检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒和方法

摘要

本发明涉及一种检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒和方法，属于生物技术领域。该试剂盒包括：2×RT-PCR反应液、25×RT-PCR酶混合液、上游引物、下游引物、探针、阴性对照和阳性对照；上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示；下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示；探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示，探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；阴性对照为无核酸酶灭菌超纯水；阳性对照为包含有核苷酸序列如序列表中序列4所示的基因。该实时荧光定量PCR检测试剂盒使用方便，试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了在操作过程的污染，检测特异性强，灵敏度高，适用于快速检测腹地病毒。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测腹地病毒的实时荧光定 量RT-PCR(逆转录PCR)检测试剂盒和方法。

背景技术

腹地病毒(HearstlandsVirus)属于布尼亚病毒科腹地病毒组成员，最近被 分到白蛉病毒属中。该病毒于2012年在两名密苏里州的公民因为发烧和头痛而 住院就诊时，这种传染病才被第一次记述。人和家畜可被携带有该病毒的蜱虫 叮咬而感染，出现中枢神经系统症状，不但造成人类疾病和死亡，更会造成家 畜死亡，导致经济损失，引起公共卫生问题。

目前，腹地病毒检测的金标准是病毒分离，但因其操作繁琐、技术难度大、 耗时长、实验条件要求高、在实际工作中难以推广应用。近年来应用广泛的常 规核酸扩增及实时荧光定量PCR在病毒的检测方面发挥了重要作用。但是，鉴 于蜱虫样本中病原载量较低等原因，建立一种快速、灵敏的检测技术，更利于 蜱中载量较低的病毒检测。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一组用于检测腹地病毒的引物 对和核酸序列；本发明还提供一种用于检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR试 剂盒及其检测方法。本发明利用TaqMan探针实时荧光PCR技术，建立一种快 速、敏感的检测方法，应用于腹地病毒的监测检测。

本发明采用以下技术方案：

一种检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR引物对，所述引物对的核苷酸序 列如序列表中序列1和序列2所示。

一组检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR核酸，该组核酸包括引物对、探 针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如序列表中序列1和 序列表中序列2所示，所述探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述作 为阳性对照的扩增产物包含有如序列表中序列4所示的核苷酸序列。

一种检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，该试剂盒主要包括该试 剂盒包括：2×RT-PCR反应液、25×RT-PCR酶混合液、上游引物、下游引物、探 针、阴性对照和阳性对照；具体组成如下：

2×RT-PCR反应液(2×RT-PCRbuffer)；

25×RT-PCR酶混合液(25×RT-PCREnzymeMix)；

上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；

下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；

探针：核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述探针的5＇端连接荧光基团， 3＇端连接淬灭基团；

阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；

阳性对照：包含有核苷酸序列如序列表中序列4所示的基因。

如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、CY3中任意一种，所 述淬灭基团为BHQ1、TAMARA和BHQ2中任意一种。

一种利用TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法检测腹地病毒的非诊断性 方法，该方法包括以下步骤：

(1)从样品中提取病毒RNA；

(2)对提取的RNA进行实时荧光RT-PCR扩增，其中，反应体系按如下 配制：1×RT-PCR反应液(1×RT-PCRBuffer)，1×RT-PCR酶混合液(1×RT-PCR EnzymeMix)，上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；下游引物：核 苷酸序列如序列表中序列2所示；探针：核苷酸序列如序列表中序列3所示， 所述探针5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；上下游引物和探针浓度为 0.01～1μM，样品RNA；同时设置无核酸酶灭菌超纯水为阴性对照；

实时荧光RT-PCR反应程序：

(3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～ 15个循环的荧光信号，以阈值线超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增 长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

本发明的有益效果：

本发明建立了比较高效、灵敏的腹地病毒的快速检测方法，提供实时荧光 RT-PCR检测试剂盒。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高， 有效替代传统病毒分离来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，大大简化了 操作过程，并减少了在操作过程的污染，检测效果好，特异性强，灵敏度高。 本发明的检测试剂盒最低检出限为14.9×10^-10ng/μL。

