蛋白质fogac在调控尖孢镰刀菌古巴专化型对香蕉植株毒力中的应用

摘要

本发明公开了fogac蛋白质在调控尖孢镰刀菌古巴专化型对香蕉植株毒力中的应用。所述fogac蛋白质的氨基端序列如序列表中序列3所示。本发明还公开了一种调控尖孢镰刀菌古巴专化型对香蕉植株毒力的方法，包括如下步骤(a1)或(a2)或(a3)：(a1)调控尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的fogac蛋白质的水平；(a2)调控尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码基因的表达水平；(a3)调控尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码基因的转录水平。实验证明，fogac蛋白质可调控尖孢镰刀菌古巴专化型对香蕉植株毒力。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及蛋白质fogac在调控尖孢镰刀菌古巴专化型 对香蕉植株毒力中的应用。

背景技术

尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)属于半知菌亚门真 菌，是一种引起香蕉枯萎病的病原菌。该真菌从根部侵入香蕉植株，造成维管束堵塞， 叶片黄化，植株萎蔫和香蕉绝收。由该菌引起的香蕉枯萎病是一种毁灭性病害，植株 一旦发病只能铲除，而且该菌可在土壤中长期存活，这使该病害防治十分困难。该病 害在全世界香蕉种植区均有发生，而且正不断蔓延和扩展。目前，防治由尖孢镰刀菌 古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)引起的枯萎病，采用多菌灵、咪鲜 胺等杀菌剂效果普遍不够理想。采用新型杀菌剂和选育抗病或耐病品种是今后香蕉枯 萎病防治的主要方法。对香蕉枯萎病菌致病基因的研究可以帮助了解其致病机理，为 该病的防治提供理论依据。

蛋白质fogac是尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白α亚基之一，G蛋白(Gprotein) 的全称为鸟苷酸结合蛋白(guaninenucleotide-bindingprotein)，是由α、β、 γ等3个不同的亚单位构成的异聚体，具有结合GTP或GDP的能力。研究发现，在真 菌中，G蛋白α亚基参与生长、发育、细胞交配、次生代谢物合成等生物学过程。但 在在尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)中，G蛋白α亚 基的功能尚无相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控尖孢镰刀菌古巴专化型对香蕉植株毒力。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种fogac蛋白质，所述fogac蛋白质的氨 基酸序列可如序列表中序列3所示。

所述fogac蛋白质在调控尖孢镰刀菌古巴专化型对香蕉植株毒力中的应用属于本 发明的保护范围。

为解决上述问题，本发明提供了一种调控尖孢镰刀菌古巴专化型对香蕉植株毒力 的方法。

本发明所提供的调控尖孢镰刀菌古巴专化型对香蕉植株毒力的方法，可包括如下 步骤(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)调控尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的fogac蛋白质的水平；

(a2)调控尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码 基因的表达水平；

(a3)调控尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码 基因的转录水平。

为解决上述问题，本发明还提供了一种筛选尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂的方法。

本发明所提供的一种筛选尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂的方法，可包括如下步骤 (b1)或(b2)或(b3)：

(b1)以尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的fogac蛋白质为靶点对 待检测物质进行筛选，将得到的抑制所述fogac蛋白质的待检测物质作为候选的尖孢 镰刀菌古巴专化型杀菌剂；

(b2)以尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码基 因为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制所述编码基因表达的待检测物质作为 候选的尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂；

(b3)以尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码基 因为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制所述编码基因转录的待检测物质作为 候选的尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂。

为解决上述问题，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定尖孢镰刀菌古巴专化型候 选杀菌剂的方法。

本发明所提供的一种鉴定或辅助鉴定尖孢镰刀菌古巴专化型候选杀菌剂的方法， 可包括如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)检测待测物质能否降低尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的 fogac蛋白质的水平，如所述待测物质能降低所述尖孢镰刀菌古巴专化型中所述fogac 蛋白质的水平、则所述待测物质为候选的所述尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂，如所述 待测物质不能降低所述尖孢镰刀菌古巴专化型中所述fogac蛋白质的水平、则所述待 测物质为非候选的所述尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂；

