公开/公告号CN105203765A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-12-30
原文格式PDF
申请/专利权人 成都安普诺生物科技有限公司;
申请/专利号CN201510532267.X
申请日2015-08-26
分类号G01N33/577;
代理机构成都高远知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人李高峡
地址 610000 四川省成都市高新区盛华南路80号32栋13层1322号
入库时间 2023-12-18 13:09:08
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-04-19
授权
授权
2016-01-27
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/577 申请日:20150826
实质审查的生效
2015-12-30
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种重金属定量检测系统以及定量检测重金属的方法。
背景技术
随着我国经济的快速发展和生活水平的提高，人们再对食品安全有了更高的要求同 时，由于我国在市场经济建设过程中由于制度建设和监管水平等多种原因导致我国食品安 全问题日益严重。引起食品安全问题的原因很多，重金属超标问题是影响食品安全的重要 因素之一。目前,重金属如铜、铅、锌、铁、钴、镍、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等。 现阶段对我们人类和环境造成危害的重金属有以下几种元素：汞、镉、铅、铬、铜以及类 金属砷等生物毒性显著的重金属元素。
如果重金属元素未经处理就直接排入河流、湖泊或海洋,或者进入土壤中,由于它们 不能被生物降解而使这些河流、湖泊、海洋和土壤受到污染。在食物链的生物放大作用下, 它们成千百倍地富集,最后进入人体。如鱼类或贝类积累的重金属被人类所食,或重金属 被稻谷、小麦等农作物吸收后被人类食用,重金属就会进入人体,使人产生重金属中毒, 轻则发生怪病(水俣病、骨痛病等),重则导致死亡。其次,重金属在人体内能和蛋白质及 酶等发生强烈的相互作用,使它们失去活性,也可在人体的某些器官中累积,造成慢性中 毒,重金属超标引起的中毒事件不胜枚举。对于水体和土壤中的重金属污染，现在还没有 很好的办法，因为存在于水和土壤中的重金属很难降解，并且还具有富集性，所以重金属 的污染是不可逆转的。
(1)铅：是可在人体和动物组织中积蓄的有毒金属。它是通过皮肤、消化道、呼吸道 进入体内与多种器官亲和，主要毒性效应是贫血症、神经机能失调和肾损伤，易受害的人 群有儿童、老人、免疫力低下人群。
(2)镉：不是人体的必需元素，可通过食物链富集作用危害人类健康，对人体多系统 具有毒性作用，联合国粮农组织和世界卫生组织将Cd2+列为第三位优先研究的食品污染 物。镉的毒性很大，可在人体内积蓄，主要积蓄在肾脏，引起泌尿系统的功能变化；镉能 够取代骨中钙，使骨骼严重软化，骨头寸断，会引起胃脏功能失调，干扰人体和生物体内 锌的酶系统，导致高血压症上升。易受害的人群是矿业工作者、免疫力低下人群。
(3)汞：汞及其化合物属于剧毒物质，可在人体内蓄积。血液中的金属汞进入脑组织 后，逐渐在脑组织中积累，达到一定的量时就会对脑组织造成损害，另外一部分汞离子转 移到肾脏。进入水体的无机汞离子可转变为毒性更大的有机汞，由食物链进入人体，引起 全身中毒作用；易受害的人群有女性，尤其是准妈妈、嗜好海鲜人士；天然水中含汞极少， 一般不超过0.1μg/L。
(4)砷：是人体的非必需元素，元素砷的毒性极低，而砷的化合物。均有剧毒，三价 砷化合物比其它砷化合物毒性更强。砷通过呼吸道、消化道和皮肤接触进入人体，如摄入 量超过排泄量，砷就会在人体的肝、肾、肺、脾、子宫、胎盘、骨胳、肌肉等部位蓄积， 与细胞中的酶系统结合，使酶的生物作用受到抑制失去活性，特别是在毛发、指甲中蓄积， 从而引起慢性砷中毒，潜伏期可达几年甚至几十年，慢性砷中毒有消化系统症状、神经系 统症状和皮肤病变等。砷还有致癌作用，能引起皮肤癌。地面水中含砷量因水源和地理条 件不同而有很大差异，淡水平均为0.5μm/L，海水为3.7μm/L。
(5)铬：如误食饮用，可致腹部不适及腹泻等中毒症状，引起过敏性皮炎或湿疹，呼 吸进入，对呼吸道有刺激和腐蚀作用，引起咽炎、支气管炎等。水污染严重地区居民，经 常接触或过量摄入者。易得鼻炎、结核病、腹泻、支气管炎、皮炎等
(5)铜：过量铜在人体内富集,会出现恶心、呕吐、上腹疼痛、急性溶血和肾小管变形 等中毒现象,严重者还可导致急性肾衰等危害。铜粉尘可引起咽痛、咳嗽和咯痰,甚至胸闷 气憋,发冷发烧。
目前常规重金属检测方法有原子荧光光度法(AFS)、电感藕合等离子体质谱(ICP-MS) 分析技术、电感藕合等离体原子发射光谱(ICP-AES)、高效液相色谱法等。在当前众多 应用于重金属离子检测的分析技术中，原子吸收光谱法是最常用的方法，该方法通常有较 高的灵敏度，但成本较高、需要专业技术人员操作、获得较高的灵敏度需要较大的样本容 量且由于样本必须依次分析而耗时较长。因此，不能满足当前大批量样品快速，简便和适 于现场检测的需求。
免疫分析法是一种具有高度特异性和灵敏度的分析方法,重金属检测主要有有间接竞 争性ELISA法和胶体金快速免疫层析法。采用免疫层析法检测时，需要用胶体金显色。
胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下， 可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏 水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。
免疫分析法利用抗原抗体特异性结合反应，使标记抗体的显色剂显色，而检测各种物 质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与 抗体的正电荷基团结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响抗体的生物特性。因而利 用胶体金进行免疫分析时，具有方便快捷不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点， 得到广泛使用。
然而，由于胶体金只有在弱碱性环境下才能与抗体有效结合，一旦检测对象的pH不 是弱碱性的，则无法准确检测，而重金属的检测需要用强酸提取，虽然通过增加稀释倍数 的方式可以勉强检测，但是检测结果不准确。
中国专利申请CN201010229009.1公开了一种重金属汞抗体制备及酶联免疫吸附法测 定重金属含量的方法，可以用来检测重金汞，但是该方法准确性查，而且操作复杂，需要 专业大型设备。中国专利申请CN201020521531.2公开了一种重金检测卡，该检测卡只能 再特殊环境中进行检测，而且只能定性检测，无法定量检测是。
因此市面上需要一种能够快速、准确定量检测重金属，而且方便携带的检测系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重金属定量检测系统。
首先，本发明提供了一种改性胶体金的制备方法，它包括如下步骤：
