脓毒症多种致病因子的吸附材料及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种脓毒症的多种致病因子的吸附材料及制备方法和用途。该吸附材料由具有良好机械性能及血液相容性的载体和具有吸附多种病原体相关分子能力的配基偶联而成，能够有效地从血液等流体中吸附细菌内毒素、细菌基因组DNA、肽聚糖、磷壁酸、病毒RNA以及酵母多糖，特别在脓毒症的血液净化治疗中具有重要应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种脓毒症的多种致病因子的吸附材 料及其制备方法和在制备脓毒症血液净化治疗装置中的用途。

背景技术

脓毒症是由感染因素介导的全身炎症反应综合征(systemicinflammatory responsesyndrome，SIRS)，全球每年发病人数高达1900万，是当前感染患者死 亡的主要因素，至今没有理想的治疗手段。研究显示，细菌、病毒、真菌等病 原体释放的病原体相关分子(pathogen-associatedmolecularpattern，PAMP)是诱 发脓毒症的主要致病因子，目前已知的病原体相关分子主要包括来自细菌的内 毒素(脂多糖)、细菌基因组DNA、肽聚糖、磷壁酸，来自病毒的病毒RNA以 及来自真菌的酵母多糖等。为此，研究人员开发了许多拮抗剂，如多粘菌素B、 类脂A单克隆抗体、杀菌/通透性增加蛋白、抑制性寡核苷酸等，主要针对的是 细菌内毒素和细菌基因组DNA，且大多处于临床前或临床研究中，尚未应用于 临床。除了药物治疗以外，血液净化治疗也被认为是治疗脓毒症的有效手段。 所谓血液净化治疗，是指将患者血液引出体外，通过专门的净化装置除去血中 致病因子，净化血液，达到治疗疾病的目的。血液净化治疗装置通常由泵、循 环血路、血液净化以及相关控制部分等组成。其中，具有吸附致病因子作用的 吸附材料是血液净化治疗装置最核心的组成部分。

脓毒症的血液净化治疗即是利用具有吸附病原体相关分子作用的吸附材料 吸附和除去患者血中的病原体相关分子。目前，日本研究人员已开发出内毒素 吸附材料Toraymyxin，它由聚苯乙烯纤维类载体和共价结合在载体上的多粘菌 素B组成，已在日本(1994年)和欧洲(2002年)上市，并正在美国开展III 期临床试验。这种吸附材料能够有效吸附内毒素，并具有良好的生物相容性， 适用于脓毒症的血液净化治疗(HisatakaShoji.Extracorporealendotoxinremoval forthetreatmentofsepsis：endotoxinadsorptioncartridge(Toraymyxin).TherApher Dial.2003；7(1)：108-114.)。再比如，专利号ZL03144383.4的发明专利公开了一 种以天然或合成高分子材料为载体，二甲基胺为配体制成的内毒素吸附材料， 可用于血液灌流去除患者血中内毒素。专利号ZL03144231.5的发明专利公开了 一种以球形琼脂糖凝胶为载体，固定有效量的亲和配基的吸附材料，可通过血 液灌流高效吸附患者血中内毒素。专利号ZL200710012501.1的发明专利公开了 一种以琼脂糖凝胶为载体，通过间隔臂分子偶联季铵盐阳离子和疏水分子两种 基团的吸附材料，可用于清除血浆中的内毒素。发明专利CN101322933B和 CN101322934B均公开了一种以球形多孔纤维素为载体，固载多粘菌素B得到 的内毒素吸附材料。发明专利CN102247817B公开了一种以分子簇为功能基的 内毒素吸附材料及其制备方法。国际申请号PCT/AT2010/000017的发明专利公 开了一种由不溶于水的多孔载体以及固定在该载体上的多粘菌素B组成的内毒 素吸附材料。国际申请号PCT/AT2011/000273的发明专利公开了一种由不溶于 水的多孔载体以及通过非共价方式与载体表面结合的多粘菌素B和白蛋白组成 的内毒素吸附材料。发明专利CN103769060A公开了一种以琼脂糖凝胶、聚乙 烯醇、纤维素或聚苯乙烯为载体，偶联苦柯胺B的吸附剂，可吸附内毒素、细 菌基因组DNA和肽聚糖。但是，上述吸附材料只能吸附内毒素等少数病原体相 关分子，对其他病原体相关分子无效，故对由其他病原体相关分子诱发的脓毒 症难以发挥疗效。因此，开发具有更为广谱和更强的吸附能力的吸附材料十分 重要。