(c2)检测待测物质能否抑制尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的 fogac蛋白质的编码基因的表达，如所述待测物质能抑制所述尖孢镰刀菌古巴专化型 中所述编码基因的表达、则所述待测物质为候选的所述尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂， 如所述待测物质不能抑制所述尖孢镰刀菌古巴专化型中所述编码基因的表达、则所述 待测物质为非候选的所述尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂；

(c3)检测待测物质能否抑制尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表中序列3所示的 fogac蛋白质的编码基因的转录，如所述待测物质能抑制所述尖孢镰刀菌古巴专化型 中所述编码基因的转录、则所述待测物质为候选的所述尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂， 如所述待测物质不能抑制所述尖孢镰刀菌古巴专化型中所述编码基因的转录、则所述 待测物质为非候选的所述尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂。

具有d1)和/或d2)和/或d3)功能的物质在制备尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂 中的应用也属于本发明的保护范围：

d1)降低序列表中序列3所示的fogac蛋白质水平；

d2)降低序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码基因的表达；

d3)降低序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码基因的转录。

具有e1)和/或e2)和/或e3)功能的物质在制备抗尖孢镰刀菌古巴专化型的香 蕉植株中的应用也属于本发明的保护范围：

e1)降低序列表中序列3所示的fogac蛋白质水平；

e2)降低序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码基因的表达；

e3)降低序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码基因的转录。

上述任一所述编码基因可为序列表中序列2所示的DNA分子。

上述任一所述香蕉可为如下f1)-f5)中的任一种：f1)芭蕉科植物；f2)巴西 蕉；f3)巴西蕉品种Musaspp.AAAgroupcv.Brazil；f4)粉蕉；f5)粉蕉品种Musa spp.AABgroupcv.Fenjiao。

本发明还提供了一种制备重组菌的方法。

本发明所提供的一种制备重组菌的方法，可包括如下步骤：敲除尖孢镰刀菌古巴 专化型的基因组中的序列表中序列3所示的fogac蛋白质的编码基因，得到致病力低 于所述尖孢镰刀菌古巴专化型的重组菌。

上述制备重组菌的方法中，所述敲除尖孢镰刀菌古巴专化型的基因组中的蛋白质 fogac的编码基因可通过同源重组实现的。所述同源重组为通过导入特异片段实现的。 所述特异片段可含有上游同源臂和下游同源臂，所述上游同源臂的核苷酸序列可为序 列表的序列1自5'末端第233位至第776位所示的DNA分子，所述下游同源臂的核苷 酸序列可为序列表的序列1自5'末端第3213位至第4082位所示的DNA分子。

所述特异片段的制备方法具体可为：(1)将质粒pCT74的KpnI识别序列和Xho I识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列序列表的序列1自5'末端第233位至第 776位所示的DNA分子，EcoRI识别序列和BamHI识别序列间的DNA小片段替换为 核苷酸序列是序列表的序列1自5'末端第3213位至第4082位所示的DNA分子，得到 重组质粒pCT-fogac；(2)将重组质粒pCT-fogac用限制性内切酶KpnI和BamHI 酶切，回收约4.4kb的DNA片段，即为特异片段。

上述任一所述特异片段也属于本发明的保护范围。

实验证明，fogac蛋白质可调控尖孢镰刀菌古巴专化型对香蕉植株毒力。Δfogac 为突变体菌株，可降低尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense) 菌株B2中fogac蛋白质的编码基因的表达；Δfogac+fogac为互补体菌株，可恢复Δ fogac中fogac蛋白质的编码基因的表达。结果表明，接种Δfogac的巴西蕉病情指数 (3.0)显著低于接种尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense) 菌株B2的巴西蕉病情指数(55.0)，而接种Δfogac+fogac的巴西蕉病情指数(50.3) 与接种尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)菌株B2的 巴西蕉病情指数无显著差异(55.0)；接种Δfogac的粉蕉的病情指数(3.2)显著低 于接种尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)菌株B2的 粉蕉病情指数(28.7)，而接种Δfogac+fogac的病情指数(26.5)与接种尖孢镰刀 菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)菌株B2的粉蕉病情指数(28.7) 无显著差异。可见，Δfogac对巴西蕉或粉蕉的毒力显著下降，Δfogac+fogac可使Δ fogac的毒力恢复。

