一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株

摘要

本发明提供一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstonia？solanacearum)，于2015年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC？No.10693。该菌株FJAT-aRS01纯度高、且生物学性状稳定，能够有效防治作物青枯病，为有效地研发青枯病植物疫苗来预防作物青枯病害发生提供了可能。

说明书

【技术领域】

本发明属于生物领域，具体涉及一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株。

【背景技术】

作物青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的毁灭性土传病害，防治困难。利用无致病力青枯雷尔氏菌研发青枯病植物疫苗来预防作物青枯病具有良好的应用前景。在植株苗期接种病原弱株系----无致病力青枯雷尔氏菌，经侵入、定殖，在植株体内与致病菌形成营养和位点竞争，构建植株体内微生态平衡，诱导植株产生抗病能力，从而阻止病原菌的漫延，抑制病害发生。

青枯雷尔氏菌在自然状态下菌株致病力分化严重，出现不同致病力菌株混杂现象，经继代培养和回接植株也经常会出现菌株致病力分化现象；青枯雷尔氏菌这种特性使得利用其病原弱株系作为植物疫苗在生产上应用存在很大风险。菌株纯度高、生物学性状稳定是其作为细菌类疫苗优良菌种应具备的重要条件；传统的细菌分离技术很难分离纯化青枯雷尔氏菌，获得高纯度的菌株。不同致病力青枯雷尔氏菌细胞表面组分不同，所带电荷也不同，其与离子交换树脂的吸附能力不同，而目前尚未见到如下的相关报道：利用细菌色谱系统可实现青枯雷尔氏菌菌株的纯化分离，以获得高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种高纯度无致病力的青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstoniasolanacearum)，于2015年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.10693。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

本实验室在色谱柱饱和吸附范围内，将从番茄青枯病发病田块的健康植株中分离到的一株无致病力的青枯雷尔氏菌FJAT-1957进行细菌色谱纯化，得到3个不同的色谱峰，收集其中主峰(出峰时间为1.1min)的洗脱液，并将该洗脱液梯度稀释后涂布于TTC培养基，且于30℃培养2d，培养获得的菌株进行理化特性与分子学鉴定，最终确定其为青枯雷尔氏菌菌属的一个菌株。

本发明的有益效果在于：提供一种青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstoniasolanacearum)，该菌株纯度高、且生物学性状稳定，能够有效防治作物青枯病，为有效地研发青枯病植物疫苗来预防作物青枯病害发生提供了可能。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1是本发明实施例2与实施例5中PCR产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图。

图2是本发明实施例4中的细菌色谱图。

图3是本发明实施例7中的细菌色谱图。

【具体实施方式】

本发明中青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstoniasolanacearum)是从番茄青枯病发病田块的健康植株中分离到的一株无致病力的青枯雷尔氏菌FJAT-1957(Ralstoniasolanacearum)经细菌色谱纯化收集到的主峰洗脱液进行梯度稀释后涂布培养得到的菌株；通过对该菌株进行致病性鉴定及继代培养与纯度检测则证明其为高纯度的无致病力菌株。

为了对本发明进行详细阐述说明，申请人给出了如下具体实施例。

实施例1菌株FJAT-1957的分离

(1)从福建省福鼎市蕉宕村绿禾成盛有限公司番茄种植大棚青枯病发病田块健康植株中称取番茄茎部5g并用清水冲洗干净，且将冲洗后的番茄茎部剪成小块组织；接着在无菌操作条件下，将小块组织依次采用75％酒精处理30s、10％次氯酸钠消毒8min、无菌水漂洗3遍；之后采用榨汁机将小块组织打碎以获得组织液，然后吸取1mL组织液进行梯度稀释，选用稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7；

(2)取步骤(1)获得的稀释液200μL涂布于TTC平板上，然后将TTC平板置于30℃下培养2d；

(3)将步骤(2)培养获得的菌株重新划线接种于TTC培养基上，并将TTC培养基置于30℃条件下培养48h，将培养获得的菌株命名为菌株FJAT-1957。

实施例2菌株FJAT-1957的鉴定：

初步鉴定：

将所获得菌株FJAT-1957的菌落置于LeicaM165FC高级电动荧光体视显微镜下进行镜检观察，观察结果显示，菌株FJAT-1957的菌落形态为表面较干燥，无流动性，中间为暗红色，且白边较窄的菌株，因此，可初步认定菌株FJAT-1957属于青枯雷尔氏菌菌属。

