时间为3h。偶联时间远 少于传统ELISA法的24h。

1.5封闭剂的选择

按照上述确定的最优条件选择磁珠的粒径、EDC/NHS活化剂浓度、抗体偶联 量及偶联时间后进行偶联反应。偶联结束后，选择BSA，乙醇胺，Tris和D-氨基 葡萄糖盐酸盐作为免疫纳米磁珠封闭剂，制得成品免疫纳米磁珠。将制备好的免 疫纳米磁珠检测10⁴CFU/mL的人肺炎支原体(ATCC编号15531)。结果发现，采用 乙醇胺作为封闭剂的免疫纳米磁珠的检测荧光值最高。我们推测由于乙醇胺的分 子较小，可以较好的消耗由于空间位阻未与抗体结合的表面羧基，使封闭更为完 全，并且有效减少空间位阻效应对已连接抗体的结构影响。

2.偶联过程：

取5mg磁珠(以超顺磁性Fe₃O₄为内核、粒径为180nm的羧基磁珠)于1.5ml 普通离心管中，用1mlMES缓冲液(2g/LMES，pH6.0)洗涤三次，置于纳米磁 分离器中进行磁分离(0.4T)后移除上清，依次加入用上述MES缓冲液配制的浓度 为10mg/ml的EDC溶液及用上述MES缓冲液配制的浓度为8mg/ml的sulfo-NHS溶液 各0.5ml，以15rpm/min于旋转混合仪中活化1hr，磁分离后移除上清，用1ml 上述的MES缓冲液重悬；取5个离心管，每个离心管中加入200μL上述活化的磁 珠，磁分离后吸出上清，向各管中加入用PBS缓冲液(8g/LNaCL，0.2g/LKCl， 0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，pH7.4)稀释的浓度为100μg/ml的实施例 1所制备的兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG溶液各1ml，室温下以15 rpm/min于旋转混合仪中反应3h，磁分离移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙 醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠 上未与抗体反应的羧基。磁分离后移除各管上清，各用1ml洗涤缓冲液(8g/L NaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.5ml/LTween-20， pH7.4)洗涤三遍,最后各用1ml保存缓冲液(8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/L KH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.3g/LNaN₃，5g/LBSA，pH7.4)重悬磁珠，置于 4℃保存备用。

实施例3量子点标记的抗人肺炎支原体纳米探针的制备

1.纳米羧基量子点标记鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG反应条件 的优化：

1.1、羧基量子点标记抗体探针最佳标记pH的确定

将标记反应中磷酸盐缓冲液pH分别设为5，6，7，8，9，对标记产物利用全 光谱仪进行荧光强度测定，观察不同pH值对偶联反应的影响，确定了量子点标记 多抗反应的最佳pH为7.0-8.0。本实验选择pH7.4。

1.2、羧基量子点标记抗体探针最佳标记量的确定

将量子点摩尔浓度与多抗浓度之比分别设置为1:1，1:2，1:3及1:4，进行标 记反应后，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察二者不同浓度比对 偶联反应的影响，确定量子点标记鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG反应 的最佳摩尔浓度比为量子点与抗体摩尔比为1:3。本实验选择该最优浓度比来确 定标记量。

1.3、羧基量子点标记抗体探针最佳封闭剂种类的确定

以乙醇胺、Tris、PEG2000-NH₂或者BSA作为封闭剂，进行标记反应后，对标 记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察不同的封闭剂对于标记反应的影 响，结果发现，PEG2000-NH₂为最佳封闭剂，其可显著提高标记复合物的胶体稳 定性及免疫活性。

2.标记过程：

向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点、300nmolN-羟基琥珀 酰亚胺(sulfo-NHS)和300nmol碳二亚胺(EDC)，以磷酸盐缓冲液(2.9g/L 磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，pH7.4)定容为2ml，不停 地混合溶液，37℃反应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS与 EDC。在活化的量子点中，加入6nmol的实施例1所制备的鼠抗人肺炎支原体P1 蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入单端氨基化聚乙二醇(PEG2000-NH₂) 至终浓度为1％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h。用0.2μmPES 滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g 离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物。收 集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液(2.9g/L 磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，5ml/L吐温-20，0.3g/L叠 氮钠，pH7.4)中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心 力在4℃下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于1ml 磷酸盐保存液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10 g/LBSA，0.3g/L叠氮钠，pH7.4)中，置于4℃保存备用。

实施例4免疫纳米磁珠对人肺炎支原体抗原进行免疫捕获条件的优化

以偶联了兔抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体IgG的免疫纳米磁珠作为固相 载体，量子点标记的鼠抗人肺炎支原体P1蛋白多克隆抗体作为检测抗体，通过双 抗夹心法原理，建立人肺炎支原体抗原的检测体系。分别对检测体系中免疫纳米 磁珠的用量，捕获时间等条件进行了一系列的优化选择。