附图说明

图1为基因敲除质粒pCT-fogac部分结构示意图

图2为验证引物的起始扩增位置示意图。

图3为fogac基因敲除突变体及其互补体的PCR鉴定结果。

其中，泳道1为以fogac基因敲除突变体的基因组DNA为模板，用引物对1进行 PCR扩增；泳道2为以fogac基因敲除突变体的互补体的基因组DNA为模板，用引物 对1进行PCR扩增；泳道3为以B2菌株的基因组DNA为模板，用引物对1进行PCR 扩增；泳道4为以fogac基因敲除突变体的基因组DNA为模板，用引物对2进行PCR 扩增；泳道5为以fogac基因敲除突变体的互补体的基因组DNA为模板，用引物对2 进行PCR扩增；泳道6为以B2菌株的基因组DNA为模板，用引物对2进行PCR扩增； 泳道7为以fogac基因敲除突变体的基因组DNA为模板，用引物对3进行PCR扩增； 泳道8为以fogac基因敲除突变体的互补体的基因组DNA为模板，用引物对3进行PCR 扩增；泳道9为以B2菌株的基因组DNA为模板，用引物对3进行PCR扩增。

图4为fogac基因敲除突变体及其互补体的RT-PCR验证结果。

其中，泳道1为以B2菌株cDNA为模板，用引物对4或actin引物对进行PCR扩 增；泳道2为以fogac基因敲除突变体的cDNA为模板，用引物对4或actin引物对进 行PCR扩增；泳道3为以fogac基因敲除突变体的互补体的cDNA为模板，用引物对4 或actin引物对进行PCR扩增。

图5为fogac基因敲除突变体及其互补体的菌落形态。

图6为fogac基因敲除突变体及其互补体在巴西蕉中的致病性比较。

其中，“WT”为接种尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense) 菌株B2的巴西蕉植株发病指数，“Δfogac”为接种fogac基因敲除突变体的巴西蕉 植株发病指数，“Δfogac+fogac”为接种互补fogac基因的互补体的巴西蕉植株发病 指数，CK为对照。

图7为fogac基因敲除突变体及其互补体在粉蕉中的致病性比较。

其中，“WT”为接种尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense) 菌株B2的粉蕉植株发病指数，“Δfogac”为接种fogac基因敲除突变体的粉蕉植株 发病指数，“Δfogac+fogac”为接种互补fogac基因的互补体的粉蕉植株发病指数， CK为对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense) 菌株B2和质粒pCT74(郭立佳等.尖孢镰刀菌古巴专化型fgb1敲除突变体的构建与 表型分析[J].热带作物学报，2014，35(11)：2205-2210.)，公众可从中国热带农 业科学院(即申请人处)获得，以重复本申请实验。尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)菌株B2在下文中简称B2菌株。

质粒pSilent-Dual1(Nguyen,Q.B.,Kadotani,N.,Kasahara,S.,Tosa,Y., Mayama,S.&Nakayashiki,H.(2008)Systematicfunctionalanalysisof calcium-signallingproteinsinthegenomeoftherice-blastfungus, Magnaportheoryzae,usingahigh-throughputRNA-silencingsystem.Molecular microbiology,68:1348-1365.)可从FungalGeneticsStockCenter(USA)获取， 序列登录号GenBank:AB512772.1。

下述实施例中的HDCloningPlus为Clontech公司产品。

下述实施例中的巴西蕉具体为巴西蕉品种(Musaspp.AAAgroupcv.Brazil)，粉 蕉具体为粉蕉品种(Musaspp.AABgroupcv.Fenjiao)，均购于中国热带农业科学院组 培中心。

STC溶液：溶质及其浓度为：1.2M山梨醇，50mM氯化钙，10mMTris-Cl；溶剂 为水；pH7.5。

PTC溶液：溶质及其浓度为：40％(质量体积比)聚乙二醇3350，50mM氯化钙， 10mMTris-Cl；溶剂为水；pH7.0。

下述实施例中涉及的培养基如下：

PDB液体培养基：将200g马铃薯削皮并切成小块，然后加入1L水，煮沸30min， 纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖15g，定容至1L，pH7.0±0.1，121℃高压灭菌 15min。

