一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法及应用，其解决了现有DNA双链断裂碎片数目检测中不能定量的问题。主要是采用限制性内切酶完全酶切待分析的完整目标基因(组)获得标准品，再利用标准曲线法对任何已知DNA序列的基因(组)双链断裂碎片数目进行定量分析。本标准品制备方法简便、成本低廉、定量结果可靠，可广泛应用于已知DNA序列的各种生物的基因(组)双链断裂碎片数目的定量分析。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA双链断裂碎片数目的定量分析技术领域，具体涉及一种检 测DNA双链断裂碎片数目的标准品的制备方法以及标准品的应用。

背景技术

生物体内部或外界的多种不利因素如细胞内代谢产物、电离辐射、亚硝铵 类致癌物等均可导致DNA分子断裂。若DNA发生双链断裂，则机体会启动同源 重组修复通路或(和)非同源末端连接修复通路对其进行修复，若不能被有效 修复则会产生DNA双链断裂，累积起来，可能会对细胞的正常生理功能造成影 响，甚至导致病变的发生。因此，定量分析DNA双链断裂数目的多少对评估生 物遗传的稳定性非常重要。

虽然检测DNA双链断裂的方法很多，但大部分方法如流式细胞术、TUNEL法 等检测的是DNA单链断裂和DNA双链断裂的总和，仅有小部分方法检测的是DNA 双链断裂。目前检测DNA双链断裂的方法主要有γH2AX法、单细胞凝胶电泳法 及脉冲电场凝胶电泳法等。γH2AX法是利用DNA双链断裂后，会形成磷酸化的 γH2AX，即γH2AX焦点。焦点数与DNA双链断裂点数间存在一一对应关系，通 过计数γH2AX焦点数可实现DNA双链断裂点的定量分析。但在实际工作中，计 数γH2AX焦点数需在荧光显微镜下采用手工方法或借助特定软件进行，当γ H2AX焦点数过多、γH2AX焦点过于密集甚至发生重叠时，手工计数或软件分析 均会出现较大偏差，因此，一般分析中γH2AX法的结果常以含γH2AX焦点细胞 在总细胞中所占百分比或γH2AX焦点的平均几何荧光强度表示，而非以DNA双 链断裂点数目表示。单细胞凝胶电泳法及脉冲电场凝胶电泳法检测的是DNA双 链断裂在总DNA中所占的比例，无法对DNA双链断裂数进行定量分析。综上所 述，目前的主要检测方法均难以对DNA双链断裂数目进行定量分析。难以定量 DNA双链断裂数的主要原因是缺乏合适的已知量的标准品用以推测未知样本中 DNA双链断裂数，因此，我们试图提供一种应用于定量分析DNA双链断裂碎片数 的标准品的制备方法及其应用。

限制性内切酶可以特异识别特定核苷酸序列并将其切割，使完整的DNA产 生特定断裂碎片数目。限制性内切酶切割完整的DNA分子后产生的DNA双链断 裂的数目与该酶特异识别的核苷酸序列在DNA分子中出现的频率成正比。不同 限制性内切酶特异识别的核苷酸序列不同，该核苷酸序列在DNA分子中出现的 频率也不同，因而用不同的限制性内切酶切割DNA分子可获得不同数量的DNA 双链断裂片段。本法借助限制性内切酶完全酶切DNA双链断裂阴性标本制备定 量检测DNA双链断裂碎片数的标准品，并通过识别特定序列的软件扫描，计算 出已知序列的基因(组)DNA标准品中限制性内切酶特异识别序列在基因(组) 中出现的次数，得到标准品中DNA双链断裂碎片的数目。制备方法简便，成本 低廉，结果可靠，并可广泛应用于各种生物已知基因(组)序列的DNA双链断 裂碎片数的定量检测，解决了目前暂无定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品 这一难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方 法以及该标准品的应用，以克服由于暂无DNA双链断裂标准品而导致现有检测 技术难以对DNA双链断裂碎片数进行定量分析的不足。