附图说明

图1为腹地病毒普通PCR检测的电泳图。

图2为本发明荧光定量PCR试剂盒检测腹地病毒的扩增曲线。

图3为腹地病毒荧光定量PCR特异性扩增曲线。

图4为本发明荧光定量PCR试剂盒检测腹地病毒的扩增标准曲线。

图5为利用本发明试剂盒对样品的检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本 发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本 发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的 本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：普通PCR检测腹地病毒

在本发明引物和探针设计中，筛选腹地病毒S基因片段的保守序列，设计 一对寡聚核苷酸序列(引物)和探针，利用引物可特异地扩增腹地病毒的S基因 片段，引物扩增片段大小为113bp，核苷酸序列如序列表中序列4所示。

序列4：

GTGAGAGCAAATACAATGATGTACTTCACATCATTCCTCCAGTTCTCAC CCCCCCTCTCACGAAGCAGCCCAAAGATCACAGCAGGATCCAGGCCCTCAT AAGCTATCTCCT。

设计的引物和探针如下：

HRTV-F(序列表中序列1)：5′-GTGAGAGCAAATACAATGA-3′

HRTV-R(序列表中序列2)：5′-AGGAGATAGCTTATGAGG-3′

HRTV-FAM(序列表中序列3)：5′-TCACATCATTCCTCCAGTTCTCACC-3′

应用设计的引物对腹地病毒进行普通PCR扩增，采用25μL反应体系： HRTV-F、HRTV-R引物终浓度各为0.4×10³nmol/L；Mg²⁺终浓度2mmol/L；dNTP 终浓度为0.8×10⁶μmol/L；1×RT-PCR反应液(1×RT-PCRBuffer)；Taq聚合酶 用量1单位(unit)，模板2μL。

PCR扩增反应条件为：

95℃预变性3分钟，接着进行循环反应：95℃变性30秒，49℃退火30 秒，72℃延伸30秒，共进行40个循环；最后72℃延伸10分钟；

对扩增产物进行电泳：阴性对照为灭菌生理盐水；阳性对照为携带有如序 列表序列4所示序列的质粒DNA，起始浓度为14.9×10^-3ng/μL，并按10倍比进 行梯度稀释。结果如图1所示，可以看到所设计的引物可有效扩增腹地病毒。

实施例2：腹地病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的制备

腹地病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒包括以下成分：

2×RT-PCR反应液(2×RT-PCRBuffer)；

25×RT-PCR酶混合液(25×RT-PCREnzymeMix)；

上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；

下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；

探针：核苷酸序列如序列表中序列3所示；

阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；

阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如序 列表中序列4所示。

其中，所述2×RT-PCR反应液和25×RT-PCR酶混合液可选用ABI公司 AgPath-IDTMOne-stepRT-PCRKit；引物、探针、质粒委托上海英骏生物技术 有限公司合成，探针在合成时探针5＇端连接FAM荧光基团和3＇端连接BHQ1 淬灭基团。

实施例3：腹地病毒实时荧光RT-PCR检测的方法

本发明检测腹地病毒方法包括以下步骤：

(1)病毒RNA提取

病毒RNA提取可选用QIAampViralRNA提取试剂盒进行提取。

(2)RT-PCR扩增

采用实施例2制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积见表1。

表1反应体系

扩增条件：采用以下扩增条件。

(3)收集荧光信号，选择FAM的荧光检测模式，基线调整取3～15个循 环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增 长，则判断为阳性，即样品中含有腹地病毒核酸，如无典型的扩增曲线，判断 为阴性。

本发明的方法中，探针与荧光和淬灭基团相连，所述荧光-淬灭基团为 FAM-BHQ1，其它荧光淬灭基团组合也同样适用，比如CY3-TAMARA、 CY3-BHQ2、FAM-BHQ2、CY3-BHQ1等，检测时选择相应的荧光检测模式。

上述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300， 7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪 (例如MX4000，MX3000，MX3005)等。

