人类X染色体20个短串联重复序列复合扩增体系及应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，涉及人类X染色体20个短串联重复序列复合扩增体系及应用，该复合扩增体系包括20对引物，可同时扩增19个STR位点：DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810、GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809、GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB以及一个性别识别位点Amelogenin。本发明采用五色荧光标记，扩增产物大小在85-450bp之间，操作简单，个体识别力高。本发明所提供的复合扩增体系提供的位点与目前通用的X-STR试剂盒具有很高的兼容性并且新增加了一些多态信息比较高的位点，可以有效的应用于X染色体相关的亲权鉴定、个体识别以及X染色体伴性遗传疾病的辅助检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及人类X染色体20个短串联重复序列复合扩增体 系，具体涉及利用X染色体上具有多态性的遗传标记、通过聚合酶链式反应进行复合 扩增的荧光检测试剂盒，该体系可以应用于与X染色体相关的日常亲权鉴定、个体识 别以及X染色体伴性遗传疾病的辅助检测。

背景技术

人类基因组STR(短串联重复序列)是以少数几个碱基为核心单位，串联重复形 成的DNA遗传标记。不同种族、不同人群甚至不同个体之间的区分是通过核心单位 序列和重复数的差异,这也构成了STR的遗传多态性。在基因组中,平均每15～20kb 就有一个STR位点,占基因组的10％,多存在于非编码区及内含子中,重复单位为2～6 bp,重复次数10～60次,片段大小在70～500bp,并按孟德尔规律呈共显性遗传。因此 STR复合扩增检测技术可以广泛应用于法医个体识别、亲子鉴定等领域。

在人类的23对染色体中，其中一对为性别染色体即为X染色体和Y染色体。女 性的一对X染色体在卵细胞生成的过程中可以像常染体一样发生重组，但是在男性的 精子细胞生成的过程中，X染色体和Y染色体不能随意重组。父亲的X染色体只遗 传给女儿，母亲的X染色体可以遗传给女儿，也可以遗传给儿子。所以X染色体这 种独特的遗传方式使得其在亲权鉴定中具有特殊的应用价值。比如双亲缺失的姐妹认 亲、同父异母姐妹关系鉴定、祖母-孙女关系鉴定、乱伦关系鉴定、强奸案件的鉴定 以及与X染色体相关的遗传疾病的鉴定等。

与现在市面上常染色体STR试剂盒的数量相比，X-STR试剂盒的数量仅有几家 可供选择，另外X染色体相关的专利数量也比较少。

现有X-STR试剂盒和X染色体相关的专利其针对的STR位点数量较少，且在遗 传多态性、个体识别力和检测的准确性上有一定欠缺，因此有必要开发一种位点数量 多、遗传多态性高、个体识别力强的X-STR试剂盒。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种一次能检测19个X-STR基因座 及Amelogenin基因座的人类X染色体20个短串联重复序列复合扩增体系，适用于使 用常染体STR试剂盒难以排除亲权关系案例的检测，并且本发明荧光标记复合扩增 体系检测快速、准确。

本发明的又一个目的是提供人类X染色体短串联重复序列复合扩增体系在X染 色体相关的亲权鉴定、个体识别中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案：人类X染色体短串联重复序 列复合扩增体系，其特征在于，该复合扩增体系包括19对引物，可同时扩增19个 STR位点：DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423、GATA172D05、 DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810、GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、 DXS6809、GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB；