进一步鉴定：

菌株FJAT-1957的活化：用接种环将所获得菌株FJAT-1957划线于TTC培养基上，并将TTC培养基置于恒温培养箱中培养48h，培养温度为30℃；得菌株FJAT-1957的单菌落；

制备种子液：将所获得的菌株FJAT-1957的单菌落接种于20mL的SPA液体培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，恒温振荡摇床的温度设定30℃、转速设定170rpm/min；得种子液；

基因组DNA的提取：取所得的种子液1mL于已灭菌的1.5mL离心管中，并按照Promega试剂盒说明书操作以提取菌株FJAT-1957的基因组DNA；

PCR鉴定：委托生物工程(上海)有限公司利用DNA合成仪合成正向引物pehA#6(如SEQIDNO：1所示)：5'-ATCGGACTTGATGCGCAGGCCGTT-3'；反向引物pehA#3(如SEQIDNO：2所示)：5'-CAGCAGAACCCGCGCCTGATCCAG-3'。

以提取所获得的菌株FJAT-1957的基因组DNA为模板，且以上述引物(pehA#6/pehA#3)为引物对进行PCR反应，并以现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000为阳性对照：

PCR反应体系(25μL)：10×Buffer2.5μL，10mmol/LdNTPs0.5μL，dH₂O18.7μL，10mmol/L正向引物1μL，10mmol/L反向引物1μL，2.5UTaq酶，25ngDNA模板；

PCR反应程序为：96℃预变性1min；接着96℃变性30s，70℃退火30s，72℃复性1min，重复2个循环；然后94℃变性30s、70℃退火30s、72℃复性1min，重复33个循环；最后72℃下延伸5min。

PCR产物的检测：将PCR产物点样于1.5％的琼脂糖凝胶，以100bpDNALadderMarker作为标准分子量，80V电压、1倍TAE缓冲液中电泳1h，EB染色，即进行凝胶电泳分离检验，电泳分离检验结果如图1(图1中，M为DNAladder；1为菌株FJAT-1957；CK+为阳性对照GMI1000；CK-为双蒸水空白对照)所示，由图1可知，菌株FJAT-1957同标准菌株GMI1000一样，均在504bp位置扩增出单一条带，即确认该菌株FJAT-1957与标准菌株GMI1000同属于同一菌属。

依据上述的鉴定，最终确认菌株FJAT-1957属于青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)菌属的一个菌株。

上述青枯雷尔氏菌菌株FJAT-1957(Ralstoniasolanacearum)于2015年07月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.11058。

实施例3菌株FJAT-1957的致病性试验

设置实验组、阴性对照组和阳性对照组，在实验组中，菌株FJAT-1957经TTC平板活化后，接种于SPA液体培养基中，于170r/min、30℃下培养48h，将培养所得菌液稀释至10⁸cfu/mL，接着将菌液稀释液伤根接种于5-6叶龄的番茄盆栽苗上(每盆种植1株番茄苗)，接种量为80mL/株，共接种番茄苗30株；而阴性对照组以清水代替菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液；阳性对照组以现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000的菌液稀释液代替菌株FJAT-1957的菌液稀释液；之后将各组处理后的番茄苗放置于光照培养箱中培养(每天光培养12h、暗培养12h，温度30±2℃，相对湿度95％)，每天统计各组中番茄苗的死亡率，共观察10d。

实验结果如下表1所示，阳性对照组在伤根接种第4d植株开始发病，接种7d后发病率达到100％，植株萎蔫，死亡；实验组伤根接种后，在观察期(10d)植株不发病；阴性对照组在观察期内植株均不发病；因此，通过试验表明，菌株FJAT-1957为无致病力的菌株。