(1)取直径为10～60nm的胶体金溶液100份，加入胶体金溶液体积的0.1～3％的二 (三乙醇胺)钛酸二异丙酯溶液，二(三乙醇胺)钛酸二异丙酯溶液的浓度为1％，100～ 400r/min下搅拌0.5～2h，得混合溶液；
(2)调节上述混合溶液pH值至8～10，加入0.1～2份钛酸正丁酯，在室温下以100～ 400r/min搅拌反应24～36小时，在4000～16000r/min条件下离心5～60min，吸出上清液 加入超纯水或缓冲液清洗，重复1～2次，即制备得表面含有活性-OH的钛酸酯改性的胶 体金颗粒。
步骤(1)中，所述胶体金溶液采用氯金酸—柠檬酸三钠还原法制备。
步骤(2)中，调混合溶液pH值采用氨水调节。
本发明还提供了前述方法制备的改性胶体金。
本发明还提供了一种金标抗体的制备方法，步骤如下：取前述的改性胶体金，加入抗 体，胶体金表面活性-OH与抗体Fc段-COOH反应形成稳定键合，形成金标抗体。
优选地，所述抗体是Cd单克隆抗体、Pb单克隆抗体、Hg单克隆抗体、As单克隆抗 体、Cr单克隆抗或Cu单克隆抗体。
本发明还提供了前述方法制备的金标抗体。
本发明还提供了前述改性胶体金或者前述金标抗体在免疫胶体金检测中的用途。
优选地，所述免疫胶体金检测是免疫胶体金光镜染色、免疫胶体金电镜染色、胶体金 免疫层析。
本发明检测重金属的胶体金免疫层析试剂盒：它包括检测试纸和卡壳，试纸置于卡壳 中；所述检测试纸包括塑料底板1，一端粘贴上样品垫2，上样品垫的一端紧密压接着含 有所检测重金属相对应抗体所标记的金标制作的胶体金垫3，胶体金垫3一端紧密压接着 硝酸纤维素膜4，硝酸纤维素膜上包被有检测线T和质控线C5，检测线T包被着待检重 金属的完全抗原，质控线C上包被有抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜另一端连接吸样垫6； 所述卡壳表面对应样品垫2的位置设有加样孔7，卡壳表面对应硝酸纤维素膜4的位置设 有观察口8；其中，胶体金垫上的胶体金为前述方法制备的改性胶体金。
优选地，所述胶体金垫上的金标抗体为前述方法制备的金标抗体。
优选地，所述重金属的完全抗原是重金属与络合剂络合后，与载体蛋白相偶联形抗原， 其中，所述络合剂是柠檬酸、乙二胺四乙酸、氨基乙酸、1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺 -N,N,N',N'-四乙酸、二乙烯三胺五羧酸盐、谷胱甘肽和有机多齿配体中的一种或多种；所 述载体蛋白是牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白中的一种或多种。
优选地，所述硝酸纤维素膜是孔径5-12微米的多孔样结构膜，所述样品垫为玻璃纤 维素膜或聚酯膜，所述吸样纸为吸水滤纸。
本发明还提供了一种检测重金属的检测系统，它包括前述所述的胶体金免疫层析试剂 盒、干式恒温仪和胶体金读数仪，其中，胶体金读数仪是一种手持式胶体金读数仪。
本发明还提供了一种检测重金属的方法，它是前述的检测系统进行检测。
优选地，它包括如下步骤：
1)使用粉碎机粉碎所需检测样品，并过20目筛网。
2)取待检样品，加入2～8倍mL/g的提取剂，在震荡频率为2～60cpm条件下反应5～ 30min，过滤，取上清，加入上清2～40倍体积的稀释液，混匀，得混合液；所述提取剂 是浓度为1～15％的硝酸溶液；所述稀释剂为添加有表面活性剂、重金属络合剂的缓冲溶 液；
3)将前所述的胶体金免疫层析试剂盒和步骤1)制备的混合液分别放入干式恒温仪 中，恒温2～15min，温度设定为20～45℃；
4)在干式恒温仪中，将步骤1)制备的混合液加入试剂盒的加样孔中，恒温反应5～ 30min；
5)将反应后的试剂盒，置于胶体金读数仪中，读取数据即可。
进一步优选地，它包括如下步骤：
1)取待检样品，加入4倍mL/g的提取剂，在震荡频率为2～60cpm条件下反应5min， 过滤，取上清，加入上清4倍体积的稀释液，混匀，得混合液；所述提取剂是浓度为10％ 的硝酸溶液；所述稀释剂为添加有1％tween20，1×10-7ITCBEg/mL的0.2MPBS溶液；
2)将前述的胶体金免疫层析试剂盒和步骤1)制备的混合液分别放入恒温装置中， 恒温5min，温度设定为37℃；
3)在恒温装置中，将步骤1)制备的混合液加入试剂盒的加样孔中，恒温反应20min；
4)将反应后的试剂盒，置于胶体金读数仪中，读取数据即可。
本发明改性胶体金是表面含有活性-OH的钛酸酯改性的胶体金颗粒，其与抗体反应 时，改性胶体金表面活性-OH即与抗体Fc段上-COOH发生缩合反应，形成稳定的化学键 合，得本发明稳定的金标抗体，而不是传统胶体金与抗体通过静电结合形成的金标抗体， 本发明改性胶体金制备得到的金标抗体稳定，不受酸碱环境和离子强度影响，对检测对象 的要求小，适用范围广，可应用于各种免疫胶体金检测。
实验结果说明，本发明改性胶体金与抗体形成的金标抗体稳定，不受酸性环境的影响， 采用本发明改性胶体金制备本发明免疫层析试剂盒，在酸性条件下，仍然可以准确定向检 测重金属，可以替代传统原子吸收光谱法，成本低廉，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实 现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明检测试剂盒的试纸的结构和使用示意图。图中：1-塑料底板，2-样品垫， 3-胶体金垫，4-硝酸纤维素膜，5-检测线T和质控线C，6-吸样垫。
图2本发明检测试剂盒的卡壳的结构示意图。图中：7-加样孔，8-观察口。
具体实施方式
实施例1本发明改性胶体金的制备
以氯金酸—柠檬酸三钠还原法制备直径为10～60nm的胶体金溶液，制备完成的胶体 金100mL加入0.1～3mL浓度为1％的二(三乙醇胺)钛酸二异丙酯(TMC-TE)溶液，在 100～400r/min下混合搅拌0.5～2h。用氨水调节溶液pH值至8～10，加入0.1～2mL钛 酸正丁酯，在室温下继续反应24～36小时，在4000～16000r/min条件下离心5～60min， 吸出上清液加入超纯水或缓冲液清洗，重复1～2次，即制备得表面含有活性-OH的钛酸 酯改性的胶体金颗粒(本发明胶体金)。
实施例2本发明金标抗体的制备
取实施例1制备的改性的胶体金颗粒，按每100mL加入0.2～2mgCd单克隆抗体， 反应2h，在6000～12000r/min条件下离心5～60min，去上清液，用复溶液定溶至胶体金 溶液体积的1/20即得金标抗体。
抗体为重金属抗体，例如Cd单克隆抗体、Pb单克隆抗体、Hg单克隆抗体、As单克 隆抗体、Cr单克隆抗或Cu单克隆抗体。
实施例3本发明检测重金属的检测系统及其使用方法
1、检测系统
1.1本发明试剂盒的制备
本发明试剂盒的结构如图1～2所示：它包括检测试纸和卡壳，试纸置于卡壳中；所 述检测试纸包括塑料底板1，一端粘贴上样品垫2，上样品垫的一端紧密压接着含有所检 测重金属相对应抗体所标记的金标制作的胶体金垫3，胶体金垫3一端紧密压接着硝酸纤 维素膜4，硝酸纤维素膜上包被有检测线T和质控线C5，检测线T包被着待检重金属的 完全抗原，质控线C上包被有抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜另一端连接吸样垫6；所述卡 壳表面对应样品垫2的位置设有加样孔7，卡壳表面对应硝酸纤维素膜4的位置设有观察 口8。
