新型人肿瘤坏死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白

摘要

本发明公开了一种提高重组人TNFR75-Fc融合基因表达量的方法，所述方法包括提高了一种新的SEQ？ID？NO：3所述TNFR75-Fc融合基因；同时提供了一种载体为pCI-gs-TNFR75-Fc；融合基因构建过程中，TNFR75的3’端引物中引入了18个碱基与人IgG1Fc基因片段5’端的18个碱基互补；同时对细胞株的筛选方法及MSX浓度、SEQ？ID？NO：3序列中人可溶性TNFRcDNA和人IgG1重链恒定区Fc段基因片段的制备方法进行了改进，最终提高了融合蛋白表达量。

说明书

本申请是申请号为201010268409.3，申请日为2010.09.01，发明名称为新型人肿瘤坏 死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白的分案申请。

技术领域

本发明属于基因工程制药领域，具体涉及一种新型TNFR-Fc融合基因及其表达产物。

背景技术

类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis，RA)是人类最常见的自身免疫性疾病之一， 患病率约1％，与人类白细胞抗原DR4/DR1明显相关，具有一定的遗传倾向。RA的临床 特征多为手、足、腕、膝、臀等的关节滑膜发炎，最终导致关节损伤。滑膜炎引起大量淋 巴细胞浸润，主要包括巨噬细胞、T淋巴细胞和浆细胞，同时血管增生。关节损伤主要发 生于滑膜与软骨和骨毗邻处。

RA是一种以累及关节为主的系统性自身免疫性疾病。近年来研究表明，肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)是RA发病机制中的关键因子(FeldmannM2001；RavinderNMaini,2001； RavinderNMaini,199),其可刺激机体产生一系列因子，如白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8 和粒细胞集落刺激因子等的产生，并诱导内皮细胞表达黏附分子，吸引白细胞到受累关节。 TNF-α还刺激滑膜巨噬细胞、纤维母细胞、破骨细胞和软骨细胞产生基质金属蛋白酶，并 抑制软骨蛋白聚糖的合成，并可导致滑膜炎症和关节软骨的损伤。阻断TNF-α即可在RA 发病机制的上游阻断炎症反应，达到治疗RA的目的。

肿瘤坏死因子α(TumorNecrosisFactorAlpha，TNFα)和淋巴毒素(Lymphotoxin，LT) 是通过与其共同受体TNFR75和TNFR55结合而发挥生物学作用的。人肿瘤坏死因子受体 75(TNFR75)由461个氨基酸组成，其N-末端235个氨基酸残基，是TNFR75蛋白酶水 解下来的细胞膜外区片段，也称为可溶性TNFR75(sTNFR75)。

大量实验证据表明可溶性TNFR75和TNFR55(即受体的膜外部分)可以通过与TNFα 和LT的有效结合而阻断TNFα和LT在生物体内的生物学作用(Hunns-MartinLorenz,2002； smith，C.A.等(1990)，science，248：1019-1023)，且TNFR75分布更广发，亲和能力更 强。但TNFR半衰期较短。

人IgG类免疫球蛋白半衰期可高达21天，它们是人类血液中最丰富的蛋白质，分为 IgA、IgG、IgM、IgE和IgD，其中IgG有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚型。IgG1Fc 段由232个氨基酸残基组成，包括铰链区、CH2区和CH3区。已有报道说将IgG的Fc绞 链区中的半胱氨酸残基与其他蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋 白，使蛋白质类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现 出与类似同种型的人IgG相当的体内药物动力学特性。

国外已有人借助基因工程手段构建了人TNFRII型受体部分与IgG的Fc片段的融合蛋 白，此蛋白在离体条件下对TNF有中和作用(美国专利5,605,590)。国内也有构建此类融 合蛋白，马菁等在CN1417334A肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及融合蛋白基因 与产物中构建了一种含有linker的融合蛋白；刘昌闾等在CN1502632A新型TNFR-Fc融合 蛋白中构建了一种截短的融合蛋白；徐斌等在CN101003575中利用双顺反子构建了一种人 肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅱ-抗体FC段融合蛋白。

这类药物人源化程度高，引起的免疫原性反应低，治疗效果很好，比单靠止痛药和抗 炎药更有效控制病情。但目前这类治疗药物普遍存在制备方法复杂，表达量低，价格昂贵 等丞待解决的问题。