PDA固体培养基：向上述PDB液体培养基加入琼脂至其含量为20g/L得到的培 养基。

再生培养基1：将200g马铃薯削皮并切成小块，然后加入1L水，煮沸30min， 纱布过滤，向滤液中加入蔗糖174g，琼脂9g，定容至1L，pH7.0±0.1，121℃ 高压灭菌15min，冷却至60℃时加入潮霉素，使潮霉素在体系中的浓度为50μg/ml。

再生培养基2：将200g马铃薯削皮并切成小块，然后加入1L水，煮沸30min， 纱布过滤，向滤液中加入蔗糖174g，琼脂9g，定容至1L，pH7.0±0.1，121℃ 高压灭菌15min，冷却至60℃时加入G418(也称为Geneticin，遗传霉素)，使 G418在体系中的浓度为50μg/ml。

实施例1、fogac基因的功能验证

一、载体构建

1、基因敲除载体的构建

基因敲除载体的构建步骤如下：

(1)引物的设计与合成

根据序列表中序列1所示的fogac基因序列，设计并合成引物LF、LR、RF和RR， LF、LR、RF和RR的序列信息见表1。其中LF(含限制性酶KpnI酶切位点)和LR (含限制性酶XhoI酶切位点)为扩增fogac基因左臂的引物，RF(含限制性酶EcoR I酶切位点)和RR(含限制性酶BamHI酶切位点)为扩增fogac基因右臂的引物。

表1.PCR引物序列信息

引物名称 序列信息5'-3' LF 5'-ggggtaccCAAGGTTTCGCTATTTGACA-3' LR 5'-ccgctcgagGGGTAGACAAGAGAAAGAGAT-3' RF 5'-cggaattcGCATTCCTATGGCTTCTGT-3' RR 5'-cgggatccTGATACGGTCTGAGAGTGT-3' P1 5'-GGATTGGATGTGGATGTGATGG-3' P2 5'-CGTTGCAAGACCTGCCTGAA-3' P3 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3' P4 5'-AGTTCAACGATACTCGGTCTC-3' P5 5'-ATGGGCGCATGCATGAGCTCG-3' P6 5'-AAGAATGCCCGAGTCCTTAAG-3'

fogac-RT-F 5'-GTTCTGGCGAGAGTGGCAAGTC-3' fogac-RT-R 5'-TTCGGCGGAATCCATGAGGTAGA-3' actin-F 5'-CCAAGTCCAACCGTGAGAAGATGA-3' actin-R 5'-CCAGAGTCCAGAACGATACCAGTG-3'

注：下划线标注为限制性酶切位点。

(2)以B2菌株基因组DNA为模板，采用LF和LR组成的引物对进行PCR扩增， 得到约540bp的PCR扩增产物。

(3)用限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切步骤(2)得到的PCR扩增产物，回 收酶切产物。

(4)用限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切质粒pCT74，回收约6kb的载体骨 架。

(5)将步骤(3)得到的酶切产物与步骤(4)得到的载体骨架连接，得到重组质 粒pCT74-L。

(6)用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切重组质粒pCT74-L，回收约6.5kb 的载体骨架。

(7)以B2菌株基因组DNA为模板，采用RF和RR组成的引物对进行PCR扩增， 得到约870bp的PCR扩增产物。

(8)用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切步骤(7)的PCR扩增产物，回收 酶切产物。

(9)将步骤(8)得到的酶切产物与步骤(6)得到的载体骨架连接，得到约7.4 kb的重组质粒pCT-fogac。

重组质粒pCT-fogac部分结构示意图见图1。对重组质粒pCT-fogac进行结构描 述如下：将质粒pCT74的KpnI识别序列和XhoI识别序列间的DNA小片段替换为核苷 酸序列是序列表的序列1自5'末端第233位至第776位所示的DNA分子，EcoRI识 别序列和BamHI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列1自5' 末端第3213位至第4082位所示的DNA分子，得到重组质粒pCT-fogac。