一种定量检测DNA双链断裂碎片数的标准品的制备方法，用不同的限制性 内切酶分别完全酶切已知序列的基因或基因组DNA所得碎片即为标准品。

上述用于制备标准品的对象为完整基因或基因组，即DNA双链断裂阴性标 本，要求出现DNA双链断裂的比例＜5％。

能够利用上述方法制备的标准品采用标准曲线法对待测样品进行DNA双链 断裂碎片数的定量分析，所述的标准品与待测样品的DNA类型相同。

上述方法制备的标准品采用连接介导荧光定量PCR进行标准品扩增制备标 准曲线。

上述方法制备的标准品的标准曲线以进行连接介导荧光定量PCR后的标准 品的Ct值为横坐标，DNA双链断裂碎片数为纵坐标，通过曲线拟合获得拟合方 程。对于任何已知DNA序列的基因或基因组进行序列扫描，计算出基因或基因 组中限制性内切酶特异识别序列出现的次数，1个特异识别序列即为1个切割位 点，从而计算限制性内切酶在基因或基因组中的切割位点数，得到标准品基因 或基因组DNA双链断裂碎片数。

待测样品同样采用连接介导荧光定量PCR法扩增，将待测样本的Ct值代入 方程中即换算得到DNA双链断裂碎片数值。

所述的方法制备得到的定量检测DNA双链断裂片段数的标准品的应用，用 于对待测样品进行DNA双链断裂碎片数的定量分析。具体是利用所述的标准品 采用标准曲线法对待测样品进行DNA双链断裂碎片数的定量分析。所述的标准 品与待测样品的DNA类型相同。

本发明标准品的制备时为保证酶切尽量完全，应尽量避免酶切序列的DNA 甲基化修饰，可通过限制性内切酶产品提供商提供的产品信息和DNA序列信息 作出判断。所用限制性内切酶的种类和数量根据待检测样品预估的断裂碎片数 确定，保证待测样品的Ct值和断裂数均在所选定的几种限制性内切酶处理后制 备的标准曲线范围内，符合制备标准曲线的原则。

DNA双链断裂检测的标准品标本DNA类型与待测标本DNA类型相同，可以是 任何已知DNA序列生物的基因组，也可以是某个已知序列的DNA片段。

本发明用于非疾病治疗或者诊断目的的已知DNA序列的任何基因或基因组 DNA双链断裂碎片数目的检测，包括各种动物、植物和微生物等。

与现有技术相比，采用本发明所用技术方案，可以达到以下技术效果：

1.这是一个定量的方法：对于任何已知DNA序列的基因或基因组，采用本 法均可用标准曲线法获得未知样品中DNA双链断裂碎片的数目。

2.适用性广：对于已知基因组DNA序列的所有生物或者已知DNA序列的各 种DNA片段均可适用。它可和连接介导荧光定量PCR等技术配合使用。

3.简单实用：本发明中标准品制备方法技术简便，结果可靠，成本低廉。

附图说明

图1：含不同水平SDF的精子细胞在SCGE法中所呈现的“彗星”图形；

图2：6个标准品的连接介导荧光定量PCR曲线图；

图3：连接介导荧光定量PCR分析精液DNA双链断裂碎片数标准曲线；

图4：中性单细胞凝胶电泳法与LM-FQPCR法相关性比较；

图5：40例临床精液标本LM-FQPCR的扩增曲线。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例

1.利用软件对人基因组DNA双链断裂碎片数的确定：

人染色体的核苷酸全序列可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/ guide/human/index.shtml的downloadDNAsequence下载。

2.选择平末端核酸内切酶，通过识别特定序列用软件对染色体DNA进行扫描， 核酸内切酶识别序列的出现次数即为理论上的DNA双链断裂的碎片数。

如AfeⅠ识别序列5’AGC^↓GCT3’，

3’TCG_↑CGA5’

对人基因组每一染色体分别扫描，用软件确认的限制性内切酶识别的特定序列 结果见表1。

表1限制性内切酶特异识别序列在人类染色体中出现的次数

3.人精子DNA双链断裂碎片(spermDNAfragmentation,SDF)标准品的制备

在人精子DNA双链断裂碎片分析中，习惯用SDF代表DNA双链断裂碎片。 首先需确定DNA双链断裂阴性精液标本，一般采用碱性单细胞凝胶电泳法(SCGE) 和中性单细胞凝胶电泳法同时测定其“慧尾”DNA＜5％，即为SDF阴性(non-SDF)， 如图1。

再用PmeI,EcoRV,PsiI,SspI,HaeⅢ,AluI限制性内切酶分别完全酶切 100ngDNA双链断裂阴性精液标本精子基因组DNA以获得6个标准品。通过优化 酶切条件，6种限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性精液标本的精子基因组DNA 的具体操作过程如下：

