山核桃miR398a在降低植物重金属胁迫耐受性中的应用

摘要

本发明公开了山核桃miR398a在降低植物重金属胁迫耐受性中的应用。通过敲除山核桃的miR398a基因，有望增强山核桃的重金属胁迫的耐受性，并使研究人员进一步了解植物受金属胁迫的耐受性。

说明书

技术领域

本发明涉及基因功能领域，更具体地涉及在降低植物重金属胁迫 耐受性中的应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动植物中，含有茎环 结构的miRNA前体,经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子 (18-25个核苷酸)。miRNA通过在转录水平或者转录后水平对基因组 上的靶基因抑制其翻译或者切割靶基因来调控基因表达，在基因表达 中起负调控其靶基因作用。

在已知的众多参与植物抗逆过程的miRNA中，miR398a是第一 个被发现受逆境胁迫负调控的miRNA。miR398a靶向两种Cu/Zn过 氧化物歧化酶(CSD)：细胞质CSD1和叶绿CSD2。CSD是植物抵御 活性氧(ROS)毒害的主要超氧化物歧化酶(SOD)，这暗示miR398a可 能在氧化胁迫响应中发挥作用。

发明内容

本发明提供了山核桃miR398a在降低植物重金属胁迫耐受性中 的应用。

山核桃miR398a在降低植物重金属胁迫耐受性中的应用，所述 山核桃miR398a的碱基序列如SEQIDNO.1所示。

优选地，所述重金属是Cu²⁺或Zn²⁺。

优选地，所述植物是拟南芥或烟草。

优选地，所述植物是拟南芥。

获得山核桃miR398a转基因植株方法包括：将包含所述山核桃 miR398a的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥， 筛选、培养和获得转基因株系。

由于山核桃miR398a本身序列很短，只有21个bp，而其前体序 列相对较长，连接到载体上，有利于转化实现，优选地，所述前体基 因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。

本发明公开了山核桃miR398a在降低植物重金属胁迫耐受性中 的应用。通过敲除山核桃的miR398a基因，有望增强山核桃的重金 属胁迫的耐受性，并使研究人员进一步了解植物受金属胁迫的耐受 性。

附图说明

图1为山核桃花芽的总RNA

图2为山核桃miR398a前体的中间载体菌液PCR检测

图3为山核桃miR398a前体的表达载体菌液PCR检测

图4为山核桃miR398a转基因拟南芥植株的抗性筛选

图5为野生型和山核桃miR398a转基因型拟南芥的叶绿素荧光 测定图

图6为野生型和山核桃miR398a转基因型拟南芥的叶绿素荧光 测定指标：A非光化学淬变；B光化学淬变；C电子传递速率D PSII原初光化学效率；E有效量子产量

图7为野生型和山核桃miR398a转基因型拟南芥的保护酶测定 指标：A过氧化氢酶活性；B过氧化物岐化酶活性；C超氧化物 岐化酶活性

具体实施方式

1.材料

1.1实验材料

山核桃花芽采自浙江省杭州市临安板桥村，选取不同株山核桃树 进行采样。样品采下后立即液氮保存，带回实验室并放置在-80℃冰 箱保存待用。

1.2实验试剂与仪器

DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol 试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶 回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。PCR仪为美国 PE9700PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。

1.3引物合成及测序

引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.方法

2.1山核桃花芽总RNA的提取

采用改良CTAB+Trizol法提取花芽样品总RNA，步骤如下：

(1)在10mL离心管中加入3mL65℃预热的CTAB提取缓冲液(10％ CTAB，10％PVP40，1.0MTris-HCl(pH8.0)，5MNaCl，0.6MEDTA(pH 8.0))，加入200μLβ-巯基乙醇；

(2)取-70℃保存的花芽2g，放入液氮充分预冷的研钵中，于液氮 中充分研磨至百色粉末；

(3)将白色粉末迅速转入预热的提取液中，立即充分振荡混匀，65℃ 水浴30min，期间振荡3-4次；

(4)在混合物中加入等体积的25:24:1(酸性饱和酚：氯仿：异戊醇)， 约3ml。混合均匀后14000rpm离心10min(常温)；

(5)取上清转入新的10ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇 (24:1)上下颠倒混匀，12000rpm4℃离心10min后取上清；

(6)重复步骤4一次，直至中间层消失；

(7)上清转移至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇后放置于 -20℃冰箱冷冻30min。12000rpm4℃离心10min弃掉上清，沉淀加入 65℃预热好的SSTE400μL溶液至全溶；