其中，胶体金垫的制备：取实施例2制备的金标抗体，按4μl/cm喷在2cm宽玻璃纤 维素膜金标垫上，37℃烘干18～24小时，即得制成金标垫。
其中，所述重金属的全抗原是重金属与络合剂络合后，与载体蛋白相偶联形抗原，其 中，所述络合剂是柠檬酸、乙二胺四乙酸、氨基乙酸、1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺 -N,N,N',N'-四乙酸、二乙烯三胺五羧酸盐、谷胱甘肽和有机多齿配体中的一种或多种；所 述载体蛋白是牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白中的一种或多种。
其中，所涉及试剂盒NC膜为孔径5-12微米的多孔样结构膜，样品垫为玻璃纤维素 膜或聚酯膜，吸样纸为吸水滤纸构成。
其中，NC膜包被过程为：以0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液将金属全抗原配制成0.1～ 3mg/mL的溶液，将抗鼠IgG配制成0.1～3mg/mL的溶液，用划膜仪以1μl/cm速度分别 进行划线包被C、T线，放置在37度烘箱干燥5～16小时。
上述试剂盒的装配应在温度为20～30℃，湿度为<40％的室内进行，取塑料底板，将 已包被的NC膜放置在塑料地板中部粘贴，将金标垫搭在NC膜T线一侧，金标垫搭在 NC膜上1mm粘贴，金标垫另一侧搭接粘贴上样品垫，样品垫与试纸下边缘对齐。在NC 膜一侧搭接吸样纸，搭在NC膜上1mm粘贴。最后使用切条机将贴好的塑料板切成3～ 5mm宽试纸条，再装入塑料卡内，形成试剂盒。
1.2干式恒温仪，购自杭州瑞诚仪器有限公司；
1.3手持式胶体金读数仪，购自深圳拓能达科技有限公司，是一种便携式光学仪器， 体积小于0.001m3，操作简便，可以检测多个项目，具有GPS定位功能，能保存和打印检 测数据。用于对检测结果进行定量判定，对水质检测范围为1～20μg/L,对粮食检测范围 为50～1000μg/kg，对中药材检测范围为100～2000μg/kg。
2、使用方法
1)使用粉碎机粉碎所需检测样品，并过20目筛网。
2)取待检样品，加入2～8倍mL/g的提取剂(根据不同样品吸湿量不同选取不同加 入量)，在震荡频率为2～60cpm条件下反应5～30min，过滤，取上清，加入上清2～40 倍体积的稀释液(不同稀释倍数对应相应标准曲线，保证检测敏灵度一般稀释4倍)，混 匀，得混合液；所述提取剂是浓度为10％的硝酸溶液；所述稀释剂为添加有表面活性剂、 重金属络合剂的缓冲溶液；
3)将权利要求4～7任意一项所述的胶体金免疫层析试剂盒和步骤1)制备的混合液 分别放入干式恒温仪中，恒温2～15min(在大于2min后金属离子基本完全与螯合剂螯合， 考虑样品适应性设定为5min)，温度设定为20～45℃(在此温度范围内系统均能准确测 定重金属，过低或过高都会影响免疫反应，免疫反应最适温度为37℃)；
4)在干式恒温仪中，将步骤1)制备的混合液加入试剂盒的加样孔中，恒温反应5～ 30min(反应检测结果在一定时间范围内保持稳定，以持续保持稳定一定时间为宜即 20min)；
5)将反应后的试剂盒，置于胶体金读数仪中，读取数据即可。
以下用实验例的方式来说明本发明有益效果：
实验例1本发明金标抗体的稳定性试验
分别使用钛酸酯偶联法和40nm胶体金对重金属单镉克隆抗体、铅单克隆抗体、汞单 克隆抗体进行标记处理，同时使用40nm胶体金按传统方法对上述抗体进行标记处理。标 记后胶体金在稳定是其颜色呈暗红色，最大吸收峰在530～532nm之间，OD值变化波动 小，当由于外界原因破坏其稳定性时，胶体金产生聚集，其颜色会先变紫，再变黑，最后 为无色；其最大吸收峰逐渐大于正常峰值；同时其OD值逐渐变小至0。对标记金标进行 如下测试：
1)保存上述金标于4℃冰箱，观察随时间增加，使用紫外分光光度计测定金标吸收 峰和OD值变化。
结果如下表1：
由结果可知，新型胶体金标记方式有效提高了金标保存稳定性。且随着时间增加传统 金标逐渐变紫色聚集。
2)向上述金标中加入不同量10％NaCl溶液，30min后使用紫外测定其吸收峰和OD 值变化。
结果如下表2：
由结果可知，新型胶体金标记方式有效提高了金标对盐的稳定性。
3)向上述金标中加入不同量0.1M盐酸，30min后使用紫外测定其吸收峰和OD值变 化.
结果如下表3：
由结果可知，新型胶体金标记方式有效提高了金标对酸的稳定性。
4)向上述金标中加入不同量1M氢氧化钠，30min后使用紫外测定其吸收峰和OD 值变化。
结果如下表3：
由结果可知，新型胶体金标记方式有效提高了金标对碱的稳定性。
由表1～3可以看出，本发明改性胶体金与抗体的结合非常稳定，不受酸碱环境和离 子强度影响，耐酸、耐碱、耐盐。
实验例2粮食中重金属稀硝酸处理回收率测定
目前粮食中重金属检测需要对样品进行彻底消化消解后进行检测，这种方法耗时长， 操作人员素质要求高，操作复杂，不适应对粮食的快速现场检测要求。因此对样品的快速 简单处理成为实现快速检测的关键，本专利着重研究了稀酸提取处理样品的回收率，并在 此基础上实现对粮食样品的准确检测。
1主要材料
1.1硝酸、硫酸、高氯酸过氧化氢分析纯：西陇化工股份有限责任公司；石墨炉原子 吸收光谱仪：四川省分析测试中心测定；镉标准样品、铅标准样品、汞标准样品、砷标准 样品、铬标准样品、铜标准样品：国家有色金属及电子材料分析测试中心产品；
1.2在各检测机构和市面上收集的分别含有上述一种重金属元素大米、小麦、玉米和 高粱各6份样品；
2.方法
2.1取上述含有一种重金属元素的大米、小麦、玉米、高粱样品各6份使用粉碎机粉 碎，过20目筛网；
2.2分别配制浓度为1％、5％、10％、15％的稀硝酸溶液，按1份粮食4份提取剂量 提取反应30min，4000r/min离心5min，与相应食品中重金属检测国标(食品中镉测定 GB/T5009.15-2003、食品中铅测定GB/T5009.12-2010、食品中汞测定GB/T5009.17-2003、 食品中砷测定GB/T5009.11-2003、食品中铬测定GB/T5009.123-2003、食品中铬测定GB/T 5009.13-2003)的第一法对比测定其回收率。
2.3使用浓度为10％稀酸溶液，分别按1份粮食与2份提取剂，1份粮食与4份提取 剂，1分粮食与6份提取剂，1份粮食与8份提取剂提取反应30min，4000r/min离心5min， 与相应国标第一法对比测定其回收率。
2.4使用浓度为10％稀酸溶液，按1份粮食与4份提取剂，分别采用5min时间提取、 10min时间提取、15min时间提取、20min时间提取、25min时间提取、30min时间提取， 4000r/min离心5min，与相应国标第一法对比测定其回收率。
结果
稀硝酸提取粮食中各重金属元素的最适条件如下表：
相对应最适条件下回收率如下表：
实验例3重金属镉快速定量检测试剂盒制备
1、主要原理
胶体金免疫层析法检测重金属，基于抗原和抗体的特异性识别和反应。由于重金属属 于小分子，须先偶联一定的功能基团后形成半抗原后才能与蛋白结合形成完全抗原，然后 才能进行免疫分析。
检测原理是以硝酸纤维素膜为载体,包被有重金属全抗原(T线),加入待检样品之后, 重金属离子螯合物与胶体金标记单克隆抗体结合，未结合的胶体金标记单克隆抗体与完全 检测抗原(T线)发生特异性结合而被截留，显现的红色条带。而通过仪器测定T线颜色 深浅，并与预置在仪器中的标准曲线进行对比，从而准确判断出金属离子含量。