用限制性内切酶KpnI和BamHI酶切重组质粒pCT-fogac，回收约4.4kb的DNA片段。

2、基因互补载体的构建

基因互补载体的构建步骤如下：

(1)引物的设计与合成

根据序列表序列1所示的fogac基因序列，设计并合成引物F和R(下划线为与 质粒pSilent-Dual1具有15个相同的碱基序列)。F和R的序列信息如下：

F：5'-ggttctcgaggtcgaCTTTAGAGTCAAACACGACAAGGT-3'

R：5'-caagctggcagtcgaTACTCTTTTCGGAAGGGGGTTGC-3'。

(2)以B2菌株基因组DNA为模板，以F和R为引物进行PCR扩增，得到双链DNA 分子。

(3)用限制性内切酶SalI单酶切质粒pSilent-Dual1，回收大片断线性化的质 粒pSilent-Dual1。

(4)利用HDCloningPlus，将步骤(2)得到的双链DNA分子与步 骤(3)得到线性化的质粒pSilent-Dual1发生重组，得到重组质粒pSD-fogac。

根据测序结果，对重组质粒pSD-fogac进行结构描述如下：向质粒pSilent-Dual1 的SalI酶切位点中插入核苷酸序列是序列表的序列1自5'末端第215位至第2941位 所示的DNA分子，得到重组质粒pSD-fogac。

二、获得fogac基因敲除突变体

获得fogac基因敲除突变体的步骤如下：

1、B2菌株原生质体的制备

(1)将B2菌株接种于PDB液体培养基，置于28℃、180r/min摇床震荡培养5天， 然后用六层灭菌擦镜纸过滤菌液去除菌丝体，得到B2孢子液。

(2)向装有PDB液体培养基的三角瓶(250mL三角瓶装液量为150mL)接入步骤 (1)制备的B2孢子液4ml(实际应用中3-5ml均可)，26℃(实际应用中27℃±1℃ 均可)、110r/min培养10h(实际应用中10h-15h均可)，用三层灭菌擦镜纸过滤收 集菌丝体。

(3)用0.8M氯化钠水溶液洗涤步骤(2)收集的菌丝体，然后用三层灭菌擦镜纸 过滤收集，并用滤纸将菌丝体压干。

(4)向离心管中加入0.1g步骤(3)制备的菌丝体和4-6mL酶解液(向0.8M氯化钠 水溶液中加入崩溃酶，使崩溃酶在体系中的浓度为20mg/mL)。26℃(实际应用中27℃ ±1℃均可)、100r/min酶解3h(实际应用中3h-4h均可)。

(5)完成步骤(4)后，向离心管中加入0.8M氯化钠水溶液且总体积小于45ml， 用三层灭菌擦镜纸过滤，然后收集原生质体于50mL的离心管中。

(6)将离心管在常温、4000r/min离心15min，弃上清，再用STC溶液洗涤，离心， 弃上清，收集的原生质体用STC溶液充分悬浮至浓度为0.5×10⁸个/mL(实际应用中0.5 ×10⁸-1×10⁸个/mL均可)。

(7)将步骤(6)制备的原生质体分装于2mL的离心管中，每管200μl。

2、DNA转化

向上述步骤1中(7)的离心管中加入2μg(实际应用中2μg-4μg均可)步骤一 回收的DNA片段，室温放置20分钟，然后加入1.2mLPTC溶液，室温静置20分钟，然后 再将其加入100mL(实际应用中100mL-150mL均可)冷却至45℃的再生培养基1，混匀， 铺平板。28℃培养4天(实际应用中4天-6天均可)。将得到转化子进行单孢分离纯化 后，进行下一步PCR扩增鉴定。

3、fogac基因敲除突变体的PCR鉴定

提取上述步骤2中转化子的基因组DNA并作为模板，用引物对1、引物对2或引 物对3进行PCR扩增。引物对1由P1和P2组成，引物对2由P3和P4组成，引物对 3由P5和P6组成。P1、P2、P3、P4、P5和P6起始扩增位置见图2，引物的序列信息 见表1。

按照上述方法，将步骤2中转化子的基因组DNA替换为B2菌株的基因组DNA，其 它步骤均相同，作为对照。

结果判定如下：以转化子的基因组DNA为模板，如果用引物对1进行PCR扩增显 示1.6kb的条带、用引物对2进行PCR扩增显示1.7kb的条带和用引物对3进行PCR 扩增不显示1.3kb的条带，则转化子即为fogac基因敲除转化子，否则为异位整合转 化子或B2菌株。