发明内容

本发明的目的是针对现有吸附材料在吸附能力上的不足，提供一种脓毒症 的多种致病因子吸附材料，该吸附材料可有效地从血液等流体中吸附其中的脓 毒症的多种致病因子，如细菌内毒素、细菌基因组DNA、肽聚糖、磷壁酸、病 毒RNA和酵母多糖，通过清除这些病原体相关分子从而治疗脓毒症。

本发明的技术方案是：

吸附流体中多种脓毒症致病因子的吸附材料的配基的制备方法，有以下步 骤：

1)在二氯甲烷中，化合物1与二碳酸二叔丁酯反应生成化合物2，反应温 度为20～30℃，化合物1与二碳酸二叔丁酯的当量比为1∶0.5～2，反应方程式 为：

2)在甲醇氨饱和溶液中，化合物2在雷尼镍和氢气存在下，经氢化还原生 成化合物3，反应温度为20～50℃，压力为1～10MPa，雷尼镍的质量为化合 物2质量的10％～50％，反应方程式为：

3)在乙醇或甲醇中，化合物3与α，β-不饱和腈反应生成化合物4，反应温 度为20～50℃，化合物3与α，β-不饱和腈的当量比为1∶2～3，反应方程式为：

4)在二氯甲烷中，化合物5与N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺和4- 二甲氨基吡啶的存在下反应生成化合物6，反应温度为20～30℃，化合物5与 N-羟基琥珀酰亚胺的当量比为1∶1～2，反应方程式为：

5)在二氧六环中，化合物4与化合物6反应生成化合物7，反应温度为30～ 50℃，化合物4与化合物6的当量比为1∶1～2，反应方程式为：

6)在二氧六环中，化合物7与N-苄基琥珀酰亚胺碳酸酯反应生成化合物8， 反应温度为30～50℃，化合物7与N-苄基琥珀酰亚胺碳酸酯的当量比为1∶1～2， 反应方程式为：

7)在乙醇或甲醇中，化合物8与二碳酸二叔丁酯在雷尼镍和氢气存在下反 应生成化合物9，反应温度为30～50℃，化合物8与二碳酸二叔丁酯的当量比 为1∶0.5～3，压力为1～10MPa，雷尼镍的质量为化合物8质量的10％～50％， 反应方程式为：

8)在甲醇中，化合物9在钯碳和氢气存在下反应生成化合物10，反应温度 为20～50℃，压力为常压至10MPa，钯碳的质量为化合物9质量的10％～30％， 反应方程式为：

9)在二氯甲烷中，化合物10与丁二酸酐在4-二甲氨基吡啶存在下反应生成 化合物11，反应温度为20～30℃，化合物10与丁二酸酐的当量比为1∶1～2， 反应方程式为：

10)在乙酸乙酯中，化合物11与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成化合物12，反 应温度为20～30℃，化合物11与N-羟基琥珀酰亚胺的当量比为1∶1～2，反应 方程式为：