发明内容

本发明解决的一个问题是提供了一种新型的重组人TNFR75-Fc融合基因，及其表达的 蛋白质产物。

本发明解决的第二个问题是构建了一种含有重组人TNFR75-Fc融合基因片段的重组载 体pCI-gs-TNFR75-Fc，转染哺乳动物细胞后，其真核细胞的扩增标记，可大幅提高目的基 因在宿主细胞中的拷贝数，从而提高目的蛋白的表达量。

本发明解决的第三个问题是，提供了一种含有重组载体pCI-gs-TNFR75-Fc的哺乳动物 细胞，可以稳定表达TNFR75-Fc。所述哺乳动物细胞可以是CHO细胞、NSO细胞等常用 哺乳动物细胞工程细胞株。

本发明解决的第四个问题是通过硫氨甲硫氨酸(MSX)加压扩增筛选，使表达目的蛋 白细胞株表达量提高至少一个数量级，在进行高效表达细胞株筛选时，最终将MSX浓度提 高到400～500μm，筛选单克隆表达量达到20～30pg/cell·24hr。

为解决上述问题，本发明通过如下技术方案来实施：

抽提HL-60细胞株的总RNA，RT-PCR扩增人sTNFR75基因片段；PCR扩增人IgG1Fc 基因片段。采用OverlapextentionPCR技术将两基因片段进行拼接得到编码rhTNFR:Fc融 合蛋白的全长cDNA序列。将获得的该cDNA序列插入克隆中间载体Teasy，经序列测定 证实正确后进行真核表达载体的构建。

rhTNFR:Fc融合蛋白cDNA片段克隆于表达载体，采用脂质体转染技术，将无菌抽提 的重组质粒rhTNFR:Fc/pCI-gs导入CHO细胞中，经MSX加压筛选，得到了高表达量的 rhTNFR:Fc融合蛋白的基因工程单克隆细胞株，在将MSX浓度提高到400～500μm时，筛 选单克隆表达量达到20～30pg/cell·24hr。

本发明通过OVERLAPPCR的方法合成了一种人肿瘤坏死因子受体融合基因 TNFR75-Fc，采用含有GS系统的真核细胞高效表达载体，在哺乳动物细胞中经过MSX加 压筛选使得该融合蛋白的表达量提高了20个百分点，融合蛋白活性提高了8个百分点。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明并不限于下述实施例。

实施例1人可溶性TNFR75cDNA的制备

1、PCR扩增TNFR75cDNA

设计引物A：5’TCAAGCTTATGGCTCCCGTCGCCGTCTGG3’引物B：5’GTCACAAGA TTTGGGCTCGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGC3’，

设计另外一组引物，在引物B中将引入linker序列，该序列(Gly4Ser)3,为一编码15个 氨基酸的疏水性多肽，它们的活动度较好，不影响TNFR和Fc的天然三维结构，其linker 的DNA序列为5’－GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGC GGCAGC－3’。

设计引入linker序列的引物B。引物Linker-B：5’GCTGCCGCCACCGCCGCTTCC GCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCGTC。

以人早幼粒白血病细胞总RNA为模板,分别以引物A和B为模板、以A和Linker-B为 模板，进行RT-PCR反应，94℃变性5min开始循环，94℃30sec，58℃30sec，72℃1min， 共32个循环，最后72℃延伸8min。得到编码sTNFR75和对照sTNFR75-linker的基因片段。

2、PCR产物的鉴定和凝胶回收

将上述条件进行PCR，在琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中目的蛋白分子量大 约800bp的带，将该片段回收。

实施例2人IgG1重链恒定区Fc段基因片段的克隆

设计引物C：5’GAGCCCAAATCTTGTGACGAGCCCAAATCTTGTGACAAA3’，引物D： 5’AGTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA3’；

设计引物linker-C:GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGT GGCGGCAGCGAG。

以IgG1Fc/Teasy载体质粒为模板，分别以C和D为引物、以Linker-C和D为引物,进 行RT-PCR反应，94℃变性5min开始循环，94℃20sec，62℃30sec，72℃2min，共35个循 环，最后72℃延伸10min。扩增得到编码人IgG1Fc和对照linker-IgG1Fc的基因片段。