(8)溶液中加入1mLTRIzol试剂，室温静置5min。再加入200μL 氯仿摇匀，室温静置2-3min；

(9)4℃12000rpm离心15min；

(10)吸取上清，加入等体积异丙醇，室温静置10min；

(11)4℃12000rpm离心10min，弃掉上清，肉眼可见RNA沉于管 底；

(12)加入1mL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，8000rpm4℃ 离心5min，弃掉上清；

(13)重复步骤11，并将沉淀真空干燥7-10min；加入适量DEPC 水溶解沉淀，-80℃保存备用。

2.2cDNA合成

使用TAKARA试剂盒PrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesis Kit，详细内容如下：

(1)在经过DEPC处理过的PCR管中配置下列反应体系:

(2)65℃保温5min，冰上迅速冷却。(模板RNA变性)

(3)再次配置反应体系如下：

(4)缓慢摇匀。

(5)42℃反应30-60min。

(6)95℃5min酶失活后，冰上冷却。

2.3前体序列的引物设计

依据山核桃的miR398a前体序列： ACGGAAGTACTGAGGTGTAGTACATTTTTTTAGGTAAA GTACTGATTTAAAAGTGTTGCTGTGGCTATATAACATGGAATATC TTTCTCCATTGGCATCACCAGATTGTGGGGAAAGAGGCAAGAA AGTCGTGTAAATTAAAGGTGGATGAGCCTTACAGGGGCAACAT GAGATCACATGTGGGCATTCTTATTATTCACATGACACCCTTTCT GCTTGTGTTCATGTGTCCTATAGACTACAAATGTGTTCTCAGGTC GCCCCTGCAGGACTTTCCTCCACCGCATGATCATGATCATGGTG ATGCAATCGGCTTGATGGTTTTAAGCTGGCAATAATCATAGCTTA ATAGCCAGGTCAGCAAGGTCATCTTCCCCAACTCCTTTCCAAAT CCCACCGATCATGAGATGGCCTTTGACACTACTTTCCTTTAATGG ATTTCTCTTGCTGGGTGAGAAGGTCTGTCACAGATGCGAT，使用 PrimerPrimer5.0设计引物，引物两端分别加上酶切位点KpnI和 XbaI，正向引物：5’-GGGGTACCAATATCTTTCTCCATTGGCATC-3’ 反向引物：5’-GCTCTAGAATCGCATCTGTGACAGACCTTC-3，，克隆 所需序列。

2.4PCR扩增反应

以山核桃cDNA为模板扩增，反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s， 72℃延伸1min。30个循环后，72℃延伸10min。PCR反应完成后4℃ 暂时保存，其中退火温度可根据Tm值进行调整。

2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收

将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 TAE(40mMTris-乙酸盐，1mMEDTA)，核酸燃料为EB。紫外光检测 电泳结果并回收PCR产物。利用上海生工公司的DNA胶回收试剂盒 进行胶回收，具体步骤如下：

(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开， 用干净的手术刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入 1.5mL离心管中。每个胶块尽量不要超过400mg，否则将会导致溶胶 不完全。另外切胶过程应尽可能快，从而减少DNA在紫外线中暴露 时间来降低对DNA的损伤。

(2)根据胶块的质量和浓度，每100mg琼脂糖加300～600μL的比例 加入BufferB2。

(3)置于55℃金属浴10min，期间混匀2～3次直至胶块完全溶化为 止。

(4)当目的片段＜500bp时，可加入1/3体积的BufferB2的异丙醇， 混匀。若≥500bp，则此步骤可以省略。

(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,000xg离心30s。倒掉收 集管中的液体，并将吸附柱放入同一个收集管中。

(6)加入500μLWashSolution，9000xg离心30s。再次倒掉收集管 中的液体。

(7)重复一次步骤6。

(8)将带有收集管的吸附柱放入离心机，9000xg空离1min。扔掉 收集管，并将吸附柱置于灭过菌的1.5mLEP管中。

(9)打开吸附柱的盖子，室温放置10min。为了去除残留的酒精， 否则会严重影响回收得率和后续实验结果。

(10)在吸附膜中央加入15-30μLddH2O。室温静置5min，9000xg 离心1min。1.5mLEP管底部收集的DNA溶液即为回收的DNA，-20℃ 保存。