上述脓毒症的多种致病因子包括细菌内毒素、细菌基因组DNA、肽聚糖、 磷壁酸、病毒ssRNA、病毒RNA和/或酵母多糖等多病原体相关分子。

上述流体包括人体血液或血浆或药物注射液或液体生物试剂。

脓毒症的多种致病因子的吸附材料，由配基与载体偶联组成，其分子结构 示意如下

所述载体是氨基化琼脂糖或氨基化聚苯乙烯树脂。

脓毒症的多种致病因子吸附材料的制备方法，有以下步骤：

1)在四氢呋喃或四氢呋喃水溶液或乙醇水溶液中，化合物12与载体M反 应生成化合物13，化合物12与载体M的质量比为0.01～1∶100，反应方程式为：

2)载体残余氨基的封闭：

在N，N-二异丙基乙胺中，向化合物13加入醋酐，反应得到载体残余氨基封 闭的粗产物，化合物13与醋酐的当量比为1∶1～2，反应方程式为：

3)终产物的制备：

在甲醇中，在冰浴下向粗产物中加入浓度为2～6M的盐酸甲醇溶液，反应 得到终产物MTAM，粗产物与盐酸甲醇溶液的体积比为1∶0.5～1.5，反应方程式 为：

本发明所述脓毒症的多种致病因子吸附材料在用于制备脓毒症血液净化治 疗装置中的用途，具体是用于制备净化治疗装置中的吸附柱。

申请人的实验研究显示：

(1)配基通过共价偶联有效地连接在载体上；

(2)吸附材料对血浆中的细菌内毒素、细菌基因组DNA、肽聚糖、磷壁酸、 病毒RNA和酵母多糖具有显著的吸附作用。

病原体相关分子是导致脓毒症的主要致病因子，无论是通过药物还是血液 净化治疗从患者体内清除这些分子对治愈脓毒症十分重要。本发明将一种新颖 的具有多病原体相关分子吸附作用的配基偶联在相应载体上，载体可以是琼脂 糖或者聚苯乙烯树脂，此类载体在临床上广泛应用，已证实具有良好的血液相 容性。本发明材料应用于血液净化治疗装置中，可有效地吸附血中细菌内毒素、 细菌基因组DNA、肽聚糖、磷壁酸、病毒RNA和酵母多糖，在脓毒症血液净 化治疗方面具有重要应用前景。同时，本领域技术人员能够理解，根据本发明 材料的使用原理，本发明除用于医学治疗以外，也可用于从诸如药品、生物试 剂等溶液中去除细菌内毒素、细菌基因组DNA、肽聚糖、磷壁酸、病毒RNA 和酵母多糖。

附图说明

图1为吸附材料的分子结构示意图；

图2为吸附材料对水中细菌内毒素的静态吸附检测结果；

图3为吸附材料对血浆中细菌内毒素的静态吸附检测结果；

图4为吸附材料对血浆中细菌内毒素的动态吸附检测结果；

图5为吸附材料对血浆中细菌内毒素、细菌基因组DNA、肽聚糖、磷壁酸、 病毒ssRNA、病毒dsRNA以及酵母多糖的静态吸附检测结果，其中，5A是吸 附材料对细菌内毒素的吸附能力测试结果，5B是吸附材料对细菌基因组DNA 的吸附能力测试结果，5C是吸附材料对肽聚糖的吸附能力测试结果，5D是吸附 材料对磷壁酸的吸附能力测试结果，5E是吸附材料对病毒ssRNA的吸附能力测 试结果，5F是吸附材料对病毒dsRNA的吸附能力测试结果，5G是吸附材料对 酵母多糖的吸附能力测试结果；

图6为吸附材料对血浆中细菌内毒素、细菌基因组DNA、肽聚糖、磷壁酸、 病毒ssRNA、病毒dsRNA以及酵母多糖的动态吸附检测结果。其中，6A是吸 附材料对细菌内毒素的吸附能力测试结果，其中，6B是吸附材料对细菌基因组 DNA的吸附能力测试结果，6C是吸附材料对肽聚糖的吸附能力测试结果，6D 是吸附材料对磷壁酸的吸附能力测试结果，6E是吸附材料对病毒ssRNA的吸附 能力测试结果，6F是吸附材料对病毒dsRNA的吸附能力测试结果，6G是吸附 材料对酵母多糖的吸附能力测试结果；

图7为吸附材料对细菌裂解液(多种病原体相关分子混合物)的静态吸附检 测结果；其中，7A是吸附材料对大肠埃希菌裂解液的吸附能力测试结果，7B 是吸附材料对金黄色葡萄球菌裂解液的吸附能力测试结果；

图8为吸附材料对细菌裂解液(多种病原体相关分子混合物)的动态吸附检 测结果。其中，8A是吸附材料对大肠埃希菌裂解液的吸附能力测试结果，8B 是吸附材料对金黄色葡萄球菌裂解液的吸附能力测试结果。