(1)PmeI限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA：

DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA 100ng MssI限制性内切酶 5U 10×限制性内切酶酶切缓冲液R 2μl

用无菌双蒸水补至20μl

37℃孵育3h，65℃20min灭活MssI限制性内切酶

(2)EcoRV限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA：

DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA 100ng EcoRV限制性内切酶 5U 10×限制性内切酶酶切缓冲液R 2μl

用无菌双蒸水补至20μl

37℃孵育3h，80℃20min灭活EcoRV限制性内切酶

(3)PsiI限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA：

DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA 100ng AanI限制性内切酶 5U 10×限制性内切酶酶切缓冲液Tango 2μl

用无菌双蒸水补至20μl

37℃孵育3h，65℃20min灭活AanI限制性内切酶

(4)SspI限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA：

用无菌双蒸水补至20μl

37℃孵育2h，65℃20min灭活SspI限制性内切酶

(5)HaeⅢ限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA：

用无菌双蒸水补至20μl

37℃孵育2h，80℃20min灭活BsuRI限制性内切酶

(6)AluI限制性内切酶完全酶切DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA：

用无菌双蒸水补至20μl

37℃孵育1h，65℃20min灭活AluI限制性内切酶。

分别取1μl上述6种限制性内切酶酶切后的产物稀释1000倍作为6个标 准品。

标准品中DNA双链断裂碎片数量的计算:

基因组DNA的拷贝数＝基因组DNA的质量(μg)×6.022×10²³(mol^-1)/[3.15 ×10⁹(bp)×10⁶×650]＝基因组DNA的质量(μg)×2.94×10⁵。

本实施例中，1μl标准品所含基因组拷贝数＝0.1μg×(1/20)× 10^-3×2.94×10⁵＝1.47，其中0.1μg为限制性内切酶酶切SDF阴性精液标本的精 子基因组DNA时所用基因组DNA的质量，0.1μg×(1/20)×10^-3为在20μl酶 切系统中取1μl所含基因组DNA的拷贝数。1μl标准品中DNA双链断裂碎片数 量分别为：PmeI(51699.9)，EcoRV(569949.135)，PsiI(2113164.69)，SspI (3041673.285)，HaeⅢ(11519393.34)，AluI(17476414.725)。

4.连接介导荧光PCR(LM-FQPCR)制备标准曲线

(1)制备用于与DNA双链断裂碎片连接的接头：将24bp5’-AGCACTCTCGAG CCTCTCACCGCA-3’和12bp5’-TGCGGTGAGAGG-3’未磷酸化的寡核苷酸 分别用无菌双蒸水溶解后，等摩尔混合，按照以下程序合成接头：95℃3min， 在45min内逐步冷却至25℃，25℃10min。

(2)用T4DNA连接酶将DNA双链断裂碎片与接头连接：

标准品的连接体系为：

标准品 2μl 接头 0.2nmol T4DNA连接酶 2U PEG 2μl 10×T4DNA连接酶缓冲液 2μl

用无菌双蒸水补至20μl

将上述连接体系在22℃孵育1h，连接产物作为荧光定量PCR的扩增模板。

(3)荧光定量PCR进行扩增：反应体系为：

荧光定量PCR的程序设为：72℃7min，使接头中未与DNA双链断裂碎片 连接的12bp寡核苷酸释放，并在DNA聚合酶的作用下补平末端缺口；98℃预 变性2min；98℃变性10s，72℃延伸2min，共35个循环；95℃熔解10s， 60℃1min，温度以0.3％的速率上升，从60℃到95℃收集熔解曲线数据。

6个标准品的Ct值分别为25.62(PmeI)、24.39(EcoRV)、23.64(PsiI)、 23.15(SspI)、19.29(HaeⅢ)、15.95(AluI)(图2)。

(4)标准品荧光定量PCR的反应体系中所含DNA双链断裂碎片数的计算：标准 品荧光定量PCR的反应体系中所含DNA双链断裂碎片＝1μl标准品中DNA双链断 裂碎片数量×2×2/20，公式中的2为使用了2μl标准品与接头进行连接，2/20 代表在20μl的连接体系中取2μl进行荧光定量PCR(FQPCR)；计算得到6个 标准品荧光定量PCR反应体系中所含DNA双链断裂碎片分别为1.03×10⁴(PmeI)、 11.40×10⁴(EcoRV)、42.26×10⁴(PsiI)、60.83×10⁴(SspI)、230.39×10⁴(HaeⅢ)、349.53×10⁴(AluI)。