实施例4：本发明试剂盒灵敏度的检测

选择含有扩增序列的腹地病毒质粒作为阳性标准品，将提取的DNA从10^-1依次稀释到10^-11进行检测；腹地病毒质粒由上海生工合成。

1)阳性对照：腹地病毒阴性的蜱RNA；

2)阴性对照(NTC)：无核酸酶水；

3)反应体系按照实施例3中表1进行配制，每个梯度做三个平行样。

检测结果如图2所示。图2中1-5曲线从左往右分别为标准品用无核酸酶水 浓度稀释度为10^-3-10^-11扩增的曲线。结果判定：Ct值低于35为阳性结果，超 过38为阴性结果。

从图中可以得出结论，引物和探针检测阳性标准品的检测灵敏度为 14.9×10^-10ng/μL。

实施例5：本发明试剂盒的特异性检测

1)选择腹地病毒质粒作为阳性对照(PTC)；

2)阴性对照：无核酸酶水；

3)模板：选择发热伴血小板减少综合征病毒、汉滩病毒、汉城病毒进行非 特异性测试，上述模板均由中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所提供。

4)反应体系按照实施例3中表1进行配制。

检测结果如图3，结果表明，所建立的腹地病毒通用型实时荧光PCR方法及 其试剂盒对于除腹地病毒外的其他病毒没有特异性的扩增，表明引物及探针设 计特异性强。

实施例6：腹地病毒实时荧光PCR标准曲线的制作

1)选择腹地病毒阳性质粒作为标准品，将其浓度从14.9×10^-3ng/μL依次稀释 到14.9×10^-11ng/μL，选择10^-3-10^-11作为模板；

2)阴性对照：灭菌超纯水；

3)反应体系按照实施例3中表1进行配制。

检测结果如图4所示，腹地病毒通用型实时荧光PCR的标准曲线为： R²＝0.9959；其中，X轴表示相应的校正后报告荧光强度的对数，Y轴循环次数。

实施例7：本发明试剂盒检测未知样本

利用本发明试剂盒，对黑山头蜱虫样本88份进行检测，具体实验步骤如下：

(1)病毒RNA提取

病毒RNA提取可选用天跟DNA、RNA共提取试剂盒进行提取。

a.匀浆处理：

在蜱虫样本中加入适量裂解液RLplus，用电动或玻璃匀浆器将样品彻底研 磨，涡旋震荡30sec。

b.12,000rpm(13,400×g)离心3-5min，小心吸取上清至吸附柱CB3(吸附柱 CB3放在2ml离心管中)，12,000rpm(13,400×g)离心。

总RNA提取

c.向滤液中加入1倍体积70％乙醇，混匀。

d.得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱CR3放入收集管中)， 12,000rpm(13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回 收集管中。

注意：将溶液和沉淀转移至吸附柱CR3时，如果体积大于吸附柱容量，可以 分两次完成。

e.向吸附柱CR3中加入700μl去蛋白液RW1，12,000rpm(13,400×g)离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

f.向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙 醇)，室温静置2min，12,000rpm(13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱CR3放回收集管中。

g.重复步骤f。

h.12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置 数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

i.将吸附柱CR3转入一个新的1.5mlRNase-Free离心管中，加入30-100μl RNase-FreeddH₂O室温放置2min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，得到RNA溶 液。

(2)实时荧光RT-PCR扩增

采用实施例2制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积见表2。

表2反应体系

扩增条件：采用以下扩增条件。

(3)收集荧光信号，选择FAM的荧光检测模式，基线调整取3～15个循 环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；所选定 的阈值线具体为17.32。

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增 长，则判断为阳性，即样品中含有腹地病毒核酸，如无典型的扩增曲线，判断 为阴性。

本发明的方法中，探针与荧光和淬灭基团相连，所述荧光-淬灭基团为 FAM-BHQ1。

在35份蜱虫样本中，无阳性样本检出，检测结果如图5所示，证明本发明试 剂盒检测结果准确、可靠。

通过以上具体实施例可以看到，本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂 盒使用方便，试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了在操作过程 的污染，检测特异性强，灵敏度高，适用于快速检测腹地病毒。