具体实施方式

以下实施例仅是对本发明进行详细说明的优选方案，其不以任何形式限制本 发明。

实施例中使用的化学试剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司。实验用LPS、 LTA和酵母多糖购于Sigma-Aldrich公司，CpGDNA购于生工生物工程(上海) 股份有限公司，PGN和病毒RNA购于Invivogen公司。其它试剂若未经特别说 明，均采用市售的分析纯试剂。实施例中英文缩写均具有以下所述中文含义：

英文缩写 中文含义 英文缩写 中文含义 DCM 二氯甲烷 SoCl₂氯化亚砜 Boc₂O 二碳酸二叔丁酯 Et₃N 三乙胺 MeOH/NH₃甲醇氨饱和溶液 THF 四氢呋喃 RaneyNi 雷尼镍 H₂O 水 H₂氢气 Pd/C 钯碳 MPa 兆帕 K₂CO₃碳酸钾

EtOH 乙醇 BnCl 氯化苄 DMF N，N-二甲基甲酰胺 NaOH 氢氧化钠 LPS 脂多糖 CpG DNA 细菌基因组DNA PGN 肽聚糖 LTA 磷壁酸 ssRNA 单链RNA dsRNA 双链RNA

实施例1：配基1的制备

1.1实验方法：

在室温下将6g双(2-氰基乙基)胺(化合物1)溶于60mL二氯甲烷，滴加含 有等当量二碳酸二叔丁酯的二氯甲烷溶液，反应10小时，旋干溶剂，加水和乙 酸乙酯萃取3次，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得化合物2。将11g化合物2溶 于400mL饱和甲醇氨溶液，加入1g雷尼镍，充入4MPa氢气，室温反应72 小时，过滤，旋干溶剂得化合物3。将5.2g化合物3溶于40mL乙醇，在冰浴 下滴加浓度15M的丙烯腈乙醇溶液，40℃反应10小时，旋干溶剂得化合物4。 将4.2g3，4-二甲氧基苯丙酸(化合物5)溶于二氯甲烷，加入2.3gN-羟基琥珀 酰亚胺，2.8g二环己基碳二亚胺和0.5g4-二甲氨基吡啶，室温反应12小时， 过滤，旋干溶剂得化合物6。将2g化合物4溶于15mL二氧六环，加入1.76g 化合物6，50℃反应24小时，得化合物7，然后加入1.48gN-苄基琥珀酰亚胺 碳酸酯，继续反应20小时，加水和乙酸乙酯萃取3次，无水硫酸钠干燥，旋干 溶剂得化合物8。将1g化合物8溶于乙醇，加入1g二碳酸二叔丁酯和0.1g雷 尼镍，充入2MPa氢气，45℃反应48小时，过滤，旋干溶剂得化合物9。将0.44 g化合物9溶于5mL甲醇，加入45mg钯碳，充入氢气，30℃反应48小时， 过滤，旋干溶剂得化合物10。将0.4g化合物10溶于二氯甲烷，加入12mg4- 二甲氨基吡啶，80mg丁二酸酐，25℃反应48小时，旋干溶剂得化合物11，然 后加入5mL乙酸乙酯溶解，加入93mgN-羟基琥珀酰亚胺，25℃反应72小时， 旋干溶剂得化合物12(配基1)。

1.2实验结果：得到配基1，质谱检测显示：[M+Na]⁺m/z＝957.5；核磁共振 氢谱检测显示：6.80-7.54(m，3H)，3.86(s，3H)，3.85(s，3H)，3.40(brs，2H)， 3.34-3.28(m，3H)，3.23-3.21(m，2H)，3.15(brs，5H)，3.09-2.97(m，5H)，2.93-2.89 (m，2H)，2.82(brs，4H)，2.74-2.64(m，3H)，2.59-2.57(m，2H)，1.90(s，2H)，1.81-1.75 (m，5H)，1.65-1.63(m，3H)，1.44-1.41(m，27H)，确证化学结构为