(5)以6个标准品的Ct值为横坐标，荧光定量PCR的反应体系中所含DNA双 链断裂位点数(即碎片数)为纵坐标，做出标准曲线，通过曲线拟合获得拟合 方程为：DNA双链断裂碎片数＝963.61×10⁴-38.52×10⁴×Ct(R²＝0.989)(图3)。 将待测样本的Ct值代入方程中即可换算得到DNA双链断裂碎片数值。

5.方法学评价

(1)精密度评价

(a)制备含低、中、高DNA双链断裂碎片的样本：用AluI限制性内切酶酶切 DNA碎片阴性精液标本的精子基因组DNA，通过改变AluI限制性内切酶的酶切 时间以获得低、中、高DNA双链断裂碎片的样本。具体操作过程如下：

DNA碎片阴性标本的精子基因组DNA 150ng AluI限制性内切酶 0.01U 10×限制性内切酶酶切缓冲液R 2μl

用无菌双蒸水补至20μl

37℃分别孵育5min、20min、40min，65℃20min灭活AluI限制性 内切酶。

(b)批内重复性是1次对三个DNA双链断裂碎片水平的样本重复检测5次，批 间重复性是连续5天对三个不同DNA双链断裂碎片水平的样本进行检测。含低、 中、高DNA双链断裂碎片样本的批内变异系数分别为2.45％、0.99％和0.67％， 批间变异系数分别为5.65％、1.41％和3.18％。表明重复性好。

(2)正确度性能评价

方法比较试验：收集湖南省妇幼保健院生殖中心精液标本40例，其中健康 男性精液标本20例，不育男性精液标本20例，同时采用中性单细胞凝胶电泳 法和LM-FQPCR法检测。

健康男性组和不育男性组DNA双链断裂碎片是否存在差异用Mann-Whitney U检验分析，采用本发明精子DNA双链断裂碎片标准品定量检测与中性单细胞凝 胶电泳法均显示不育男性DNA双链断裂碎片水平高于健康男性(P＝0.000)，二 种方法进行Spearman相关性检验显示，采用本发明精子DNA双链断裂碎片标准 品定量检测与中性单细胞凝胶电泳的Spearman相关系数为0.83(P＝0.000)，相 关性强(图4)。

6.临床标本的检测

(1)收集临床精液标本40例，其中健康男性精液标本20例，不育男性精液标 本20例。采用试剂盒提取精子基因组DNA，并测定基因组DNA的浓度，调整浓 度至100ng/ml。

(2)制备用于与DNA双链断裂碎片连接的接头：将24bp5’-AGCACTCTCGAG CCTCTCACCGCA-3’和12bp5’-TGCGGTGAGAGG-3’未磷酸化的寡核苷酸 分别用无菌双蒸水溶解后，等摩尔混合，按照以下程序合成接头：95℃3min， 在45min内逐步冷却至25℃，25℃10min。

(3)用T4DNA连接酶将DNA双链断裂碎片与接头连接：

待测样本的连接体系为：

(4)荧光定量PCR进行扩增：反应体系为：

荧光定量PCR的程序设为：72℃7min，使接头中未与DNA双链断裂碎片 连接的12bp寡核苷酸释放，并在DNA聚合酶的作用下补平末端缺口；98℃预 变性2min；98℃变性10s，72℃延伸2min，共35个循环；95℃熔解10s， 60℃1min，温度以0.3％的速率上升，从60℃到95℃收集熔解曲线数据。 以无模板对照(无菌双蒸水)和无T4DNA连接酶对照(连接步骤中未加入T4DNA 连接酶)作为阴性对照。40例精液标本的Ct值在17.97到24.25间。其中，20 例健康男性精液标本的Ct值在20.72到24.25间，20例不育男性精液标本的 Ct值在17.97到21.36间(图5)。通过标准曲线即可计算出待测样品的DNA 双链断裂点数。

本发明实施例关于临床精液标本的检测，并非指本发明用于疾病治疗或诊 断目的，仅仅作为实施例验证本发明的方法能够用于任意已知序列的基因或基 因组DNA双链断裂点数目的检测，包括各种动物、植物或者微生物的DNA双链 断裂的检测。