萘茜衍生物在制备结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶抑制剂以及抗结核药物中的应用

摘要

本发明涉及药物化学领域，具体公开了萘茜衍生物在制备结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶抑制剂以及抗结核药物中的应用。所述的萘茜衍生物具有通式(Ⅰ)所示的结构，

说明书

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体地说，涉及萘茜衍生物在制备结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶抑制剂以及抗结核药物中的应用。

背景技术

结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。全世界每三个人就有一个人感染了结核分枝杆菌。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是结核病的病原体，存活力很强，当患者打喷嚏、咳嗽甚至交谈时均可通过空气传播。病原菌可侵入全身各种器官，但主要经呼吸道，感染宿主肺脏，称为“肺结核病”，感染后，结核菌结节呈干酪样坏死，形成空洞，临床上症状主要为：慢性低热、乏力等全身症状，咳嗽、咯血等呼吸系统表现。

结核分枝杆菌自身可以分泌出酪氨酸磷酸酶PTPs，其中目前的研究主要集中在酪氨酸磷酸酶A(MptpA)和酪氨酸磷酸酶B(MptpB)以及其人的同源蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)。由结核分枝杆菌分泌的酪氨酸磷酸酶(MptpB)是结合分枝杆菌的重要毒力因子，是造成肺结核的重要原因。酪氨酸磷酸酶被结核分枝杆菌分泌后进入巨噬细胞细胞质中，调节结核分枝杆菌在宿主中的存活，使得干扰素-γ活跃的部分在巨噬细胞中，活力大大的下降，抵抗宿主的免疫系统[Biochem,J,(2007)406,13–18]。MptpB与人PTPB的同源性只有6％，所以MptpB作为药物设计靶标是十分值得深入研究。

蒽醌类化合物时分布最广泛的醌类化合物之一，蒽醌类化合物常见于高等植物茜草科、鼠李科、百合科、玄参科等科属中，也广泛存在于动物及其内生真菌，海洋内生真菌次级代谢产物中。蒽醌类化合物具有广泛的抗癌、抗真菌、抗细菌等生物活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种萘茜衍生物的新用途，萘茜衍生物在制备结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶抑制剂以及抗结核药物的应用。

本发明经过大量实验，发现萘茜衍生物能用于制备结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶抑制剂，能用于防治结核病。

上述萘茜衍生物是指申请号为201410359129.1，公开号为CN104744226的中国发明专利所记载的。

萘茜衍生物的通式如(Ⅰ)，

其中，

R₁选自H、O、C₁～C₅烷基或无基团；

R₂选自H、O、C₁～C₅烷基或无基团；

R₃选自羟基、C₁～C₅烷氧基、C₁～C₅烷基、SCN基或卤素；

R₄选自羟基、C₁～C₅烷氧基、C₁～C₅烷基、SCN基或卤素；

当R₁选自O时或R₂选自O时，R₁和R₂为同一基团，在连接R₃的碳原子与连接R₄的碳原子之间形成环氧基；

当R₁选自无基团时或R₂选自无基团时，R₁和R₂同时为无基团，在连接R₃的碳原子与连接R₄的碳原子之间形成双键。

具体实施方式

以下结合实施实施例进一步解释本发明，但实施实施例并不对本发明做任何形式的限定。

本发明实施实施例中标号对应的萘茜衍生物的结构如下式所示：

实施例1：萘茜衍生物的制备

化合物4a的合成：在25mL圆底烧瓶中加入200mg(1.05mmol,1equiv)萘茜，异戊二烯(5.25mmol，5equiv)，8mL冰醋酸，80℃油浴下回流反应20h，冷却，减压蒸馏除去溶剂，粗产品溶解在5mlNaOH(2M)溶液中，室温搅拌20min，冰水浴下调节pH至6-7，立即抽虑得滤饼。粗产物进行硅胶柱色谱分离，用乙酸乙酯：石油醚1：80(v/v)洗脱剂洗脱，得到4a。产率:84.5％；红色固体；mp:104.2-105.6℃；IR(KBr):ν_max＝3385,1610cm^-1.¹HNMR(400MHz,cdcl3)δ12.52(s,2H),7.23(d,J＝27.5Hz,2H),5.55(s,1H),3.23(s,2H),3.12(d,J＝7.4Hz,2H),1.81(s,3H).ESI-MSm/z255.64[M-H]^-