表1各处理组番茄苗发病情况

实施例4菌株FJAT-1957的细菌色谱纯化及高纯度菌株FJAT-aRS01的获得

(1)将菌株FJAT-1957置于TTC平板上活化后，之后转接于SPA液体培养基中，并于30℃，200r/min下摇床培养24h；将摇床培养所得菌液于5000r/min、4℃下离心10min，去上清液，沉淀物用超纯水洗涤2次后，再经过2000r/min离心2min，获得菌体浓度比较均一的青枯雷尔氏菌色谱分析样品；

(2)将获得的青枯雷尔氏菌色谱分析样品进入色谱分离系统，进液量为20μL，ToyopearlTskgelSuperQ-650C填充色谱柱，流速1mL/min，泵压的范围为0.5-1.5MPa，温度范围为23-28℃；

(3)样品上样后，0-5min用A液(0.02mol/L盐酸哌嗪，pH8.0)平衡，使样品充分吸附到树脂上；5-35min线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％-75％NaCl(1mol/L)，A液由100％转换为25％，B液(0.02mol/L哌嗪盐酸+1mol/LNaCl，pH8.0)由0％转换为75％；35-45minB液转换为100％，将树脂上的残余细菌全部洗出；

(4)样品经上述洗脱后，采用紫外检测器检测样品的出峰情况，检测波长为260nm。

(5)样品洗脱后经紫外检测所得色谱图如图2所示，由图2可知，出现了3个不同色谱峰，分别为主峰P1、次峰P2和次峰P3；将主峰P1的洗脱液进行回收，并进行系列梯度稀释后涂布于TTC平板，于30℃下培养2d，挑取平板上的单菌落进行纯化培养，为了方便描述，将纯化培养所得的菌株命名为菌株FJAT-aRS01，且于20％甘油、-80℃下保存。

实施例5该菌株FJAT-aRS01的鉴定

形态学的鉴定：

对菌株FJAT-aRS01的主要形态进行鉴定，得到该菌株FJAT-aRS01的主要形态如下：菌落为圆形，无流动性，中间为暗红色，白边窄，菌落表面干燥。

分子学的鉴定：

a、菌株活化：用接种环将菌株FJAT-aRS01划线于TTC培养基上，并将TTC培养基置于恒温培养箱中培养48-72h，培养温度为30℃；

b、制备种子液：将步骤a所获得的菌株FJAT-aRS01的单菌落接种于20mL的SPA培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，恒温振荡摇床的温度设定30℃、转速设定170rpm/min，得种子液；

c、基因组DNA的提取：取种子液1mL于已灭菌的1.5mL离心管中，并按照Promega试剂盒说明书操作以提取菌株FJAT-aRS01的基因组DNA；

d、PCR鉴定：以提取所获得的菌株FJAT-aRS01的基因组DNA为模板，且以上述实施例2中的引物(pehA#6/pehA#3)为引物对进行PCR反应，并以现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000为阳性对照：

PCR反应体系(25μL)：10×Buffer2.5μL，10mmol/LdNTPs0.5μL，dH₂O18.7μL，10mmol/L正向引物1μL，10mmol/L反向引物1μL，2.5UTaq酶，25ngDNA模板；

PCR反应程序为：96℃预变性1min；接着96℃变性30s，70℃退火30s，72℃复性1min，重复2个循环；然后94℃变性30s、70℃退火30s、72℃复性1min，重复33个循环；最后72℃下延伸5min。

PCR产物的检测：将PCR产物点样于1.5％的琼脂糖凝胶，以100bpDNALadderMarker作为标准分子量，80V电压、1倍TAE缓冲液中电泳1h，EB染色，即进行凝胶电泳分离检验，电泳分离检验结果与实施例2的一致，即如1所示，则确认该菌株FJAT-aRS01同样与标准菌株GMI1000同属于同一菌属。

依据上述的鉴定，最终确认菌株FJAT-aRS01属于青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)菌属的一个菌株。