2、主要材料和仪器
2.1镉(Cd)标准样品：国家有色金属及电子材料分析测试中心产品；Cd特异性单 克隆抗体、Cd全抗原，羊抗鼠IgG：成都安普诺生物科技有限公司产品；氯金酸：Sigma 公司产品；硝酸纤维素膜：MILLIPORE(美国)，M135；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙 二醇2000：Sigma产品；玻璃纤维素膜、吸水垫、底板：上海杰一生物产品；其它常用 试剂均为分析纯试剂。
2.2含有重金属Cd粮食样品在市场上或检测机构获得，共7份，使用国标 GB/T5009.15-2003的第一法测定其含量，其中Cd含量分布区间为0～200μg/kg2份、Cd 含量分布区间为200～400μg/kg3份、Cd含量分布区间为400～1000μg/kg2份。
2.3干式恒温仪购干式恒温仪，购自杭州瑞诚仪器有限公司；手持式胶体金读数仪， 购自深圳拓能达科技有限公司。
3、方法
3.1试剂盒的制备
3.1.1Cd单克隆抗体胶体金标记
以氯金酸—柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成的胶体金 100份加入0.5份浓度为1％的二(三乙醇胺)钛酸二异丙酯(TMC-TE)溶液，在200r/min 下混合搅拌2h。用氨水调节溶液pH值至8.5，加入0.5份钛酸正丁酯，在室温下继续反 应24小时，在12000r/min条件下离心15min，吸出上清液加入超纯水或缓冲液清洗，重 复1次，即制备得表面含有活性-OH的钛酸酯改性的胶体金颗粒。取上述表面含有活性-OH 的钛酸酯改性的胶体金3份，按每100mL加入0.2、0.5、1.0、1.5、2mgCd单克隆抗体， 反应2h。在12000r/min条件下离心15min，去上清液，用复溶液定溶至胶体金溶液体积 的1/20。按4μl/cm喷在2cm宽玻璃纤维素膜金标垫上，37℃烘干18～24小时，即得制 成金标垫。
3.1.2NC膜包被过程为：以0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液将Cd全抗原配制成0.1、0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，将抗鼠IgG配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、 3.0mg/mL的溶液，用划膜仪以1μl/cm速度分别进行划线包被C、T线，放置在37度烘 箱干燥12小时。
3.1.3试剂盒的装配：试剂盒装配在温度为20～30℃，湿度为<40％的室内进行，取塑 料底板，将已包被的NC膜放置在塑料地板中部粘贴，将金标垫搭在NC膜T线一侧，金 标垫搭在NC膜上1mm粘贴，金标垫另一侧搭接粘贴上样品垫，样品垫与试纸下边缘对 齐。在NC膜一侧搭接吸样纸，搭在NC膜上1mm粘贴。最后使用切条机将贴好的塑料 板切成5mm宽试纸条，再装入塑料卡内，形成试剂盒。
3.1.4试纸条工艺参数调试：将浓度不同的标记、包被的试剂进行组合配对，制备成 小样，使用Cd标准样品对试剂进行测试，寻找出最佳组合。
3.2提取剂：为10％的稀硝酸溶液。
3.3稀释液：分别使用0.01M、0.02M、0.04MPBS溶液，加入终浓度分别为0.5％、 1％、1.5、2％的tween-20，加入终浓度为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、 2×10-3g/mL的络合剂ITCBE配置成稀释液。
3.4标准曲线制备、换算和录入：确定好试纸工艺参数后，分别用浓度为0、50、100、 200、400、600、800、1000μg/kg的Cd标准样品对试剂盒进行测定，不同浓度的标准样 品显示出不同的强度T线，使用胶体金读数仪测定其强度。将标准添加样品浓度除以Cd 的回收率69.8％作为测定样品中Cd浓度值；使制作标准曲线，并将相应参数导入读数仪 中，完成仪器曲线参数设置。
3.5检测方法
1)使用粉碎机粉碎所需检测样品，并过20目筛网；
2)使用小型天平准确称量1g检测待检样品到提取瓶中，加入4mL提取剂，室温下 在震荡频率为2～60cpm条件下反应5min；
3)使用离心机或过滤装置过滤，取上清液，用移液器器准确移取40μl清液至160 μl稀释液中混合均匀；
4)取出试剂盒将试剂盒和上述混合液放入干式恒温仪中5min，温度设定为37℃；
5)用移液器取120μl上述混合液加入试剂盒加样孔中，继续在37℃恒温环境下反 应20min；
6)将反应完的试剂盒放入手持式胶体金读数仪中即可显示出样品中Cd的浓度。
3.6对在市场上或检测机构获得7份样品使用重金属镉快速定量检测试剂盒进行检测 并与原子吸收光谱法结果检测对比分析其准确性；配制浓度分别为200ppb、400ppb、 800ppb标准样品溶液使用重金属镉快速定量检测试剂盒并分析检测，每个浓度检测6次 分析其精密度。
4结果
4.1复溶液为20mMPBS含有1％BSA、5％蔗糖、0.1％tween-20；改性胶体金最适标 记量为1mg/100mL；最佳Cd全抗原包被量1.5mg/mL；稀释液最佳条件为0.2MPBS，终 浓度为1％tween-20，1×10-7g/mLEDTA。
4.2准确度检测结果
对本组数据做配对样本T检验法，t＝0.707，t双尾临界(0.05，6)＝2.447，t<t双尾临界(0.05，6)，说 明重金属镉快速定量检测试剂盒检测结果与原子吸收光谱法检测结果无显著结果差异。
4.3精密度检测结果
由结果及分析可知，重金属镉快速定量检测试剂盒重复检测结果变异系数为10.6～ 12.2之间，平均变异系数小于15％。
检测结果表明本发明重金属镉的检测试剂盒以及检测系统性能良好，可以快速、准确 的检测待检样品中镉含量，适用于实验室和取样现场的快速定量检测，满足客户对食品中 重金属镉快速定量检测要求。
实验例4重金属铅快速定量检测试剂盒制备
1、主要材料
1.1铅(Pb)标准样品：国家有色金属及电子材料分析测试中心产品；Pb特异性单克 隆抗体、Pb全抗原，羊抗鼠IgG：成都安普诺生物科技有限公司产品；氯金酸：Sigma 公司产品；硝酸纤维素膜：MILLIPORE(美国)，M135；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙 二醇2000：Sigma产品；玻璃纤维素膜、吸水垫、底板：上海杰一生物产品；其它常用 试剂均为分析纯试剂。
1.2含有重金属Pb粮食样品在市场上或检测机构获得，共6份，使用国标 GB/T5009.12-2010的第一法测定其含量，其中Pb含量分布区间为0～200μg/kg2份Pb 含量分布区间为200～400μg/kg2份、Pb含量分布区间为400～1000μg/kg2份。
1.3干式恒温仪购干式恒温仪，购自杭州瑞诚仪器有限公司；手持式胶体金读数仪， 购自深圳拓能达科技有限公司。
2、方法
2.1试剂盒的制备
2.1.1Pb单克隆抗体胶体金标记：