实施例2：配基2的制备

2.1实验方法：采用实施例1所述制备方法，反应在相同规模和条件下进行， 不同的是将3，4-二甲氧基苯丙酸(化合物5)替换为3-苯丙酸。

2.2实验结果：得到配基2，质谱检测显示：[M+Na]⁺m/z＝897.5，确证化学 结构为

实施例3：配基3的制备

3.1实验方法：采用实施例1所述制备方法，反应在相同规模和条件下进行， 不同的是将丙烯腈替换为3-丁烯腈。

3.2实验结果：得到配基3，质谱检测显示：[M+Na]⁺m/z＝985.5，确证化学 结构为

实施例4：配基4的制备

4.1实验方法：采用实施例1所述制备方法，反应在相同规模和条件下进行， 不同的是将3，4-二甲氧基苯丙酸(化合物5)替换为3，4-二甲氧基苯甲酸。

4.2实验结果：得到配基4，质谱检测显示：[M+Na]⁺m/z＝929.5，确证化学 结构为

实施例5：配基5的制备

5.1实验方法：采用实施例1所述制备方法，反应在相同规模和条件下进行， 不同的是将双(2-氰基乙基)胺(化合物1)替换为亚氨基二乙腈。

5.2实验结果：得到配基5，质谱检测显示：[M+Na]⁺m/z＝929.5，确证化学 结构为

实施例6：以琼脂糖为载体的脓毒症的多种致病因子吸附材料(MTAM01S) 的制备

6.1实验方法：

将5mL氨基化的氨基化琼脂糖凝胶(购于北京韦氏博慧色谱科技有限公司) 分散于2mL四氢呋喃，然后将2mg配基1溶于少量四氢呋喃并滴加于该溶液 中，室温反应48小时，过滤，水洗，得化合物13。向化合物13中加入0.5mL 浓度为10mM的N，N-二异丙基乙胺，然后加入0.8mL醋酐，室温反应8小时， 过滤，得到氨基封闭的粗产物。将粗产物溶于3mL甲醇，在冰浴下滴加入2mL 浓度为6的盐酸甲醇溶液，室温反应约2小时，过滤，水洗，得到终产物 MTAM01S。

1.2实验结果：得到吸附材料MTAM01S，保存于浓度为20％的乙醇溶液中， 结构如图1所示，其中载体部分为琼脂糖凝胶。

实施例7：以聚苯乙烯树脂为载体的多病原体相关分子吸附材料 (MTAM01P)的制备

7.1实验方法：采用实施例6所述的制备方法，反应在相同规模和条件下进 行，不同的是将氨基化琼脂糖凝胶替换为氨甲基化聚(苯乙烯-co-二乙烯基苯)(购 于Sigma-Aldrich)。

7.2实验结果：得到吸附材料MTAM01P，保存于浓度为20％的乙醇溶液中， 结构如图1所示，其中载体部分为聚苯乙烯树脂。

实施例8：MTAM01S和MTAM01P对水中细菌内毒素(LPS)的静态吸附 能力检测

8.1实验方法：取0.5ml内毒素(1μg/ml)分别与0.5ml琼脂糖树脂(S载 体)、聚苯乙烯树脂(P载体)、MTAM01S或MTAM01P等体积混合，37℃振 荡反应1小时。离心取上清定量检测内毒素水平。检测方法参照中国药典(二 部)附录XIE细菌内毒素检查法和文献“卫国，郑江.细菌内毒素定量检测的影响 因素分析及对策.局解手术学杂志，2003，12：215-216.”。实验结果以实测内毒素值 并折算为吸附率表示。

8.2实验结果：琼脂糖和聚苯乙烯树脂对水中内毒素的吸附率仅为8.31％和 8.39％，表明载体本身几乎不具有吸附能力。MTAM01S和MTAM01P对内毒素 具有良好的吸附活性，吸附率分别达到93.83％和89.41％，结果如图2所示。