PCR鉴定结果如图3(图3中泳道1、泳道3、泳道4、泳道6、泳道7和泳道9) 所示：用引物对1进行PCR扩增，转化子Δfogac可检测到1.6kb的目的条带，而 B2菌株则不能检测到1.6kb的目的条带；用引物对2进行PCR扩增，转化子Δfogac 可检测到1.7kb的目的条带，而B2菌株则不能检测到1.7kb的目的条带；用引物对 3进行PCR扩增，转化子Δfogac不能检测到1.3kb的目的条带；而B2菌株可检测到 1.3kb的目的条带。结果表明，转化子Δfogac为fogac基因阳性敲除突变体。

4、fogac基因敲除突变体的RT-PCR验证

提取上述步骤3中转化子Δfogac的总RNA，然后反转录为cDNA并作为模板，用 引物对4或actin引物对进行RT-PCR扩增。引物对4由fogac-RT-F和fogac-RT-R 组成，actin引物对由actin-F和actin-R组成。fogac-RT-F、fogac-RT-R、actin-F 和actin-R的序列信息见表1。引物对4的靶基因为序列表中的序列2自5'末端第125 位至第458位所示的DNA分子。

按照上述方法，将步骤3中转化子Δfogac的总RNA替换为B2菌株的总RNA，其 它步骤均相同，作为对照。

结果判定如下：以转化子Δfogac的cDNA为模板，如果用引物对4进行RT-PCR 扩增不显示344bp的条带、用actin引物对进行RT-PCR扩增显示130bp的条带，则 转化子Δfogac即为fogac基因敲除转化子，否则为异位整合转化子或B2菌株。

RT-PCR鉴定结果如图4(图4中泳道1和泳道2)所示：用actin引物对进行RT-PCR 扩增，转化子Δfogac能检测到130bp的目的条带，而B2菌株也能检测到130bp的 目的条带；用引物对4进行RT-PCR扩增，转化子Δfogac不能检测到344bp的目的条 带，而B2菌株能检测到344bp的目的条带。结果表明，转化子Δfogac为fogac基因 敲除突变体，以下简称Δfogac。

将经过步骤3和步骤4鉴定的fogac基因敲除突变体接种于PDB液体培养基培养， 得到孢子悬浮液，将孢子悬浮液与20％(体积百分比)甘油水溶液等体积混合，置于 -70℃保存。

三、fogac基因敲除突变体的互补体的获得

(1)fogac基因敲除突变体的互补体的获得

将步骤二中的DNA片段1替换为步骤一中的重组质粒pSD-fogac，将B2菌株替换 为fogac基因敲除突变体，再生培养基1替换为再生培养基2，重复步骤二中1至4， 得到互补转化子。

(2)互补转化子的PCR鉴定

提取上述步骤(1)中互补转化子的基因组DNA并作为模板，用步骤二中3的引物 对1、引物对2或引物对3进行PCR扩增。

结果判定如下：以互补转化子的基因组DNA为模板，如果用引物对1进行PCR扩 增显示1.6kb的条带、用引物对2进行PCR扩增显示1.7kb的条带和用引物对3进行 PCR扩增显示1.3kb的条带，则互补转化子即为阳性互补转化子。

互补转化子的PCR鉴定结果如图3(图3中泳道2、泳道5和泳道8)所示：用引 物对1进行PCR扩增，互补转化子Δfogac+fogac可检测到1.6kb的目的条带，而B2 菌株则不能检测到1.6kb的目的条带；用引物对2进行PCR扩增，互补转化子Δ fogac+fogac可检测到1.7kb的目的条带，而B2菌株则不能检测到1.7kb的目的条 带；用引物对3进行PCR扩增，互补转化子Δfogac+fogac可检测到1.3kb的目的条 带；而B2菌株可检测到1.3kb的目的条带。结果表明，互补转化子Δfogac+fogac为 互补体。