所述扩增DXS6795的上游引物序列如SEQIDNO1所示；

所述扩增DXS6795的下游引物序列如SEQIDNO2所示；

所述扩增DXS6803的上游引物序列如SEQIDNO3所示；

所述扩增DXS6803的下游引物序列如SEQIDNO4所示；

所述扩增DXS6807的上游引物序列如SEQIDNO5所示；

所述扩增DXS6807的下游引物序列如SEQIDNO6所示；

所述扩增DXS9907的上游引物序列如SEQIDNO7所示；

所述扩增DXS9907的下游引物序列如SEQIDNO8所示；

所述扩增DXS7423的上游引物序列如SEQIDNO9所示；

所述扩增DXS7423的下游引物序列如SEQIDNO10所示；

所述扩增GATA172D05的上游引物序列如SEQIDNO13所示；

所述扩增GATA172D05的下游引物序列如SEQIDNO14所示；

所述扩增DXS101的上游引物序列如SEQIDNO15所示；

所述扩增DXS101的下游引物序列如SEQIDNO16所示；

所述扩增DXS9902的上游引物序列如SEQIDNO17所示；

所述扩增DXS9902的下游引物序列如SEQIDNO18所示；

所述扩增DXS7133的上游引物序列如SEQIDNO19所示；

所述扩增DXS7133的下游引物序列如SEQIDNO20所示；

所述扩增DXS6810的上游引物序列如SEQIDNO21所示；

所述扩增DXS6810的下游引物序列如SEQIDNO22所示；

所述扩增GATA31E08的上游引物序列如SEQIDNO23所示；

所述扩增GATA31E08的下游引物序列如SEQIDNO24所示；

所述扩增DXS6800的上游引物序列如SEQIDNO25所示；

所述扩增DXS6800的下游引物序列如SEQIDNO26所示；

所述扩增DXS981的上游引物序列如SEQIDNO27所示；

所述扩增DXS981的下游引物序列如SEQIDNO28所示；

所述扩增DXS10162的上游引物序列如SEQIDNO29所示；

所述扩增DXS10162的下游引物序列如SEQIDNO30所示；

所述扩增DXS6809的上游引物序列如SEQIDNO31所示；

所述扩增DXS6809的下游引物序列如SEQIDNO32所示；

所述扩增GATA165B12的上游引物序列如SEQIDNO33所示；

所述扩增GATA165B12的下游引物序列如SEQIDNO34所示；

所述扩增DXS10079的上游引物序列如SEQIDNO35所示；

所述扩增DXS10079的下游引物序列如SEQIDNO36所示；

所述扩增DXS10135的上游引物序列如SEQIDNO37所示；

所述扩增DXS10135的下游引物序列如SEQIDNO38所示；

所述扩增HPRTB的上游引物序列如SEQIDNO39所示；

所述扩增HPRTB的下游引物序列如SEQIDNO40所示。

进一步地，人类X染色体短串联重复序列复合扩增体系还包括一对能扩增 Amelogenin的一对引物，分别为：

扩增Amelogenin的上游引物序列如SEQIDNO11所示；

扩增Amelogenin的下游引物序列如SEQIDNO12所示。

前述的人类X染色体短串联重复序列复合扩增体系，其引物浓度比例是： DXS6795SEQIDNO1-2，0.179μmol/L、DXS6803SEQIDNO3-4，0.126μmol/L、 DXS6807SE-QIDNO5-6，0.245μmol/L、DXS9907SEQIDNO7-8，0.150μmol/L、 DXS7423SEQIDNO9-10，0.162μmol/L、AmelogeninSEQIDNO11-12，0.060μmol/L、 GATA172D05SEQIDNO13-14，0.192μmol/L、DXS101SEQIDNO15-16，0.190μmol/L、 DXS9902SEQIDNO17-18，0.169μmol/L、DXS7133SEQIDNO19-20，0.404μmol/L、 DXS6810SEQIDNO21-22，0.412μmol/L、GATA31E08SEQIDNO23-24，0.188μmol/L、 DXS6800SEQIDNO25-26，0.278μmol/L、DXS981SEQIDNO27-28，0.130μmol/L、 DXS10162SEQIDNO29-30，0.250μmol/L、DXS6809SEQIDNO31-32，0.420μmol/L、 GATA165B12SEQIDNO33-34，0.255μmol/L、DXS10079SEQIDNO35-36， 0.276μmol/L、DXS10135SEQIDNO37-38，0.315μmol/L、HPRTBSEQIDNO39-40， 0.404μmol/L。

人类X染色体STR的分组为：DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423 为第一组；Amelogenin、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810 为第二组；GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809为第三组； GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB为第四组。

每一对特异性引物对中的一条引物的5’端带有荧光素标记，所述的荧光素标记 方式为：DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423采用FAM标记； Amelogenin、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810采用HEX标 记；GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809采用TAMRA标记； GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB采用ROX标记。该复合扩增体系检 测用的内标采用橙色荧光素标记物Orange标记。