以氯金酸—柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成的胶体金 100份加入0.5份浓度为1％的二(三乙醇胺)钛酸二异丙酯(TMC-TE)溶液，在200r/min 下混合搅拌2h。用氨水调节溶液pH值至8.5，加入0.5份钛酸正丁酯，在室温下继续反 应24小时，在12000r/min条件下离心15min，吸出上清液加入超纯水或缓冲液清洗，重 复1次，即制备得表面含有活性-OH的钛酸酯改性的胶体金颗粒。取上述表面含有活性-OH 的钛酸酯改性的胶体金3份，按每100mL加入0.2、0.5、1.0、1.5、2mgPb单克隆抗体， 反应2h。在12000r/min条件下离心15min，去上清液，用复溶液定溶至胶体金溶液体积 的1/20。按4μl/cm喷在2cm宽玻璃纤维素膜金标垫上，37℃烘干18～24小时，即得制 成金标垫。
2.1.2NC膜包被过程为：以0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液将Pb全抗原配制成0.1、0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，将抗鼠IgG配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、 3.0mg/mL的溶液，用划膜仪以1μl/cm速度分别进行划线包被C、T线，放置在37度烘 箱干燥12小时。
2.1.3试剂盒的装配：试剂盒装配在温度为20～30℃，湿度为<40％的室内进行，取塑 料底板，将已包被的NC膜放置在塑料地板中部粘贴，将金标垫搭在NC膜T线一侧，金 标垫搭在NC膜上1mm粘贴，金标垫另一侧搭接粘贴上样品垫，样品垫与试纸下边缘对 齐。在NC膜一侧搭接吸样纸，搭在NC膜上1mm粘贴。最后使用切条机将贴好的塑料 板切成5mm宽试纸条，再装入塑料卡内，形成试剂盒。
2.1.4试纸条工艺参数调试：将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备成小 样，使用Pb标准样品对试剂进行测试，寻找出最佳组合。
2.2提取剂：为10％的稀硝酸溶液。
2.3稀释液：分别使用0.01M、0.02M、0.04MPBS溶液，加入终浓度分别为0.5％、 1％、1.5、2％的tween-20，加入终浓度为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、 2×10-3g/mL的络合剂ITCBE配置成稀释液。
2.4标准曲线制备、换算和录入：确定好试纸工艺参数后，分别用浓度为0、50、100、 200、400、600、800、1000μg/kg的Pb标准样品对试剂盒进行测定，不同浓度的标准样 品显示出不同的强度T线，使用胶体金读数仪测定其强度。将标准添加样品浓度除以Pb 的回收率58.6％作为测定样品中Pb浓度值；使用做特殊软件制作标准曲线，并将相应参 数导入读数仪中，完成仪器曲线参数设置。
2.5检测方法
1)使用粉碎机粉碎所需检测样品，并过20目筛网；
2)使用小型天平准确称量1g检测待检样品到提取瓶中，加入4mL提取剂，室温下 在震荡频率为2～60cpm条件下反应10min；
3)使用离心机或过滤装置过滤取清液，用移液器器准确移取40μl清液至160μl稀 释液中混合均匀；
4)取出试剂盒将试剂盒和上述混合液放入干式恒温仪中5min，温度设定为37℃；
5)用移液器取120μl上述混合液加入试剂盒加样孔中，继续在37℃恒温环境下反 应20min；
6)将反应完的试剂盒放入手持式胶体金读数仪中即可显示出样品中Pb的浓度。
2.6对在市场上或检测机构获得6份样品使用重金属铅快速定量检测试剂盒进行检测 并与原子吸收光谱法结果检测对比分析其准确性；配制浓度分别为200ppb、400ppb、 800ppb标准样品溶液使用重金属铅快速定量检测试剂盒并分析检测，每个浓度检测6次 分析其精密度。
3、结果
3.1最适标记量为1.5mg/100mL；复溶液为20mMPBS含有1％BSA、5％蔗糖、0.1％ tween-20；改性胶体金最适标记量为1.5mg/100mL；最佳Pb全抗原包被量1.0mg/mL；稀 释液最佳条件为0.2MPBS，终浓度为1％tween-20，1×10-6g/mLITCBE；以上工艺不同 批次可能需要适当调整工艺。
3.2准确度检测结果
对本组数据做配对样本T检验法，t＝0.018，t双尾临界(0.05，5)＝2.571，t<t双尾临界(0.05，5)，说 明重金属铅快速定量检测试剂盒检测结果与原子吸收光谱法检测结果无显著结果差异。
3.3精密度检测结果
由结果及分析可知，重金属铅快速定量检测试剂盒重复检测结果变异系数为12.3～ 12.8之间，平均变异系数小于15％。
检测结果表明本发明重金属铅的检测试剂盒以及检测系统性能良好，可以快速、准确 的检测待检样品中铅含量，适用于实验室和取样现场的快速定量检测，满足客户对食品中 重金属铅快速定量检测要求。
实验例5重金属汞快速定量检测试剂盒制备
1、主要材料
1.1汞(Hg)标准样品：国家有色金属及电子材料分析测试中心产品；Hg特异性单 克隆抗体、Hg全抗原，羊抗鼠IgG：成都安普诺生物科技有限公司产品；氯金酸：Sigma 公司产品；硝酸纤维素膜：MILLIPORE(美国)，M135；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙 二醇2000：Sigma产品；玻璃纤维素膜、吸水垫、底板：上海杰一生物产品；其它常用 试剂均为分析纯试剂。
1.2含有重金属Hg粮食样品在市场上或检测机构获得，共5份，使用国标 GB/T5009.17-2003的第一法测定其含量，其中Hg含量分布区间为0～200μg/kg2份Hg 含量分布区间为200～400μg/kg2份、Hg含量分布区间为400～1000μg/kg1份。
1.3干式恒温仪购干式恒温仪，购自杭州瑞诚仪器有限公司；手持式胶体金读数仪， 购自深圳拓能达科技有限公司。
2、方法
2.1试剂盒的制备
2.1.1Hg单克隆抗体胶体金标记
以氯金酸—柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成的胶体金 100份加入0.5份浓度为1％的二(三乙醇胺)钛酸二异丙酯(TMC-TE)溶液，在200r/min 下混合搅拌2h。用氨水调节溶液pH值至8.5，加入0.5份钛酸正丁酯，在室温下继续反 应24小时，在12000r/min条件下离心15min，吸出上清液加入超纯水或缓冲液清洗，重 复1次，即制备得表面含有活性-OH的钛酸酯改性的胶体金颗粒。取上述表面含有活性-OH 的钛酸酯改性的胶体金3份，按每100mL加入0.2、0.5、1.0、1.5、2mgHg单克隆抗体， 反应2h。在12000r/min条件下离心15min，去上清液，用复溶液定溶至胶体金溶液体积 的1/20。按4μl/cm喷在2cm宽玻璃纤维素膜金标垫上，37℃烘干18～24小时，即得制 成金标垫。
2.1.2NC膜包被过程为：以0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液将Hg全抗原配制成0.1、0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，将抗鼠IgG配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、 3.0mg/mL的溶液，用划膜仪以1μl/cm速度分别进行划线包被C、T线，放置在37度烘 箱干燥12小时。