化合物5a和5d的合成：在10mL圆底烧瓶中加入0.2mmol化合物4，间氯过氧苯甲酸(0.32mmol，1.6equiv)，2mL氯仿，室温下反应0.5-1h，减压蒸馏除去溶剂，粗产物进行硅胶柱色谱分离，得到5。

5a产率:92.3％；棕红色固体；mp:153.4-154.1℃；IR(KBr):ν_max＝3396,1603cm^-1；¹HNMR(400MHz,cdcl₃)δ12.52(s,2H),7.21(s,2H),3.93(s,1H),3.15(d,J＝18.4Hz,1H),2.95(d,J＝18.2Hz,1H),2.67-2.51(m,2H),1.35(s,3H)；ESI-MSm/z271.73[M-H]^-.

5d产率:81.2％；红色固体；mp:126.8-127.3℃；IR(KBr):ν_max＝3425.7,1612.5cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ12.41(d,J＝1.4Hz,2H),6.99(s,2H),3.84(s,2H),3.55(s,2H),2.04(d,J＝9.3Hz,1H),1.62(d,J＝9.3Hz,1H)；¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ182.19,159.73,137.32,128.51,112.10,56.32,42.13,29.70；HRMS(EI)m/z(M+H)⁺calcdforC₁₆H₁₄O₅270.0523,found270.0526.

化合物6a,6b,6c的合成：向25ml烧瓶中加入0.2mmol化合物5，NaHSO₄(1mmol,5equiv),3mlCH₂Cl₂,常温搅拌6h，加蒸馏水1ml，继续反应0.5h。用二氯甲烷萃取，干燥，减压蒸馏除去溶剂，粗产物进行硅胶柱色谱分离，得到6a-6c。

6a1,4,6,7-四羟基-6-甲基-5,6,7,8-四氢蒽-9,10-二酮。产率:76.03％；红色固体；mp:169.5-170.0℃；IR(KBr):ν_max＝3401,1610cm^-1；¹HNMR(400MHz,cdcl₃)δ12.61(s,2H),7.22(s,2H),4.22(t,J＝5.8Hz,2H),3.16(d,J＝16.9Hz,1H),2.95(d,J＝18.9Hz,1H),2.67(t,J＝17.3Hz,2H),1.60(s,3H)；ESIMSm/z289.35[M-H]^-.

6b1,4,6,7-四羟基-6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蒽-9,10-二酮。产率:57.5％；红色固体；mp:182.6-183.5℃；IR(KBr):ν_max＝3414.1601cm^-1；¹HNMR(400MHz,dmso)δ12.42(s,2H),7.33(s,2H),4.64(s,2H),2.50(s,4H),1.23(s,6H)；¹³CNMR(101MHz,dmso)δ186.54,157.28,143.79,129.42,111.31,70.32,35.23,22.81；HRMS(ESI-iontrap)m/z[M–H]^-calcdforC₁₆H₁₅O₆303.0874,found303.0872.

6c1,4,6,7-四羟基-5,6,7,8-四氢蒽-9,10-二酮.产率:52.5％；红色固体；mp:206.3-207.8℃；IR(KBr):ν_max＝3450，1605cm^-1；¹HNMR(400MHz,dmso)δ12.37(s,2H),7.33(s,2H),5.09(s,2H),3.81(s,2H),2.72(d,J＝18.4Hz,2H)；¹³CNMR(101MHz,cdcl₃)δ185.75,158.87,140.41,128.43,111.50,50.32,23.44；HRMS(ESI)m/z[M–H]^-calcdforC₁₄H₁₁O₆275.0561,found275.0559.