实施例3TNFR75-Fc融合基因的获得

1、PCR扩增编码rhTNFR-Fc融合蛋白/rhTNFR-linker-Fc的全长基因片段

以sTNFR75PCR扩增产物和人IgG1Fc段PCR扩增产物为模板，以A：5’TCAAGCTTATGGCTCCCGTCGCCGTCTGG3’和D：5’AGTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA3’为 引物，进行RT-PCR反应。

同时以sTNFR75-linkerPCR扩增产物和人linker-IgG1Fc段PCR扩增产物为模板，以 A：5’TCAAGCTTATGGCTCCCGTCGCCGTCTGG3’和D：5’AGTGAATTCTCATTTACCCGG AGACAGGGA3’为引物，进行RT-PCR反应。

RT-PCR扩增反应步骤：94℃变性5min开始循环，94℃40sec，62℃30sec，70℃1min， 共30个循环，最后72℃延伸10min。

扩增得到rhTNFR-Fc和rhTNFR-linker-Fc融合蛋白的全长cDNA片段，其基因片段长 分别为1470bp和1485bp。

2、rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc融合蛋白cDNA克隆于中间载体

rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc融合蛋白cDNAPCR扩增产物与线性Teasyvector (Promega)进行连接反应。连接产物转化E.coli大肠杆菌感受态宿主细胞，涂布于预先加入 X-gal和IPTG的LB平板(含100μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml四环素)上进行蓝白斑筛选。 从转化平板上随机挑选白色单菌落，分别接种增殖，进行质粒快速鉴定，得到TNFR75-Fc和 对照rhTNFR-linker-Fc融合基因。

实施例4TNFR75-Fc/rhTNFR-linker-Fc融合基因的表达

1、rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc融合基因片段克隆于表达载体

rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc融合蛋白表达型重组质粒的构建是利用经商业表达载体 pCI-neo改造的pCI-gs的EcoRI单酶切位点，插入经DNA序列测定结果正确的 rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc基因片段，用Spe1单酶切鉴定插入片段的正反方向，连接产 物转化E.coli感受态细胞，经筛选鉴定后获得rhTNFR-Fc/pCI-gs/E.coliTop10F’和对照 rhTNFR-linker-Fc/pCI-gs/E.coliTop10F’重组菌。

2、表达型重组质粒的大量制备

将携带重组质粒rhTNFR-Fc/pCI-gs/rhTNFR-linker-Fc/pCI-gs的大肠杆菌菌种接种于 200ml液体培养基中，经过夜培养后采用QiagenPlasmidMaxiKits，按照说明书进行重组质 粒的大量制备。所得质粒DNA，经70％乙醇洗涤、无菌风干后，溶解于500μl无菌水中， 取2μl质粒稀释100倍分别检测A260值和A280值，A260/A280的比值在1.75-1.85之间时， 则将该质粒用于细胞转染。

3、细胞株转染

培养瓶中培养两天的CHO细胞用0.25％胰蛋白酶溶液消化后，取适量进行台盼蓝染色 计数，以3×10⁵个细胞数接种6孔板的单孔；细胞接种6孔板24小时后达90％满层，可进行转 染；各取250μlOPTI-MEMI(Gibco)，加入两支无菌离心管中，在两管中分别加入10μl Lipofectamine(Invitrogen)和4μg稀释质粒，将两管中的液体混合至同一管中，室温静置20 分钟使其形成DNA:脂质体复合物；与此同时，吸弃6孔板内的细胞培养基，用细胞生长培 养基(DMEM/F12/10％FCS)轻轻洗涤细胞两次后在各孔中加入2ml细胞生长培养基；将500μl DNA:脂质体复合物溶液加入6孔板中的相应孔中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。

实施例5TNFR75-Fc/TNFR75-linker-Fc融合蛋白高表达细胞株的筛选

将实施例4筛选所得到重组细胞株用0.25％胰蛋白酶溶液消化后，以1:3的比例传入三个 100mm培养皿中培养过夜；24小时后，将100mm培养皿中的培养基更换为选择培养基，即 在含10％透析胎牛血清(GibcoBRL)的DMEM(无谷氨酰胺)培养液中加入终浓度为25μm 的MSX(硫胺甲硫氨酸，Sigma)作为筛选剂；根据细胞死亡情况每隔2－4天更换选择培 养基，约7-10天细胞开始大量死亡，约14天后细胞克隆开始出现，待细胞克隆直径达1-2mm 时用克隆环从平板上挑取单克隆转接入24孔板中，每批转染挑取约50个单细胞克隆。