实施例9：MTAM01S和MTAM01P对血浆中细菌内毒素(LPS)的静态吸 附能力检测

9.1实验方法：取0.5ml人血浆溶解的内毒素(1μg/ml)分别与0.5ml琼脂 糖树脂(S载体)、聚苯乙烯树脂(P载体)、MTAM01S或MTAM01P等体积混 合，37℃振荡反应1小时。离心取上清定量检测内毒素水平，检测方法同实施 例8。实验结果以内毒素实测值并折算为吸附率表示。

9.2实验结果：琼脂糖和聚苯乙烯树脂对血浆中内毒素的吸附率仅为7.61％ 和8.20％，表明载体本身几乎不具有吸附能力。MTAM01S和MTAM01P对血浆 中内毒素具有良好的吸附活性，吸附率可分别达到92.67％和88.10％，结果如图 3所示。

实施例10：MTAM01S和MTAM01P对血浆中细菌内毒素(LPS)的动态吸 附能力检测

10.1实验方法：取10ml琼脂糖树脂(S载体)、聚苯乙烯树脂(P载体)、 MTAM01S和MTAM01P分别装入直径3厘米，高度15厘米的层析柱中，取10 ml人血浆溶解的内毒素(1μg/ml)上样，将滤出液重复上样8次，检测每一次 滤出液中的内毒素水平。检测方法同实施例8。实验结果以内毒素实测值并折算 为最终的吸附率表示。

10.2实验结果：琼脂糖和聚苯乙烯树脂几乎不具有吸附内毒素，而 MTAM01S和MTAM01P对内毒素具有良好的吸附作用，且与吸附次数成正比， 最终吸附率达到92.83％和85.90％，结果如图4所示。

实施例11：MTAM01S和MTAM01P对血浆中细菌内毒素(LPS)、细菌基 因组DNA(CpGDNA)、肽聚糖(PGN)、磷壁酸(LTA)、病毒ssRNA、病毒 dsRNA以及酵母多糖(Zymosan)的静态吸附能力检测

11.1实验方法：取0.5ml溶解于人血浆中的内毒素(1μg/ml)、细菌基因组 DNA(10μg/ml)、肽聚糖(10μg/ml)、磷壁酸(10μg/ml)、病毒ssRNA(10μg/ml)、 病毒dsRNA(10μg/ml)和酵母多糖(10μg/ml)，分别与0.5ml琼脂糖树脂(S 载体)、聚苯乙烯树脂(P载体)、MTAM01S或MTAM01P等体积混合，37℃ 振荡反应1小时。离心取上清20μl加入体外培养的小鼠巨噬细胞株RAW264.7 细胞(1×10⁶/ml)中，共同孵育12小时，检测吸附前后含病原体相关分子的血 浆对炎症反应细胞的刺激作用。具体检测方法按eBioscience公司小鼠ELISA试 剂盒操作说明书进行，主要步骤包括：①将RAW264.7细胞培养液上清加入预 包被有捕获抗体的96孔板中，室温孵育2小时，PBS洗涤5次；②加入生物素 标记的一抗，室温孵育1小时，PBS洗涤5次；③加入亲和素标记的辣根过氧 化物酶，室温孵育半小时，PBS洗涤5次；④加入显色液，37℃孵育10分钟， 加入终止液；⑤酶标仪450nm波长测定光密度值。实验结果以对炎症反应细胞 释放TNF-α的抑制率反映吸附材料对病原体相关分子的吸附能力。

11.2实验结果：琼脂糖和聚苯乙烯树脂处理任一病原体相关分子均无吸附 作用，表现为对处理前后的血浆刺激RAW264.7细胞释放TNF-α无抑制作用。 而MTAM01S和MTAM01P处理后的血浆对炎症反应细胞的刺激作用显著降低， 表明经MTAM01S和MTAM01P吸附处理后，血浆中病原体相关分子水平大大 降低。结果如图5所示，其中，图5A是MTAM01S和MTAM01P对细菌内毒素 (LPS)的吸附能力测试结果，图5B是MTAM01S和MTAM01P对细菌基因组 DNA(CpGDNA)的吸附能力测试结果，图5C是MTAM01S和MTAM01P对 肽聚糖(PGN)的吸附能力测试结果，图5D是MTAM01S和MTAM01P对磷壁 酸(LTA)的吸附能力测试结果，图5E是MTAM01S和MTAM01P对病毒ssRNA 的吸附能力测试结果，图5F是MTAM01S和MTAM01P对病毒dsRNA的吸附 能力测试结果，图5G是MTAM01S和MTAM01P对酵母多糖(Zymosan)的吸 附能力测试结果。