化合物3d,4d的合成：在25mL圆底烧瓶中加入200mg(1.05mmol)萘茜，环戊二烯(3.15mmol，3equiv)，8mL冰醋酸，18℃左右反应12h，冷却，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离得到(3d)。粗产品也可直接氧化，将其溶解在5mlNaOH(2M)溶液中，室温搅拌20min，冰水浴下调节pH至6-7，立即抽滤得滤饼。粗产物进行硅胶柱色谱纯化(洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：60，v/v)，得化合物(4d)。

3d产率:85.6％；青黄色固体；mp:120.1-120.9℃；IR(KBr):ν_max＝3450.5，1635.8cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ12.65(s,2H),7.21(s,2H),6.06(s,2H),3.69(s,2H),3.42(s,2H),1.59(d,J＝9.1Hz,1H),1.53(d,J＝8.8Hz,1H)；ESI-MSm/z255.45[M-H]^-.

4d产率:88.5％；红色固体；mp:92.1-92.6℃；IR(KBr):ν_max＝3435.5,1562.8cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ12.55(s,2H),7.01(s,2H),6.90(s,2H),4.33(s,2H),2.40(d,J＝7.2Hz,1H),2.33(d,J＝7.2Hz,1H)；ESI-MSm/z253.05[M-H]^-.

化合物7b的合成：向10ml烧瓶中加入0.2mmol化合物5，HFB₄-SiO₂₄(0.02mmol,0.1equiv),KSCN(0.4mmol，2equiv),常温搅拌24h，用二氯甲烷溶解，过滤，减压蒸馏除去溶剂，粗产物进行硅胶柱色谱分离，得到7b。

7b1,4,6-三羟基-6,7-二甲基-7-硫氰基-5,6,7,8-四氢蒽-9,10-二酮；产率:42.6％；红色固体；mp:163.4-163.8℃；IR(KBr):ν_max＝3477.6,1635.6cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ12.48(s,2H),7.23(s,2H),3.20(d,J＝6.5Hz,2H),2.93(s,2H),1.77(s,3H),1.55(s,3H),1.25(s,1H).¹³CNMR(101MHz,DMSO)δ192.09,185.16,157.52,142.67,140.95,129.58,111.65,70.73,60.43,35.78,35.29,24.00,22.98；HRMS(ESI-iontrap)m/z[M–H]^-calcdforC₁₇H₁₄O₅NS344.0598,found344.0595.

化合物8aa和8ab的合成：向10ml烧瓶中加入0.2mmol化合物(5)，CeCl₃·7H₂O(0.1mmol,0.5equiv)，2mlCH₃CN，常温搅拌12h，水洗，用氯仿萃取，干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂，粗产物进行硅胶柱色谱分离，得到目标物(8)。

8aa产率：42.6％；红色固体；mp:173.9-174.6℃；IR(KBr):ν_max＝3529.7,1610.5cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ12.50(s,1H),12.48(s,1H),7.21(s,2H),4.17(t,J＝5.0Hz,1H),3.35(ddt,J＝19.9,4.8,2.3Hz,1H),3.16–3.08(m,1H),3.05–2.97(m,1H),2.79(d,J＝19.7Hz,1H),1.25(s,3H)；¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ185.31,185.13,159.40,142.61,141.28,135.42,130.01,120.75,111.59,70.78,61.10,34.10,30.93,29.85,25.49；ESI-MSm/z307.25[M-H]^-.

8ab产率：38.5％；红色固体；mp:173.9-174.6℃；IR(KBr):νmax＝3529.7,1610.5cm-1；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ12.50(s,1H),12.48(s,1H),7.21(s,2H),4.17(t,J＝5.0Hz,1H),3.35(ddt,J＝19.9,4.8,2.3Hz,1H),3.16–3.08(m,1H),3.05–2.97(m,1H),2.79(d,J＝19.7Hz,1H),1.25(s,3H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ185.31,185.13,159.40,142.61,141.28,135.42,130.01,120.75,111.59,70.78,61.10,34.10,30.93,29.85,25.49；HRMS(EI)m/z(M+H)+calcdforC14H10O5Cl308.0446,found308.0444.