扩增体系包括引物混合物、酶反应缓冲液、基因组DNA，所述的酶反应缓冲液 包括热启动DNA聚合酶、Brij58、dNTP、DMSO、Tris-HCl、BSA、DTT，酶反应缓 冲液在-20℃的保存环境中不结冰。以扩增体系为25μl计算，引物混合物为(5*Primer mix)5μl，酶反应缓冲液(2.5*BufferD)10μl，基因组DNA(提取模板DNA，直扩检 材等)1-3μl。本发明所涉及到的DNA样品可来源于人的血液、血痕、精液、精斑、 唾液、体液、毛发、肌肉、组织、指甲等。所述DNA样品可用试剂盒法、酚氯仿抽 提法、Chelex-100法、磁珠法进行DNA提取处理。

所述的酶反应缓冲液的配方为：KCl0.1M；MgCl20.0015mM；Tris-HCl0.05M； BSA0.16mg/ml；dNTP0.2mM；Brij580.001M；DTT0.02M；Betaine0.1mol/L；DMSO 0.40％，百分比为DMSO原液占酶反应缓冲液的体积百分数，即配置100ml酶反应缓 冲液时，加入0.4mlDMSO原液；热启动DNA聚合酶0.25U。

所述的复合扩增体系的扩增程序是：第一步变性：96℃，2分钟；热循环：94℃30 秒；60℃，70秒，共进行27-30个循环；终延伸60℃，30分钟；保温：15℃。本发 明的扩增产物需经过毛细管电泳，从而进行片段分析。

本发明所采用的19个X-STR的遗传数据统计见结果(表1)。

表1：本发明所采用的19个X-STR的遗传数据统计表

其中Marker:基因座位点，Cytogeneticlocalisation：染色体距离定位，Physical localisation[Mb]：物理距离定位，PIC：Polymorphisminformationcontent的缩 写，多态性信息含量，HET：Heterozygotie的缩写，杂合度，用来衡量基因的多态性， MEC：Meanpaternityexclusionchange的缩写，平均非父排除率，PD：Powerof Discrimination的缩写，个人识别能力。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：本发明所涉及的19个X染色体STR位 点比现在市场上绝大多数的商业化试剂盒位点数量多，能够更好的满足公安、司法机 关对于X-STR检测的高要求。根据对汉族人群1248个样本的统计，可见：本发明所 选择的位点具有较高的多态性信息、个体识别率比较高。基因组DNA可通过提取模 板DNA、直扩检材等方式获得，模板适应范围广。引物的特异性较高，无非特异性 产物生成且信号稳定。

附图说明

图1为酶反应缓冲液(2.5*BufferD)的优化实验中Brij58的浓度比较结果；

图2为酶反应缓冲液(2.5*BufferD)的优化实验中DMSO的浓度比较结果；

图3.1和图3.2为本发明所给出的最优化组分扩增效果图；

图4.1和图4.2为本发明所涉及的物种特异性的检测实验结果；

图5.1和图5.2为几种检材的扩增效果图谱；

图6.1和图6.2为XX性反转综合征病例的扩增图谱；

图7.1、7.2、7.3和7.4为同父异母姐妹亲权关系鉴定扩增图谱。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

下列表2列举比较了现在市面上常见的X-STR试剂盒的基因座位点信息、X染 色体相关的专利发表的复合扩增体系和本发明的试剂盒。

表2现有的X-STR复合扩增体系与本发明扩增体系对比

尽管目前公安司法等机关对于X-STR试剂盒的需求很强烈，但是上述表格中涉及 到的试剂盒或复合扩增体系或因为价格或因为无法商品化所以在现实的公安、司法及 各个院所实验室的使用普遍率不是很高。所以开发出一个位点数量多、遗传多态性高、 个体识别力强的X-STR试剂盒是具有非常明朗的市场前景的。

实施例1人类染色体20个短串联重复序列复合扩增体系设计

1.引物设计

所述引物采用PrimePremier5和NCBIBlast等软件设计而成，设计引物时应当确 保各引物的Tm值在(60±2)℃的范围内，扩增效率接近并确保各对引物的扩增产 物大小不同并足以在毛细管电泳中区分开。设计完成后，用AutoDimer等软件分析 引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异性产物或者 二聚体的需要重新设计，直到得到符合要求的引物序列。

选用人源DNA模板，分别用上述20对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1.5％ 的琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到20对引物共同 的扩增条件，最终期望的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出 现明亮且较单一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。