实施例12：MTAM01S和MTAM01P对血浆中细菌内毒素(LPS)、细菌基 因组DNA(CpGDNA)、肽聚糖(PGN)、磷壁酸(LTA)、病毒ssRNA、病毒 dsRNA以及酵母多糖(Zymosan)的动态吸附能力检测

12.1实验方法：取10ml琼脂糖树脂(S载体)、聚苯乙烯树脂(P载体)、 MTAM01S和MTAM01P分别装入直径3厘米，高度15厘米的层析柱中，取10 ml人血浆溶解的内毒素(1μg/ml)、细菌基因组DNA(10μg/ml)、肽聚糖(10 μg/ml)、磷壁酸(10μg/ml)、病毒ssRNA(10μg/ml)、病毒dsRNA(10μg/ml) 和酵母多糖(10μg/ml)上样，将滤出液重复上样5次，第1、3和5次滤出液 各取20μl加入RAW264.7细胞，按实施例11所述方法检测吸附前后含病原体 相关分子的血浆对炎症反应细胞的刺激作用。

12.2实验结果：琼脂糖和聚苯乙烯树脂对任一病原体相关分子均不具有吸 附作用，MTAM01S和MTAM01P则能够明显吸附各种病原体相关分子，表现 为吸附后的血浆对炎症反应细胞的刺激活性显著降低(TNF-α释放显著减少)， 表明经MTAM01S和MTAM01P吸附处理后，血浆中病原体相关分子水平大大 降低，结果如图6所示，其中，图6A是MTAM01S和MTAM01P对细菌内毒素 (LPS)的吸附能力测试结果，图6B是MTAM01S和MTAM01P对细菌基因组 DNA(CpGDNA)的吸附能力测试结果，图6C是MTAM01S和MTAM01P对 肽聚糖(PGN)的吸附能力测试结果，图6D是MTAM01S和MTAM01P对磷壁 酸(LTA)的吸附能力测试结果，图6E是MTAM01S和MTAM01P对病毒ssRNA 的吸附能力测试结果，图6F是MTAM01S和MTAM01P对病毒dsRNA的吸附 能力测试结果，图6G是MTAM01S和MTAM01P对酵母多糖(Zymosan)的吸 附能力测试结果。

实施例13：MTAM01S和MTAM01P对细菌裂解液(多种病原体相关分子 混合物)的静态吸附能力测试

13.1实验方法：取培养的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌液，分别按体积 比2∶1加入裂解缓冲液(50mMTrispH8.0，10％甘氨酸，0.1％triton-X100， 100ug/ml溶菌酶，1mMPMSF)，超声(3次，每次20秒)破碎细胞膜，使用人 血浆稀释超声后的细菌裂解产物，按细菌计数换算浓度分别为1×10⁸CFU/ml (大肠埃希菌)和5×10⁸CFU/ml(金黄色葡萄球菌)。裂解产物分别与0.5ml 琼脂糖树脂(S载体)、聚苯乙烯树脂(P载体)、MTAM01S或MTAM01P等体 积混合，37℃振荡反应1小时。离心取上清20μl加入体外培养的小鼠巨噬细 胞株RAW264.7细胞(1×10⁶/ml)中，共同孵育12小时，检测吸附前后血浆对 炎症反应细胞的刺激作用，检测方法同实施例11。

13.2实验结果：琼脂糖和聚苯乙烯树脂自身对各类细菌病原体相关分子均 不具有吸附作用，MTAM01S和MTAM01P对来源于大肠埃希菌(革兰阴性菌) 和金黄色葡萄球菌(革兰阳性菌)的病原体相关分子混合物都具有良好的吸附 活性，表现为经MTAM01S和MTAM01P吸附后的细菌裂解液对炎症反应细胞 的刺激活性显著降低(TNF-α释放显著减少)，结果如图7示，其中，图7A是 MTAM01S和MTAM01P对大肠埃希菌裂解液的吸附能力测试结果，图7B是 MTAM01S和MTAM01P对金黄色葡萄球菌裂解液的吸附能力测试结果。