化合物9b的合成：向25ml烧瓶中加入0.2mmol化合物5，NaBr(2.0mmol,10equiv),8MLCH₃CN。30mg对甲苯磺酸溶于2ml乙腈溶液中，常温搅拌下将其慢慢滴加到反应瓶中，耗时10分钟。常温搅拌12h。水洗，氯仿萃取，干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂，粗产物进行硅胶柱色谱分离，得到9b。

9b6-溴-1,4,7-三羟基-6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蒽-9,10-二酮，产率:42.6％；红色固体；mp:127.2-127.9℃；IR(KBr):ν_max＝3500.2,1610.8cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ12.49(d,J＝4.8Hz,2H),7.19(s,2H),3.38(s,1H),3.30–3.22(m,1H),3.18–3.10(m,1H),2.90(d,J＝20.0Hz,1H),1.93(s,3H),1.61(s,3H)；¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ185.64,185.20,159.19,159.17,142.53,142.47,129.89,129.85,111.68,111.60,72.96,67.04,38.77,36.75,27.19,25.14.ESI-MSm/z365.35[M-H]^-.

化合物10a的合成：在10ml圆底烧瓶中加入化合物4a，2.5ml氯仿，剧烈搅拌下逐滴加入139μl三氟甲磺酸，5min后，加入3ml水，用氯仿萃取，干燥，减压蒸馏除去溶剂，粗产物进行硅胶柱色谱分离，得到化合物10a。

10a产率：85.5％；红色固体；mp:86.5-87.1℃；IR(KBr):ν_max＝3424.6,1605.8cm^-1；¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ12.79(d,J＝0.5Hz,1H),12.60(d,J＝1.3Hz,1H),7.19(s,2H),6.60(s,1H),2.83(t,J＝9.9Hz,2H),2.36(t,J＝9.8Hz,2H),2.05(s,3H)；ESI-MSm/z255.64[M-H]^-.

化合物10b,11b,12b,6d的合成：向10ml烧瓶中加入0.2mmol化合物5b，20mgAmbertyst-15，2ML不同的醇溶液。然后将烧瓶放到超声清洗器的水浴锅中,反应0.5-1h，温度控制在24-28℃。过滤，减压蒸馏除去溶剂，粗产物进行硅胶柱色谱分离，得到10b,11b,12b。6d可用同样的方法以5d和甲醇反应制得。

10b1,4,6-三羟基-7-甲氧基-6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蒽-9,10-二酮；产率:90.6％；红色固体；mp:128.5-128.8℃；IR(KBr):ν_max＝3423.6,1610.6cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ12.56(s,2H),7.20(s,2H),3.18(s,3H),2.95(dd,J＝41.1,19.1Hz,2H),2.67(dd,J＝18.9,15.1Hz,2H),1.36(s,3H),1.31(s,3H)；¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ186.29,158.43,144.17,142.95,129.38,111.64,76.09,72.13,49.66,35.71,28.46,23.26,17.01；HRMS(ESI-iontrap)m/z[M–H]^-calcdforC₁₇H₁₇O₆317.1031,found317.1029

11b6-乙氧基-1,4,7-三羟基-6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蒽-9,10-二酮；产率:86.3％；红色固体；mp:148.5-149.0℃；IR(KBr):ν_max＝3473.5,1616.5cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ12.57(s,2H),7.21(s,2H),3.61–3.39(m,1H),3.39–3.25(m,1H),3.08–2.86(m,2H),2.67(d,J＝19.5Hz,2H),1.36(s,3H),1.30(s,3H),1.06(t,J＝6.9Hz,3H)；¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ186.49,186.44,158.51,144.24,143.16,129.48,129.43,111.74,75.75,72.31,57.10,35.66,29.51,23.30,17.62,16.16；HRMS(ESI-iontrap)m/z[M–H]^-calcdforC₁₈H₁₉O₆331.1187,found331.1185.

12b1,4,6-三羟基-6,7-二甲基--7-丙氧基-5,6,7,8-四氢蒽-9,10-二酮；产率:90.6％；红色固体；mp:114.2-114.6℃；IR(KBr):ν_max＝3288.5,3205.2,1604.3cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ12.52(d,J＝25.8Hz,2H),7.15(d,J＝5.6Hz,2H),3.34(dd,J＝10.3,3.9Hz,1H),3.24–3.17(m,1H),3.01–2.86(m,2H),2.63(dd,J＝17.8,12.1Hz,2H),1.46–1.39(m,2H),1.35(s,3H),1.29(s,3H),0.79(t,J＝7.2Hz,3H)；¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ186.42,158.51,144.28,143.20,129.43,111.71,75.60,72.32,63.21,35.73,29.33,23.65,23.33,17.61,10.92；HRMS(ESI-iontrap)m/z[M–H]^-calcdforC₁₉H₂₁O₆345.1341,found345.1343