2.6DNA回收片段与PMD-19T载体连接

根据PMD19-T载体使用说明书，在灭过菌的PCR反应管中将 Vector与回收DNA片段进行T-A克隆连接，反应体系如下：

轻轻混匀后16℃过夜连接10h以上，转化DH5α感受态。

2.7连接产物转化DH5α感受态

转化感受态具体操作步骤如下：取出适量DH5α感受态细胞并至 于冰上冻融。在超净工作台内向冰冷的感受态细胞中加入上述连接混 合液，并用移液器吸头轻轻吸打混匀。置于冰上20min。快速平稳放 入42℃水浴中60s(热激，使细胞膜开放，重组质粒进入细胞)，并迅 速放入冰水混合物中，保持2min(使细胞膜关闭)。加入500μL无抗 LB液体培养基，37℃恒温振荡培养1h。室温下4000rpm离心5min， 弃掉上清(保留少许培养基，约50μL)。超净台内，用枪头轻轻吸打并 重悬菌液，涂于氨苄抗性平板。倒置琼脂平板于37℃恒温箱，平板 通常在37℃温育14h。

2.8重组子的筛选和鉴定

用10μL小号枪头挑取平板上至少5个单菌落(每个菌落均做好标 记)，并置于含有800μLLB培养基(含相应抗生素)的1.5mLEP管中， 37℃振荡培养4h左右至培养基浑浊，并对培养基浑浊的菌样进行菌 检验证，菌检验证载体构建成功的菌液取1mL送上海生工测序。利 用BLAST、CLUSTAL、MEGA4.0等软件对序列进行分析。

2.9表达载体的构建

将测序获得完全正确的序列，提取质粒后用KpnⅠ和XbaⅠ双酶 切中间载体和表达载体pCAMBIA13011(pC13011)，再用T4连接酶 连接经过双酶切的pC13011载体和miRNA398a前体片段，然后转化 到大肠杆菌中提取质粒酶切验证。

2.10转化农杆菌

2.10.1电击杯的处理

(1)用移液枪吸取ddH₂O反复冲洗电击杯3-5次。

(2)用75％的乙醇反复冲洗电击杯3-5次。

(3)将电击杯浸泡在无水乙醇中2h，然后倒掉乙醇，置于超净工 作台中让残余酒精挥发。

(4)酒精挥发完全后，盖好电击杯盖子，室温保存备用。

2.10.2电转化

采用仪器为伯乐公司GenePμLserXcell电穿孔仪进行感受态细胞 的转化。主要参数为：电脉冲2.5μF、电压2.5kV、电阻200Ω。操作 步骤如下：

(1)取出保藏的农杆菌GV3101感受态细胞放置冰上融化。

(2)取1μL质粒加入到解冻的感受态细胞中，轻轻混匀。

(3)将混合液加到电击杯中(-20℃预冷)，在电脉冲为2.5μF、 电压2.5kV、电阻200Ω的参数条件下电击。

(4)取出电击杯，迅速加入800μL预热的无抗的YEP液体培养基， 悬浮细胞后，转移到1.5mL的离心管中。

(5)28℃，220rpm震荡培养2h左右。

(6)取30-40μL菌液，用无菌的涂布棒将菌液均匀的涂在含有相 应抗生素YEP平板上，倒置放入28℃培养箱培养2-3天。

2.10.3电转化农杆菌及其检测

将酶切验证正确的pC13011-miRNA398a质粒转化到农杆菌 GV3101中，再从农杆菌中提取质粒后，转化到大肠杆菌中提质粒， 酶切验证。验证正确的含有pC13011-miRNA398a质粒的农杆菌， -70℃保存菌种。

2.11拟南芥遗传转化及其转基因植株纯合子的筛选

2.11.1拟南芥的种植

(1)将野生型拟南芥种子均匀撒在1/2MS固体培养基中。

(2)4℃冰箱避光春化处理3天。

(3)3天后，移至培养室培养，条件为温度23℃，光强7000-9000 Lx，光照16小时，黑暗8小时。

(4)待拟南芥长出2片子叶和2片真叶后，将其移植到含基质的 盆中，继续培养。

2.11.2拟南芥的遗传转化

(1)农杆菌菌液的准备：配制含有卡那霉素和利福平的YEP固体 培养基，倒平板，划线以活化保存的农杆菌，28℃倒置培养2天。 挑单菌落至1mL含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2 天，再转移至100mL相同的培养基中扩大培养，直至培养液浑浊变 为橙色，测其OD值达到1.2时停止培养。