2.荧光标记系统建立

选择了FAM、HEX、TAMRX、ROX建立四色荧光标记系统，将所设计的20对引物分 为四组进行荧光标记。每组采用一种荧光标记，分别是FAM、HEX、TAMRX、ROX。得 到荧光标记引物后，用其相配对的非荧光引物组合，然后分别进行单重扩增，将扩 增产物置于3500遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估 每对引物的扩增效率。其后，将同一荧光标记的4对或5对或6对引物混合置于同 一管中扩增，将扩增产物置于3500遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳 检测的结果来确定每对引物的扩增效率，以及判断该4对或5对或6对引物混合扩 增是否引起非特异性。最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确 定各引物对的加入量，将20对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳 结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本 一致为准。最终确定的20对引物序列和浓度比例(引物浓度值是在PCR扩增体系中 的引物浓度)见表3。针对上述20个基因位点设计特异性引物，其扩增产物的长度 范围为85-450bp之间。本发明的检测组分中标准物采用Orange橙色物标记，能够 明确地标记区分出检测样本各个基因座位点的大小。

表320对引物序列和浓度比例表

本发明所涉及到的DNA样品可来源于人的血液、血痕、精液、精斑、唾液、体液、 毛发、肌肉、组织、指甲等。所述DNA样品可用试剂盒法、酚氯仿抽提法、Chelex-100 法、磁珠法进行DNA提取处理。

本发明的扩增产物可用ABI系列的遗传分析仪进行检测。检测结果可以在 Genemapper等数据分析软件上分析，得到相应的STR分型图谱及数据。

实施例2对某一个样本的基因分型检测

1.血液样本的采集(血液样本由志愿者捐赠)

2.DNA提取

采用Chelex-100法提取基因组DNA(参考《ForensicDNAProtocol》.Humana Press,1998)取0.5-5μl的抗凝全血或(1-3mm)*(2-5mm)的血斑至于500μl离心管 中，振荡混匀Chelex溶液使Chelex充分悬浮，每管加入195μlChelex-100(5％)溶 液和5μl蛋白酶K(20mg/ml)振荡混匀，56摄氏度保温两小时或者过夜后，取出振 荡2分钟，沸水中加热10分钟后13000rpm离心5分钟，小心移取150μl上清至新离 心管中。

3.反应体系

将各反应试剂(缓冲液、引物混合物、基因组DNA等)振荡混合后按以下方式 配成PCR反应混合液，扩增体系总体积为25μl，包括引物混合物(5*Primermix)5μl， 其中引物浓度见实施例1，酶反应缓冲液(2.5*BufferD)10μl、基因组DNA2μl(提取 模板DNA，直扩检材等)，ddH₂O8μl。

本发明所涉及的复合扩增体系中使用的酶反应缓冲液(2.5*BufferD)具有特殊的 配方(表4)，是一种热启动酶(MRTaqⅡ)与PCR反应缓冲液预混液，并且其在-20℃的 保存环境中不会结冰，具有防冻的功能。

成分 单位 缓冲液中的浓度 KCl M 0.1 MgCl₂M 0.0015 Tris-HCl M 0.05 BSA(牛血清蛋白) mg/ml 0.16 dNTP mM 0.2 Brij58(聚氧乙烯醚) mM 0.001 DTT(二硫苏糖醇) M 0.02 Betaine(甜菜碱) M 0.1 DMSO(二甲基亚砜) ％ 0.40％ MR TaqⅡ U 0.25

表4：酶反应缓冲液(2.5*BufferD)配方

4.PCR反应程序

本发明所涉及的复合扩增体系使用的PCR扩增程序(表5)。

表5：本发明复合扩增体系的扩增程序

5.毛细管电泳检测

将Orange500内标和甲酰胺按比例2.5:100混合，取12.5μl混合物加入到96孔 板，再加入扩增产物样品或者是等位基因标准物1μl，混合静置数分钟，95℃变性3min， 立即冰浴3min，离心后放入ABI3500测序仪上，准备检测。

6.数据分析

导入原始数据，在主页面的File菜单选择Addsampletoproject，找到样品文 件，选中文件夹，点击addtolist，点击add,样品文件即显示在Project窗口；选 择分析参数。定义analysismethod、panel、sizestandard。浏览样本电泳的原始 数据，选中某样本的文件名，在“sample”菜单下选择“Rawdata”。移动追踪线， 使光标停在引物峰右侧(第一个橙色的内标峰前)，以此时窗口左下角X轴上显示的 数值作为analysismethod分析参数中的起始点；点击绿色分析按钮，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。采用GeneMapper^RID-X软件分析得到的数据并生成图谱。