实施例6该菌株FJAT-aRS01的致病性试验

设置实验组、阴性对照组和阳性对照组，在实验组中，菌株FJAT-aRS01经TTC平板活化后，接种于SPA液体培养基中，于170r/min、30℃下培养48h，将培养所得菌液稀释至10⁸cfu/mL，接着将菌液稀释液伤根接种于5-6叶龄的番茄盆栽苗上(每盆种植1株番茄苗)，接种量为80mL/株，共接种番茄苗30株；而阴性对照组以清水代替菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液；阳性对照组以现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000的菌液稀释液代替菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液；之后将各组处理后的番茄苗放置于光照培养箱中培养(每天光培养12h、暗培养12h，温度30±2℃，相对湿度95％)，每天统计各组中番茄苗的死亡率，共观察10d。

实验结果与实施例3的一致，即如上表1所示，阳性对照组在伤根接种第4d植株开始发病，接种7d后发病率达到100％，植株萎蔫，死亡；实验组伤根接种后，在观察期(10d)植株不发病；阴性对照组在观察期内植株均不发病；因此，通过试验表明，本发明菌株FJAT-aRS01为无致病力的菌株。

实施例7该菌株FJAT-aRS01的继代培养和纯度检测

(1)菌株FJAT-aRS01的继代培养：将菌株FJAT-aRS01划线于TTC培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养48-72h，挑取单菌落转接于另一TTC培养基上，共继代培养至30代；

(2)菌株FJAT-aRS01的纯度检测：利用细菌色谱分离菌株FJAT-aRS01继代培养至30代所得的纯培养物，具体操作参照“实施例4该菌株FJAT-aRS01的细菌色谱纯化”，其所得的色谱图如图3所示。

由图3可知，该菌株FJAT-aRS01继代培养30代后的纯培养物经细菌色谱分离出单一峰P1，从而说明该菌株FJAT-aRS01为纯的菌株；即结合实施例5与实施例6的检测结果，表明该菌株FJAT-aRS01为一株纯的无致病力菌株。

实施例8该菌株FJAT-aRS01的防效试验

将菌株FJAT-aRS01经TTC平板活化后，接种于SPA液体培养基中，于170r/min、30℃下培养48h，将培养所得菌液稀释至10⁸cfu/mL，得菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液，待用；将现有公认的青枯雷尔氏菌标准菌株GMI1000进行同样操作制备得菌株GMI1000的菌液稀释液，待用；

设置实验组和阳性对照组，在实验组中，将菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液伤根接种于5-6叶龄的番茄盆栽苗上，3d后再接种菌株GMI1000的菌液稀释液，两次接种的接种量均为80mL/株，共接种30盆；阳性对照组以清水代替菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液，即将清水伤根接种于5-6叶龄的番茄盆栽苗上，3d后再接种菌株GMI1000的菌液稀释液；将接种后的番茄苗放置于光照培养箱(每天光培养12h、暗培养12h，温度30±2℃，相对湿度95％)，每天观察番茄植株的发病情况，观察期为21天，统计处理番茄植株的发病率和防效。

发病率＝(发病株数/接种株数)×100％

防效＝[(对照组发病率-实验组发病率)/对照组发病率]×100％

试验结果如表2所示，阳性对照组在接种菌株GMI1000的菌液稀释液的第4d植株开始发病，番茄植株出现萎蔫症状，并随时间推移日益严重，至第7d发病率达100％；而先接种菌株FJAT-aRS01的菌液稀释液、3d后再接种菌株GMI1000的菌液稀释液处理的实验组番茄植株在接种菌株GMI1000的菌液稀释液后21天观察期内均未发病。统计对照组发病率达100％时，实验组的发病率为0，则防效为100％。

表2实验组和对照组番茄发病情况

需要说明的是，在本发明中，TTC平板与TTC培养基的组分均为：10g蛋白胨、1g水解酪蛋白、5g葡萄糖、18g琼脂和0.05g2,3,5-氯化三苯基四氮唑，用蒸馏水定容至1L；SPA液体培养基的组分为：20g蔗糖、5g蛋白胨、0.5gKH₂PO₄和0.025gMgSO₄，用蒸馏水定容至1L。

综上，本发明提供一种青枯雷尔氏菌菌株FJAT-aRS01(Ralstoniasolanacearum)，该菌株纯度高、且生物学性状稳定，能够有效防治作物青枯病，为有效地研发青枯病植物疫苗来预防作物青枯病害发生提供了可能。