1.免疫纳米磁珠加入量的选择

将20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl、140μl的由实施例2所 制备好的免疫纳米磁珠分别加入到0.5ml含10⁴CFU/mL的人肺炎支原体(ATCC 编号15531)的PBS悬浮液中，进行免疫捕获，再由实施例3所描述的量子点标记 探针进行检测，记录荧光值。结果发现，随着免疫纳米磁珠加入量的增加，荧光 值逐渐增大，当免疫纳米磁珠加入量达到100μl时，荧光值达到最大。再继续增 加免疫纳米磁珠的量，荧光值反而降低。这可能是由于免疫纳米磁珠过多，磁分 离时对菌体造成损伤，从而导致捕获率下降。故本实验选择100μl作为免疫纳米 磁珠的最佳加入量。

2.免疫捕获时间的选择

确定磁珠的加入量后，取四份实施例2所制备好的免疫纳米磁珠，在室温下 以10r/min，对10⁴CFU/mL的人肺炎支原体(ATCC编号15531)进行15min、30min、 45min及60min的免疫捕获，再由实施例3所描述的量子点标记探针进行检测， 记录荧光值。结果发现，荧光值在免疫捕获30min时表现出最大值，随着时间的 延长，数值有所下降。故本实验选择30min作为免疫捕获的最佳时间。

实施例5PBST缓冲液的配制

取8gNaCL，0.2gKCl，0.24KH₂PO₄，1.44gNa₂HPO₄，0.3gNaN₃，0.5ml Tween-20溶解于800ml蒸馏水中，用5MNaOH调整pH至7.4，再定容至1000ml。

实施例6质控品的制备

1.阳性质控品：将用1％甲醛灭活的人肺炎支原体(0.5μg)干燥结合到拭子 上,即为阳性质控品。

2.阴性质控品：阴性质控品即经临床确定为人肺炎支原体阴性的人群的咽拭 子样品。

实施例7试剂盒的制备

由实施例2所描述的抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠、实施例3所描述的量子点 标记的抗人肺炎支原体纳米探针、实施例5所描述的PBST缓冲液、实施例6所描述 的质控品共同组成基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎支原体抗原的试剂 盒。

实施例8试剂盒的使用方法

按常规临床手段获得人咽拭子，用0.5ml试剂盒中的PBST缓冲液(8g/L NaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.5ml/LTween-20， pH7.4)溶解咽拭子上的临床样本后，将溶解液转入1.5ml普通离心管中，向该 离心管中加入试剂盒中的抗人肺炎支原体免疫纳米磁珠100μl，室温下以10 rpm/min于旋转混合仪上反应30min后取下，将离心管插入磁力架分离3min，用 移液器吸出上清。添加试剂盒中的PBST缓冲液1ml洗涤两遍，磁分离后吸出洗涤 液，最后用1mLPBS缓冲液重悬磁珠。取100μl上述的免疫纳米磁珠-支原体抗 原复合物于另一离心管中，再加入100μl试剂盒中的量子点标记的抗人肺炎支原 体纳米探针，室温下以15rpm/min于旋转混合仪上反应30min，通过量子点上的 抗体与免疫纳米磁珠上的支原体抗原的免疫结合，量子点被标记到支原体表面， 形成磁珠-支原体抗原-量子点“三明治”复合物。反应完成后，磁分离3min， 除去多余的量子点标记探针，并用PBST缓冲液清洗2遍，复合物重新分散在100 μlPBS缓冲液中，使用荧光酶标仪(Ex＝405nm，Em＝565nm)对其荧光值进行 检测。

按上述同样的方法检测试剂盒中提供的四份阴性质控品及一份阳性质控品 样品，分别读取荧光值；四份阴性质控品样品的荧光读数的平均值与3倍标准差 之和即为CUT-OFF值；若上述临床人咽拭子样本的检测荧光值若大于CUT-OFF值即 判断为此份临床咽拭子中人肺炎支原体抗原为阳性，反之则判断为此份临床人咽 拭子样本中人肺炎支原体抗原为阴性；若阳性质控品样品的荧光值小于CUT-OFF 值，则表明试剂盒失效。

实施例9试剂盒的检测敏感性和特异性试验

将实施例1所述的人工表达的重组人肺炎支原体P1蛋白(P1-His)用PBS缓冲 液进行系列稀释后，用本试剂盒进行检测，结果表明其检测底限为0.2ng/ml。 同时，用107CFU/mL的解脲支原体(ATCC编号27618)、人型支原体(ATCC编号 23114)、肺炎衣原体(AR-39株，ATCC编号53592)、肺炎链球菌(ATCC编号49619) 等进行检测，试剂盒检测含这些微生物的PBS稀释液都为阴性。

实施例10临床测试例

以支原体检测“金标准”分离培养法作为参照，在流行季节，取220例临床 咽拭子标本进行检测，培养法阳性率为13.1％(29/221)，本试剂盒为15.4％ (34/221)，2种方法的符合率为97.7％(216/221)。具体结果如表1所示。

表1临床标本的检测结果

需要指出的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发 明，凡在本发明精神和原则之内所做的任何修改、等同替换等均应包含在本发明 的保护范围之内。