实施例14：MTAM01S和MTAM01P对细菌裂解液(多种病原体相关分子 混合物)的动态吸附能力测试

14.1实验方法：取10ml琼脂糖树脂(S载体)、聚苯乙烯树脂(P载体)、 MTAM01S和MTAM01P分别装入直径3厘米，高度15厘米的层析柱中。按实 施例10的方法制备大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌裂解液。取10ml人血浆稀释 的细菌裂解液上样，将滤出液重复上样5次，第1、3和5次滤出液各取20μl加 入RAW264.7细胞，按实施例11所述方法检测吸附前后细菌裂解液对炎症反应 细胞的刺激作用。

14.2实验结果：琼脂糖和聚苯乙烯树脂自身对各类细菌病原体相关分子均 不具有吸附作用，MTAM01S和MTAM01P能够吸附来源于大肠埃希菌(革兰 阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰阳性菌)的病原体相关分子混合物，表现为 经MTAM01S和MTAM01P吸附后的细菌裂解液对炎症反应细胞的刺激活性显 著降低(TNF-α释放显著减少)，结果如图8所示，其中，图8A是MTAM01S 和MTAM01P对大肠埃希菌裂解液的吸附能力测试结果，图8B是MTAM01S 和MTAM01P对金黄色葡萄球菌裂解液的吸附能力测试结果。

实施例15：基于配基2～5的吸附材料的制备

15.1实验方法：采用实施例6所述的制备方法，反应在相同规模和条件下 进行，不同的是将配基1换成配基2或配基3或配基4或配基5，并且配基2～ 5分别与氨基化琼脂糖凝胶或氨基化聚苯乙烯树脂偶联。

15.2实验结果：得到以琼脂糖凝胶为载体、配基2为配基的吸附材料 MTAM02S；琼脂糖凝胶为载体、配基3为配基的吸附材料MTAM03S；琼脂糖 凝胶为载体、配基4为配基的吸附材料MTAM04S；琼脂糖凝胶为载体、配基5 为配基的吸附材料MTAM05S；以聚苯乙烯树脂为载体、配基2为配基的吸附材 料MTAM02P；聚苯乙烯树脂为载体、配基3为配基的吸附材料MTAM03P；聚 苯乙烯树脂为载体、配基4为配基的吸附材料MTAM04P；聚苯乙烯树脂为载体、 配基5为配基的吸附材料MTAM05P。

实施例16：MTAM02～05S以及MTAM02～05P对血浆中细菌内毒素 (LPS)、细菌基因组DNA(CpGDNA)、肽聚糖(PGN)、磷壁酸(LTA)、病 毒ssRNA、病毒dsRNA以及酵母多糖(Zymosan)的动态吸附能力检测

16.1实验方法：采用实施例12所述的检测方法，实验在相同规模和条件下 进行，不同的是将吸附材料MTAM01S和MTAM01P分别换成MTAM02～05S 和MTAM02～05P。

16.2实验结果：MTAM02～05S和MTAM02～05P也能够明显吸附各种病 原体相关分子，表现为吸附后的血浆对炎症反应细胞的刺激活性显著降低 (TNF-α释放显著减少)。以经过5次滤过吸附处理后，对病原体相关分子刺激 炎症反应细胞释放TNF-α的抑制率来表示吸附材料对病原体相关分子的吸附能 力，结果如表1所示。

表1MTAM02～05S和MTAM02～05P的吸附能力检测

上述实验显示，本发明的吸附材料对血浆等流体中的细菌内毒素、细菌基 因组DNA、肽聚糖、磷壁酸、病毒RNA和酵母多糖均具有显著的吸附作用， 经吸附处理后的血浆对免疫细胞的刺激作用受到显著抑制，适用于脓毒症患者 的血液净化。