实施例3针对酶反应缓冲液(2.5*BufferD)的优化实验

KCl在酶反应缓冲液的浓度梯度为：0.075M、0.1M、0.125M三个浓度梯度。 MgCl₂在酶反应缓冲液的浓度梯度为：1mM、1.5mM、2mM三个浓度梯度。Brij58 在酶反应缓冲液的浓度梯度为：0.001mM、0.0015mM、0.002mM三个浓度梯度。 DTT在酶反应缓冲液的浓度梯度为：0.015M、0.02M、0.025M三个浓度梯度。Betaine 在酶反应缓冲液的浓度梯度为：0.05M、0.1M、0.15M三个浓度梯度。DMSO在酶 反应缓冲液的浓度梯度为：0.3％、0.4％、0.5％三个浓度梯度。MRTaqⅡ在酶反应缓 冲液的浓度梯度为：0.15U、0.25U、0.35U三个浓度梯度。针对上述酶反应缓冲液 的组分设计不同浓度的正交实验进行复合扩增，根据实验的结果确定复合扩增体系的 最优组合。附图1列举了其中Brij58的浓度比较结果。附图2列举了其中DMSO的 浓度比较结果。附图3.1和3.2列举了本发明所给出的最优化组分(即实施例2中的 组分比例)扩增效果图。附图1-7的所有附图均为GeneMapper^RID-X软件分析得到的 数据图谱。

实施例4：针对物种特异性的检测实验，选取了不同物种的DNA模板(酚氯仿抽 提)，看本发明的复合扩增体系是否有物种特异性的优势。选取了猪、牛、羊、小鼠、 鸡、鸭、鱼及人类基因组DNA作为检测对象，结果本发明涉及的复合扩增体系可以 高效的扩增出人类基因组DNA的X-STR分型，其他物种均没有扩增产物。图4.1和 4.2列举了本发明所涉及的物种特异性的检测实验结果。

实施例5：利用本发明的复合扩增体系检测不同检材。本发明所涉及到的DNA样 品可来源于人的血液、血痕、精液、精斑、唾液、体液、毛发、肌肉、组织、指甲等。 所述DNA样品可用试剂盒法、酚氯仿抽提法、Chelex-100法、磁珠法进行DNA提取 处理。附图5.1和5.2列举了其中几种检材的扩增效果图谱。证明利用各种检材均能 实现有效扩增，检测快速准确，适用范围广。

实施例6：利用本发明的复合扩增体系鉴定一起XX性反转综合征病例。

该起病例的样本为一对父子的血滤纸样本，儿子的第二性征表现为男性，但是利用 Y微缺失试剂盒检测时没有结果。在进行X-STR位点检测时发现该案例的儿子的Amel 位点的分型为XX,基因型为女性，X染色体上某些STR位点有2个等位基因(表6)，该 案例中儿子的等位基因与父亲的等位基因可以高度匹配。其父亲为正常男性个体，具有 1条X染色体和1条Y染色体。所以该案例中儿子从其父亲处继承了一条X染色体，是 一个典型的性反转综合征案例(图6.1和6.2)。

表6：XX性反转综合征病例父亲与儿子的X-STR分型

位点 父亲基因型 儿子基因型 DXS6795 11 11 DXS6803 11 11；12 DXS6807 14 11；14 DXS9907 13 13 DXS7423 15 15 AMEL X；Y X DXS981 12.3 12.3；14 DXS101 24 24；28 DXS9902 12 10；12 DXS7133 10 9；10 DXS6810 19 18；19 GATA31E08 9 9 DXS6800 16 16 GATA172D05 10 10 DXS10162 18 18 DXS6809 34 34 GATA165B12 10 9；10 DXS10079 21 20；21 DXS10135 20 20；23 HPRTB 13 13

实施例7：同父异母姐妹亲权关系鉴定。

本案例中有2对母女，主张这两对母女中的女儿是同父异母的姐妹，其假设的同一 父亲已经不在世，故只可以使用X-STR位点进行检测。检测结果(表7和图7.1-7.4) 基本可以确定这两对母女中的女儿的父亲基因分型相同，所以不排除是同父异母的姐妹 关系。

表7：同父异母姐妹亲权关系鉴定基因分型

上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对 本发明权要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。