化合物10aa的合成:制备方法同上，所不同用5a代替5b，得到化合物10aa。

10aa1,4,7-三羟基-6-甲氧基-6-甲基-,5,6,7,8-四氢蒽-9,10-二酮；(产率:42.2％；红色固体；mp:137.4-138.2℃；IR(KBr):ν_max＝3315.5,1651.7cm^-1；¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ12.50(s,2H),7.17(s,2H),3.96(t,J＝5.4Hz,1H),3.27(s,3H),3.12–3.02(m,1H),2.77(d,J＝2.0Hz,2H),2.64(ddt,J＝19.8,5.8,1.9Hz,1H),1.28(s,3H)；¹³CNMR(400MHz,CDCl3)δ185.75,158.80,142.72,129.60,129.56,111.55,74.74,70.03,49.48,29.87,29.29,17.33；ESI-MSm/z303.40[M-H]^-.

实施例2：结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶(MptpB)蛋白的提取纯化

在5mLLB培养基加5uLKan(卡纳抗生素，维持质粒)，然后接种大肠杆菌，在37℃培养过夜。取复活的大肠杆菌2ml+100mlLB培养基中(102ulKan)2h37℃摇床，测吸光度，在0.6-0.8内即可，加入IPTG(诱导剂)102ul(1:100)的比例，20℃培养过夜。将培养的表达结核分枝酪氨酸磷酸酶(MptpB)蛋白工程菌离心(5000×g，5min，4℃)，弃上清，菌体重悬于8ml的裂解缓冲液中(25mMTris,20mM咪唑,500mMNaCl,pH7.4),并加入100μlTritonX-100，50μl1mM巯基乙醇，2ml蛋白酶抑制剂，冰浴超声10min，离心(12000rpm，20min，4℃)，收集上清。利用镍螯合琼脂糖凝胶亲和层析纯化，先用裂解缓冲液(25mMTris,20mM咪唑,500mMNaCl,pH7.8)冲洗平衡，然后将上步获得的裂解上清直接上样，混匀，于4℃，保存15min，流下，再倒入柱子中，流下，重复3次。再用Washbuffer(25mMTris,50mM咪唑,500mMNaCl,pH7.8)洗柱子，加入Buffer后静置5min，流出Buffer，洗出杂蛋白，洗2-3遍。然后用ElutionBuffer(25mMTris,350mM咪唑,500mMNaCl,pH7.8)洗出目的蛋白，洗2-3遍。用超滤管装洗出的目的蛋白，离心(5000r，15min)，每次10ml。最后一次离心剩余部分的洗出液，加入置换Buffer(25mMTris,100mMNaCl,pH7.8)(由于Elutionbuffer中含有高浓度的咪唑，对于后续酶活实验有影响，)。置换Buffer洗两三次，留取超滤管离了三次的上层的液体，迅速分装，4℃保存。按照蛋白浓度测定试剂盒(Thermo)对纯化提取的蛋白进行蛋白浓度测试。

实施例3：对实施例1中的化合物进行结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶(MptpB)抑制实验

采用6,8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)为底物，在ReactionBuffer(25mMMops缓冲剂、50mMNaCl，1mMDTT(还原剂)0.05％Tween20(表面活性剂))，25℃，pH7.0中进行。PNPP被MptpB酶解，用紫外—可见分光光度计在405nm波长处测量其吸光度的变化而计算酶的活性。反应初始体系50μL，其中包含2μL的酶、27μM的底物pNPP、0.5μl不同浓度的化合物。反应开始5min到10min后，测定405nm波长处的吸光值。用如下公式来计算酶活性：抑制率(％)＝1-[(实验组–空白组)/(阴性减空白组)]×100％，先对化合物进行初筛，然后将抑制率达到了50％以上的化合物测定其IC₅₀值。每个样品重复测定三次，结果用平均值±标准偏差表示。

表1化合物的结核分枝杆菌酪氨酸磷酸酶(MptpB)抑制活性结果(IC₅₀μM)