2.1.3试剂盒的装配：试剂盒装配在温度为20～30℃，湿度为<40％的室内进行，取塑 料底板，将已包被的NC膜放置在塑料地板中部粘贴，将金标垫搭在NC膜T线一侧，金 标垫搭在NC膜上1mm粘贴，金标垫另一侧搭接粘贴上样品垫，样品垫与试纸下边缘对 齐。在NC膜一侧搭接吸样纸，搭在NC膜上1mm粘贴。最后使用切条机将贴好的塑料 板切成5mm宽试纸条，再装入塑料卡内，形成试剂盒。
2.1.4试纸条工艺参数调试：将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备成小 样，使用Hg标准样品对试剂进行测试，寻找出最佳组合。
2.2提取剂：为10％的稀硝酸溶液。
2.3分别使用0.01M、0.02M、0.04MPBS溶液，加入终浓度分别为0.5％、1％、1.5、 2％的tween-20，加入终浓度为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、2×10-3g/mL 的络合剂ITCBE配置成稀释液。
2.4标准曲线制备、换算和录入：确定好试纸工艺参数后，分别用浓度为0、50、100、 200、400、600、800、1000μg/kg的Hg标准样品对试剂盒进行测定，不同浓度的标准样 品显示出不同的强度T线，使用胶体金读数仪测定其强度。将标准添加样品浓度除以Hg 的回收率56.6％作为测定样品中Hg浓度值；使用做特殊软件制作标准曲线，并将相应参 数导入读数仪中，完成仪器曲线参数设置。
2.5检测方法
1)使用粉碎机粉碎所需检测样品，并过20目筛网；
2)使用小型天平准确称量1g检测待检样品到提取瓶中，加入4mL提取剂，室温下 在震荡频率为2～60cpm条件下反应5min；
3)使用离心机或过滤装置过滤取清液，用移液器器准确移取40μl清液至160μl稀 释液中混合均匀；
4)取出试剂盒将试剂盒和上述混合液放入干式恒温仪中5min，温度设定为37℃；
5)用移液器取120μl上述混合液加入试剂盒加样孔中，继续在37℃恒温环境下反 应20min；
6)将反应完的试剂盒放入手持式胶体金读数仪中即可显示出样品中Hg的浓度。
2.6对在市场上或检测机构获得5份样品使用重金属汞快速定量检测试剂盒进行检测 并与原子吸收光谱法结果检测对比分析其准确性；配制浓度分别为200ppb、400ppb、 800ppb标准样品溶液使用重金属汞快速定量检测试剂盒并分析检测，每个浓度检测6次 分析其精密度。
3、结果
3.1最适标记量为1.5mg/100mL；复溶液为20mMPBS含有1％BSA、5％蔗糖、0.1％ tween-20；改性胶体金最适标记量为1.5mg/100mL；最佳Hg全抗原包被量1.0mg/mL；稀 释液最佳条件为0.2MPBS，终浓度为1.5％tween-20，1×10-7g/mLITCBE；以上工艺不 同批次可能需要适当调整工艺。
3.2准确度检测结果
对本组数据做配对样本T检验法，t＝0.018，t双尾临界(0.05，4)＝2.776，t<t双尾临界(0.05，4)，说 明重金属汞快速定量检测试剂盒检测结果与原子吸收光谱法检测结果无显著结果差异。
3.3精密度检测结果
由结果及分析可知，重金属汞快速定量检测试剂盒重复检测结果变异系数为7.7～ 14.1之间，平均变异系数小于15％。
检测结果表明本发明重金属汞的检测试剂盒以及检测系统性能良好，可以快速、准确 的检测待检样品中汞含量，适用于实验室和取样现场的快速定量检测，满足客户对食品中 重金属汞快速定量检测要求。
实施例6重金属砷快速定量检测试剂盒制备
1、主要材料
1.1砷(As)标准样品：国家有色金属及电子材料分析测试中心产品；As特异性单克 隆抗体、As全抗原，羊抗鼠IgG：成都安普诺生物科技有限公司产品；氯金酸：Sigma 公司产品；硝酸纤维素膜：MILLIPORE(美国)，M135；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙 二醇2000：Sigma产品；玻璃纤维素膜、吸水垫、底板：上海杰一生物产品；其它常用 试剂均为分析纯试剂。
1.2含有重金属As粮食样品在市场上或检测机构获得，共6份，使用国标 GB/T5009.11-2003的第一法测定其含量，其中As含量分布区间为0～200μg/kg2份As 含量分布区间为200～400μg/kg3份、As含量分布区间为400～1000μg/kg1份。
1.3干式恒温仪购干式恒温仪，购自杭州瑞诚仪器有限公司；手持式胶体金读数仪， 购自深圳拓能达科技有限公司。
2、方法
2.1试剂盒的制备
2.1.1As单克隆抗体胶体金标记
以氯金酸—柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成的胶体金 100份加入0.5份浓度为1％的二(三乙醇胺)钛酸二异丙酯(TMC-TE)溶液，在200r/min 下混合搅拌2h。用氨水调节溶液pH值至8.5，加入0.5份钛酸正丁酯，在室温下继续反 应24小时，在12000r/min条件下离心15min，吸出上清液加入超纯水或缓冲液清洗，重 复1次，即制备得表面含有活性-OH的钛酸酯改性的胶体金颗粒。取上述表面含有活性-OH 的钛酸酯改性的胶体金3份，按每100mL加入0.2、0.5、1.0、1.5、2mgAs单克隆抗体， 反应2h。在12000r/min条件下离心15min，去上清液，用复溶液定溶至胶体金溶液体积 的1/20。按4μl/cm喷在2cm宽玻璃纤维素膜金标垫上，37℃烘干18～24小时，即得制 成金标垫。
2.1.2NC膜包被过程为：以0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液将As全抗原配制成0.1、0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，将抗鼠IgG配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、 3.0mg/mL的溶液，用划膜仪以1μl/cm速度分别进行划线包被C、T线，放置在37度烘 箱干燥12小时。
2.1.3试剂盒的装配：试剂盒装配在温度为20～30℃，湿度为<40％的室内进行，取塑 料底板，将已包被的NC膜放置在塑料地板中部粘贴，将金标垫搭在NC膜T线一侧，金 标垫搭在NC膜上1mm粘贴，金标垫另一侧搭接粘贴上样品垫，样品垫与试纸下边缘对 齐。在NC膜一侧搭接吸样纸，搭在NC膜上1mm粘贴。最后使用切条机将贴好的塑料 板切成5mm宽试纸条，再装入塑料卡内，形成试剂盒。
2.1.4试纸条工艺参数调试：将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备成小 样，使用As标准样品对试剂进行测试，寻找出最佳组合。
2.2提取剂：为10％的稀硝酸溶液。
2.3稀释液：分别使用0.01M、0.02M、0.04MPBS溶液，加入终浓度分别为0.5％、 1％、1.5、2％的tween-20，加入终浓度为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、 2×10-3g/mL的络合剂ITCBE配置成稀释液。
2.4标准曲线制备、换算和录入：确定好试纸工艺参数后，分别用浓度为0、50、100、 200、400、600、800、1000μg/kg的As标准样品对试剂盒进行测定，不同浓度的标准样 品显示出不同的强度T线，使用胶体金读数仪测定其强度。将标准添加样品浓度除以As 的回收率55.6％作为测定样品中As浓度值；使用做特殊软件制作标准曲线，并将相应参 数导入读数仪中，完成仪器曲线参数设置。