(2)4000rpm，离心10min，倒掉上清液，用浸染介质悬浮菌体。

(3)浸花法转化拟南芥

a.选取开花初期的拟南芥，将花序浸入含有目的基因农杆菌的转 化介质中，约10-20秒。

b.将浸染过的拟南芥植株平放于一个大容器中，避光培养24小 时。

c.第二天，放置正常条件下继续培养。

d.收获拟南芥种子，干燥。

2.11.3拟南芥转基因种子的筛选及种植

(1)将转基因种子均匀撒在1/2MS的固体培养基中(培养基中潮 霉素的浓度为50mg/L)。同时将野生型拟南芥种子撒在不含潮霉素培 养基中，作为对照。

(2)4℃避光春化处理3天。

(3)3天后将撒有野生型拟南芥种子的培养皿打开，置于培养室 中正常培养，而含有转基因种子的培养皿则避光培养。

(4)48小时后，将含有转基因种子的培养皿置于光下正常培养。 转基因成功的植株就会生长，反之不生长。

(5)待拟南芥长出2-4片真叶后，移植到含有泥炭的盆中，继续 培养。

(6)观察对照拟南芥(野生型拟南芥)和山核桃miR398a转基因 拟南芥的生长情况。

2.12铜胁迫处理

实验采用土培盆栽的方法，于2015年4月-6月在浙江农林大学 智能温室进行。实验中所用的是规格相同的硬质营养钵。保证每盆含 土0.06kg，在实验处理之前做好日常养护和病虫害防治工作，保证土 壤水分充足。盆下面垫一个直径略大于盆底的塑料托盘，防治水肥的 流失。拟南芥种植参照2.11.1，移栽两周缓苗结束后挑选生长健壮且 外形较一致的幼苗添加CuSO₄溶液进行铜胁迫处理。实验材料为转 山核桃miR398a拟南芥，野生型拟南芥作为对照。试验中完全随机 摆放各盆，共设置5个处理：CK，125mgkg-1，250mgkg-1，375mg kg-1，500mgkg-1，每个处理设3次重复，每个重复6株幼苗。处 理2周后进行叶绿素荧光及保护酶测定。

3.实验结果

3.1山核桃花芽总RNA提取分析

利用改良CTAB+TRizol法提取山核桃花芽总RNA，并通过紫外 分光光度计测定每个RNA样品260nm及280nm的吸光度，并以此 计算RNA的浓度及纯度，并在1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整 性。所提山核桃RNA的光密度比值均在2.0-2.2之间，说明总RNA 基本无糖类、酚及蛋白质的污染；电泳结果则显示RNA样品的18s 和28s两条带非常清晰，可推断RNA没有降解，符合下步实验的要 求(见图1)。

3.2山核桃miR398a前体序列的克隆

根据所设计的引物序列，使用PCR扩增，产物经连接到 pMD19-T，菌检PCR进行检测(见图2)，并送到上海生工测序，验 证了山核桃miRNA398a的前体存在。

3.3山核桃miRNA398a功能验证

依据3.2中所获得前体序列，进行表达载体的构建，将miRNA398a 前体序列连接到pC13011表达载体上，转化到DH5α感受态细胞中， 同时对其进行菌液PCR检测(图3)，将连接成功的单克隆提取质粒， 转化到土壤农杆菌GV3101中，进行拟南芥转基因。对山核桃miR398a 转基因植株进行抗性筛选(如图4)，将筛选到的转基因株系进行种 植，直至纯合后，进行铜胁迫处理。根据图5可以看出，随着处理铜 浓度的增大，野生型与转基因植株出现了不同程度的伤害，而在同一 浓度下，转基因植株的伤害较野生型严重。根据荧光测定指标非光化 学淬变(NPQ)及光化学淬变(qP)，野生型的植株在同一浓度处理下 高于转基因植株，表明受到胁迫后转基因植株保护性降低；根据表观 电子传递速率(ETR)及有效量子产量(Y(II))值，说明转基因植 株受到胁迫后，光合速率降低；PSII原初光能转化效率(Fv/Fm)值 说明转基因植株受到铜胁迫处理后受害严重(图6)。依据植物保护 酶测定指标发现，在受到胁迫后转基因植株指标值均小于野生型，转 基因植株保护酶上升速率小于野生型(图7)。综上可知，转入 miRNA398a基因使得植株的抗逆性受到严重破坏，说明转入山核桃 miRNA398a基因降低植物的抗重金属耐受性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。