单细胞克隆在24孔板中长至50-70％满层时，取各克隆的培养上清进行ELISA检测，根 据细胞生长情况及表达量，选取表达量大于1pg/cell·24hr的细胞克隆进行药物加压扩增筛 选；逐步提高筛选剂MSX的浓度使整合于染色体中的重组质粒进行扩增，待药物浓度提高 至500μm时，筛选单克隆表达量达到20～30pg/cell·24hr。取各克隆的培养上清，应用ELISA 方法检测其融合蛋白表达量，总共各挑取单克隆50个进行表达量测定，结果见表1。

表1、表达量对比实验结果

由表1计算可知，通过本发明生产新型重组TNFR75-Fc表达量比对照实验提高了20 个百分点，更有利于该蛋白的扩大生产。

实施例6TNFR75-Fc/TNFR75-linker-Fc融合蛋白活性对比试验

将用筛选出的细胞株表达的融合蛋白TNFR75-Fc/TNFR75-linker-Fc进行Sepharose-A 亲和层析和疏水层析。具体步骤为(1)通过蛋白A亲和层析纯化蛋白，在蛋白A亲和层 析中，蛋白上样时加入1mol/L的尿素，在蛋白的洗脱过程中，洗脱液中也加入1mol/L尿 素的尿素。在低pH约3.5时洗脱下目的蛋白；(2)将(1)所得样品直接通过疏水层析上 样，所用的盐溶液为硫酸铵，所用填料为含有丁基或者苯基的填料。获得纯度大于90％的 融合蛋白。

然后进行活性测定试验。通过rhTNFR-Fc拮抗TNF-α对靶细胞L929细胞株的杀伤来 检测rhTNFR-Fc的生物学活性。

样品活性(AU/ml)＝[标准品ED₅₀(ng/ml)/待测品ED₅₀(ng/ml)]×标准品效价(AU/ml) ×待测样品稀释倍数

结果见表2。

1、取对数生长期的L929细胞，用0.25％胰蛋白酶常规消化后充分分散细胞，每次测 活(1块96孔板)取约2×10⁶细胞，离心弃上清，加入培养液B将细胞培养液的细胞密度 调整至1.5×10⁵/ml后，加入96孔培养板中，0.1ml/孔，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培 养过夜(18～24h)。

2、配制标准品：取一支10μg/ml的TNFR:Fc工作标准品，加入用TNF-α(40U/ml) 稀释的10μg/ml的放线菌素D溶液将其稀释至浓度为500ng/ml。

3、根据待测定样品的蛋白定量，首先用无菌注射用水稀释至1mg/ml，在1.5ml无菌离 心管内用TNF-α(40U/ml)稀释的10μg/ml的放线菌素D溶液逐步稀释至500ng/ml，注意每 次稀释倍数不超过10倍。

4、标准品和供试品的稀释

连续倍比稀释工作标准品或样品的稀释液(即稀释后所有管中含有相同浓度的TNF- α和放线菌D，但TNFR:Fc的浓度不同。下一步加入含等体积培养液的孔中时，实际的稀 释度将是此时的2倍)。

5、每孔加入100μl各种稀释度的样品，每个稀释度3个孔。阴性对照加入用TNF-α 稀释的40U/ml的放线菌素D溶液。阳性对照中加入用无血清RPMI-1640/DMEM(1:1)培 养液稀释的10μg/ml的放线菌素D溶液。

6、5％CO2培养箱中37度培养18-24小时。

7、终点测定：每孔加入40.0μl结晶紫染色液，染色十分钟，用自来水漂洗3～4次， 直至自来水无色。将96孔板尽量拍干，使板内没有残留水分，向96孔板加入脱色液，每 孔100μl，混匀，酶标仪570nm处读取吸收值。结果见表2。

表2、活性对比实验结果

LOGEC50 TNFR-Fc 3.812 TNFR-linker-Fc 3.518

由表2计算可知，在同样蛋白浓度下，TNFR75-Fc比TNFR75-linker-Fc的蛋白活性提 高了8个百分点。