2.5检测方法
1)使用粉碎机粉碎所需检测样品，并过20目筛网；
2)使用小型天平准确称量1g检测待检样品到提取瓶中，加入4mL提取剂，室温下 在震荡频率为2～60cpm条件下反应10min；
3)使用离心机或过滤装置过滤取清液，用移液器器准确移取40μl清液至160μl稀 释液中混合均匀；
4)取出试剂盒将试剂盒和上述混合液放入干式恒温仪中5min，稳定设定为37℃；
5)用移液器取120μl上述混合液加入试剂盒加样孔中，继续在37℃恒温环境下反 应20min；
6)将反应完的试剂盒放入手持式胶体金读数仪中即可显示出样品中As的浓度。
2.6对在市场上或检测机构获得6份样品使用重金属砷快速定量检测试剂盒进行检测 并与原子吸收光谱法结果检测对比分析其准确性；配制浓度分别为200ppb、400ppb、 800ppb标准样品溶液使用重金属砷快速定量检测试剂盒并分析检测，每个浓度检测6次 分析其精密度。
3、结果
3.1传统的方法胶体金标记pH值为8.5；最适标记量为1.0mg/100mL；复溶液为20mM PBS含有1％BSA、5％蔗糖、0.1％tween-20；改性胶体金最适标记量为1.0mg/100mL；最 佳As全抗原包被量1.0mg/mL；稀释液最佳条件为0.2MPBS，终浓度为1.5％tween-20， 1×10-5g/mLITCBE；以上工艺不同批次可能需要适当调整工艺。
3.2准确度检测结果
对本组数据做配对样本T检验法，t＝0.255，t双尾临界(0.05，5)＝2.571，t<t双尾临界(0.05，5)，说 明重金属砷快速定量检测试剂盒检测结果与原子吸收光谱法检测结果无显著结果差异。
3.3精密度检测结果
由结果及分析可知，重金属砷快速定量检测试剂盒重复检测结果变异系数为13.8～ 14.4之间，平均变异系数小于15％
检测结果表明本发明重金属砷的检测试剂盒以及检测系统性能良好，可以快速、准确 的检测待检样品中砷含量，适用于实验室和取样现场的快速定量检测，满足客户对食品中 重金属砷快速定量检测要求。
实施例7重金属铬快速定量检测试剂盒制备
1、主要材料
1.1铬(Cr)标准样品：国家有色金属及电子材料分析测试中心产品；Cr特异性单克 隆抗体、Cr全抗原，羊抗鼠IgG：成都安普诺生物科技有限公司产品；氯金酸：Sigma 公司产品；硝酸纤维素膜：MILLIPORE(美国)，M135；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙 二醇2000：Sigma产品；玻璃纤维素膜、吸水垫、底板：上海杰一生物产品；其它常用 试剂均为分析纯试剂。
1.2含有重金属Cr粮食样品在市场上或检测机构获得，共5份，使用国标 GB/T5009.123-2003的第一法测定其含量，其中Cr含量分布区间为0～200μg/kg3份Cr 含量分布区间为200～400μg/kg1份、Cr含量分布区间为400～1000μg/kg1份。
1.3干式恒温仪购干式恒温仪，购自杭州瑞诚仪器有限公司；手持式胶体金读数仪， 购自深圳拓能达科技有限公司。
2、方法
2.1试剂盒的制备
2.1.1Cr单克隆抗体胶体金标记
以氯金酸—柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成的胶体金 100份加入0.5份浓度为1％的二(三乙醇胺)钛酸二异丙酯(TMC-TE)溶液，在200r/min 下混合搅拌2h。用氨水调节溶液pH值至8.5，加入0.5份钛酸正丁酯，在室温下继续反 应24小时，在12000r/min条件下离心15min，吸出上清液加入超纯水或缓冲液清洗，重 复1次，即制备得表面含有活性-OH的钛酸酯改性的胶体金颗粒。取上述表面含有活性-OH 的钛酸酯改性的胶体金3份，按每100mL加入0.2、0.5、1.0、1.5、2mgCr单克隆抗体， 反应2h。在12000r/min条件下离心15min，去上清液，用复溶液定溶至胶体金溶液体积 的1/20。按4μL/cm喷在2cm宽玻璃纤维素膜金标垫上，37℃烘干18～24小时，即得制 成金标垫。
2.1.2NC膜包被过程为：以0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液将Cr全抗原配制成0.1、0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，将抗鼠IgG配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、 3.0mg/mL的溶液，用划膜仪以1μL/cm速度分别进行划线包被C、T线，放置在37度烘 箱干燥12小时。
2.1.3试剂盒的装配：试剂盒装配在温度为20～30℃，湿度为<40％的室内进行，取塑 料底板，将已包被的NC膜放置在塑料地板中部粘贴，将金标垫搭在NC膜T线一侧，金 标垫搭在NC膜上1mm粘贴，金标垫另一侧搭接粘贴上样品垫，样品垫与试纸下边缘对 齐。在NC膜一侧搭接吸样纸，搭在NC膜上1mm粘贴。最后使用切条机将贴好的塑料 板切成5mm宽试纸条，再装入塑料卡内，形成试剂盒。
2.1.4试纸条工艺参数调试：将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备成小 样，使用Cr标准样品对试剂进行测试，寻找出最佳组合。
2.2提取剂：为10％的稀硝酸溶液。
2.3分别使用0.01M、0.02M、0.04MPBS溶液，加入终浓度分别为0.5％、1％、1.5、 2％的tween-20，加入终浓度为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、2×10-3g/mL 的络合剂ITCBE配置成稀释液。
2.4标准曲线制备、换算和录入：确定好试纸工艺参数后，分别用浓度为0、50、100、 200、400、600、800、1000μg/kg的Cr标准样品对试剂盒进行测定，不同浓度的标准样 品显示出不同的强度T线，使用胶体金读数仪测定其强度。将标准添加样品浓度除以Cr 的回收率69％作为测定样品中Cr浓度值；使用做特殊软件制作标准曲线，并将相应参数 导入读数仪中，完成仪器曲线参数设置。
2.5检测方法
1)使用粉碎机粉碎所需检测样品，并过20目筛网；
2)使用小型天平准确称量1g检测待检样品到提取瓶中，加入4mL提取剂，室温下 在震荡频率为2～60cpm条件下反应5min；
3)使用离心机或过滤装置过滤取清液，用移液器器准确移取40μl清液至160μl稀 释液中混合均匀；
4)取出试剂盒将试剂盒和上述混合液放入干式恒温仪中5min，稳定设定为37℃；
5)用移液器取120μl上述混合液加入试剂盒加样孔中，继续在37℃恒温环境下反 应20min；
6)将反应完的试剂盒放入手持式胶体金读数仪中即可显示出样品中Cr的浓度。
2.6对在市场上或检测机构获得6份样品使用重金属铬快速定量检测试剂盒进行检测 并与原子吸收光谱法结果检测对比分析其准确性；配制浓度分别为200ppb、400ppb、 800ppb标准样品溶液使用重金属铬快速定量检测试剂盒并分析检测，每个浓度检测6次 分析其精密度。
3、结果
3.1传统的方法胶体金标记pH值为8.5；最适标记量为1.0mg/100mL；复溶液为20mM PBS含有1％BSA、5％蔗糖、0.1％tween-20；改性胶体金最适标记量为1.0mg/100mL；最 佳Cr全抗原包被量0.5mg/mL；稀释液最佳条件为0.2MPBS，终浓度为1％tween-20， 1×10-6g/mLITCBE；以上工艺不同批次可能需要适当调整工艺。