(3)互补转化子的RT-PCR验证

提取上述步骤(2)中互补转化子Δfogac+fogac的总RNA，然后反转录为cDNA 并作为模板，用步骤二中4的引物对4或actin引物对进行RT-PCR扩增。

如果以引物对4为引物，显示约344bp的条带，且用actin引物对进行PCR扩增， 显示约130bp的目标条带，则该互补转化子即为互补了fogac基因的阳性互补体，否 则为假阳性互补转化子。互补体的RT-PCR鉴定实验结果见图3。

结果判定如下：以互补转化子Δfogac+fogac的cDNA为模板，如果用引物对4进 行RT-PCR扩增显示344bp的条带、用actin引物对进行RT-PCR扩增显示130bp的条 带，则互补转化子Δfogac+fogac即为互补fogac基因的阳性互补体，否则为假阳性 互补转化子。

RT-PCR鉴定结果如图4(图4中泳道3)所示：用actin引物对进行RT-PCR扩增， 互补转化子Δfogac+fogac可检测到130bp的目的条带，而B2菌株可检测到130bp 的目的条带；用引物对4进行RT-PCR扩增，互补转化子Δfogac+fogac可检测到344bp 的目的条带，而B2菌株可检测到344bp的目的条带。结果表明，互补转化子Δ fogac+fogac为互补fogac基因的互补体，以下简称Δfogac+fogac。

四、菌落形态学观察

将待测菌株(B2菌株、Δfogac和Δfogac+fogac)在PDA固体培养基上划线培 养36h，然后用体式显微镜(SZX7，Olympus)观察单菌落形态并拍照，结果见图5(图 5左图为B2菌株，中图为Δfogac，右图为Δfogac+fogac)，结果表明Δfogac、Δ fogac+fogac和B2菌株在菌落形态上没有明显变化。

五、致病力比较

分别检测待测菌株(B2菌株、Δfogac和Δfogac+fogac)对香蕉植株(巴西蕉 苗或粉蕉苗)的致病力，实验重复三次，取平均值。

将待测菌株单菌落接种于300mLPDB液体培养基，28℃、180rpm培养7天。 离心收集菌体，用无菌水重悬得到待测菌株孢子液，用血球计数板将待测菌株孢子 液浓度调至1×10⁷个/mL。随机选取30株香蕉植株(株高约30cm)，在其根部接种 上述待测菌株孢子液(每株植株根系接种50mL孢子液)，处理后按照日常栽培管理方 法培养；将待测菌株孢子液替换为无菌水，其它步骤均相同，作为空白对照。从待测 植株根系接种待测菌株孢子液或无菌水后开始计时，培养30天后，将香蕉植株球茎中 间纵向切开，观察球茎的褐变程度，评价待测菌株的致病力，统计病情指数。

评价待测菌株的致病力，按照如下分级标准进行：0级，球茎无褐变；1级，球茎 褐变，球茎褐变面积占球茎总面积的20％以下；2级，球茎褐变，球茎褐变面积占球茎 总面积的20％至40％(不含20％，含40％)；3级，球茎褐变，球茎褐变面积占球茎总 面积的40％至60％(不含40％，含60％)；4级，球茎褐变或者待测植株死亡，其中球 茎褐变面积占球茎总面积的60％以上(不含60％)。

病情指数的计算公式为：病情指数＝100×∑(香蕉植株发病级数×对应株数)/(香 蕉植株发病最高级数×总株数)。

统计结果表明(图6)，接种Δfogac的巴西蕉病情指数(3.0)显著低于接种B2 菌株的巴西蕉病情指数(55.0)，而接种Δfogac+fogac的巴西蕉病情指数(50.3)与 接种B2菌株的巴西蕉病情指数无显著差异(55.0)。统计结果还表明(图7)，接种Δfogac 的粉蕉的病情指数(3.2)显著低于接种B2菌株的粉蕉病情指数(28.7)，而接种Δ fogac+fogac的病情指数(26.5)与接种B2菌株的粉蕉病情指数(28.7)无显著差异。 可见，由于fogac基因的缺失，导致Δfogac对巴西蕉或粉蕉的毒力显著下降，Δ fogac+fogac可使Δfogac的毒力恢复，获得与B2菌株同等的毒性。