3.2准确度检测结果
对本组数据做配对样本T检验法，t＝0.649，t双尾临界(0.05，4)＝2.776，t<t双尾临界(0.05，4)，说 明重金属铬快速定量检测试剂盒检测结果与原子吸收光谱法检测结果无显著结果差异。
3.3精密度检测结果
由结果及分析可知，重金属铬快速定量检测试剂盒重复检测结果变异系数为10.9～ 14.1之间，平均变异系数小于15％
检测结果表明本发明重金属铬的检测试剂盒以及检测系统性能良好，可以快速、准确 的检测待检样品中铬含量，适用于实验室和取样现场的快速定量检测，满足客户对食品中 重金铬镉快速定量检测要求。
实施例8重金属铜快速定量检测试剂盒制备
1、主要材料
1.1铜(Cu)标准样品：国家有色金属及电子材料分析测试中心产品；Cu特异性单 克隆抗体、Cu全抗原，羊抗鼠IgG：成都安普诺生物科技有限公司产品；氯金酸：Sigma 公司产品；硝酸纤维素膜：MILLIPORE(美国)，M135；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙 二醇2000：Sigma产品；玻璃纤维素膜、吸水垫、底板：上海杰一生物产品；其它常用 试剂均为分析纯试剂。
1.2含有重金属Cu粮食样品在市场上或检测机构获得，共7份，使用国标 GB/T5009.13-2003的第一法测定其含量，其中Cu含量分布区间为0～200μg/kg3份Cu 含量分布区间为200～400μg/kg3份、Cu含量分布区间为400～1000μg/kg1份。
1.3干式恒温仪购干式恒温仪，购自杭州瑞诚仪器有限公司；手持式胶体金读数仪， 购自深圳拓能达科技有限公司。
2、方法
2.1试剂盒的制备
2.1.1Cu单克隆抗体胶体金标记
以氯金酸—柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成的胶体金 100份加入0.5份浓度为1％的二(三乙醇胺)钛酸二异丙酯(TMC-TE)溶液，在200r/min 下混合搅拌2h。用氨水调节溶液pH值至8.5，加入0.5份钛酸正丁酯，在室温下继续反 应24小时，在12000r/min条件下离心15min，吸出上清液加入超纯水或缓冲液清洗，重 复1次，即制备得表面含有活性-OH的钛酸酯改性的胶体金颗粒。取上述表面含有活性-OH 的钛酸酯改性的胶体金3份，按每100mL加入0.2、0.5、1.0、1.5、2mgCu单克隆抗体， 反应2h。在12000r/min条件下离心15min，去上清液，用复溶液定溶至胶体金溶液体积 的1/20。按4μl/cm喷在2cm宽玻璃纤维素膜金标垫上，37℃烘干18～24小时，即得制 成金标垫。
2.1.2NC膜包被过程为：以0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液将Cu全抗原配制成0.1、0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，将抗鼠IgG配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、 3.0mg/mL的溶液，用划膜仪以1μl/cm速度分别进行划线包被C、T线，放置在37度烘 箱干燥12小时。
2.1.3试剂盒的装配：试剂盒装配在温度为20～30℃，湿度为<40％的室内进行，取塑 料底板，将已包被的NC膜放置在塑料地板中部粘贴，将金标垫搭在NC膜T线一侧，金 标垫搭在NC膜上1mm粘贴，金标垫另一侧搭接粘贴上样品垫，样品垫与试纸下边缘对 齐。在NC膜一侧搭接吸样纸，搭在NC膜上1mm粘贴。最后使用切条机将贴好的塑料 板切成5mm宽试纸条，再装入塑料卡内，形成试剂盒。
2.1.4试纸条工艺参数调试：将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备成小 样，使用Cu标准样品对试剂进行测试，寻找出最佳组合。
2.2提取剂：为10％的稀硝酸溶液。
2.3分别使用0.01M、0.02M、0.04MPBS溶液，加入终浓度分别为0.5％、1％、1.5、 2％的tween-20，加入终浓度为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、2×10-3g/mL 的络合剂ITCBE配置成稀释液。
2.4标准曲线制备、换算和录入：确定好试纸工艺参数后，分别用浓度为0、50、100、 200、400、600、800、1000μg/kg的Cu标准样品对试剂盒进行测定，不同浓度的标准样 品显示出不同的强度T线，使用胶体金读数仪测定其强度。将标准添加样品浓度除以Cu 的回收率53.5％作为测定样品中Cu浓度值；使用做特殊软件制作标准曲线，并将相应参 数导入读数仪中，完成仪器曲线参数设置。
2.5检测方法
1)使用粉碎机粉碎所需检测样品，并过20目筛网；
2)使用小型天平准确称量1g检测待检样品到提取瓶中，加入4mL提取剂，室温下 在震荡频率为2～60cpm条件下反应5min；
3)使用离心机或过滤装置过滤取清液，用移液器器准确移取40μl清液至160μl稀 释液中混合均匀；
4)取出试剂盒将试剂盒和上述混合液放入干式恒温仪中5min，稳定设定为37℃；
5)用移液器取120μl上述混合液加入试剂盒加样孔中，继续在37℃恒温环境下反 应20min；
6)将反应完的试剂盒放入手持式胶体金读数仪中即可显示出样品中Cu的浓度。
2.6对在市场上或检测机构获得6份样品使用重金属铜快速定量检测试剂盒进行检测 并与原子吸收光谱法结果检测对比分析其准确性；配制浓度分别为200ppb、400ppb、 800ppb标准样品溶液使用重金属铜快速定量检测试剂盒并分析检测，每个浓度检测6次 分析其精密度。
3、结果
3.1传统的方法胶体金标记pH值为8.5；最适标记量为1.0mg/100mL；复溶液为20mM PBS含有1％BSA、5％蔗糖、0.1％tween-20；改性胶体金最适标记量为1.0mg/100mL；最 佳Cu全抗原包被量0.5mg/mL；稀释液最佳条件为0.2MPBS，终浓度为1％tween-20， 1×10-5g/mLITCBE；以上工艺不同批次可能需要适当调整工艺。
3.2准确度检测结果
对本组数据做配对样本T检验法，t＝0.514，t双尾临界(0.05，6)＝2.447，t<t双尾临界(0.05，6)，说 明重金属铜快速定量检测试剂盒检测结果与原子吸收光谱法检测结果无显著结果差异。
3.3精密度检测结果
由结果及分析可知，重金属铜快速定量检测试剂盒重复检测结果变异系数为11.2～ 14.2之间，平均变异系数小于15％
检测结果表明本发明重金属铜的检测试剂盒以及检测系统性能良好，可以快速、准确 的检测待检样品中铜含量，适用于实验室和取样现场的快速定量检测，满足客户对食品中 重金属铜快速定量检测要求。
机译： 糖基转移酶工程，多核苷酸工程，载体，宿主细胞，产生至少一种糖基转移酶的方法，工程化生产至少一种蔗糖合酶的实施方案，工程化生产莱鲍迪甙F，莱鲍迪甙和/或莱鲍迪甙IE莱鲍迪甙底物的糖基化，成分，糖化合成酶工程化，重金属苷M，重金属苷A，重金属苷I，E，重金属苷D.
机译： 可视化定量检测重金属离子的新方法
机译： 可视化定量检测重金属离子的新方法
