分泌胞外物质溶藻的溶藻微生物的高通量筛选方法

摘要

本发明属于微生物技术领域，涉及一种高通量的筛选溶藻微生物的方法。包括1）、菌落的连续批量传代；2）、藻类的双层平板制备；3）、菌落溶藻效果的高通量检测与溶藻菌的分离。本发明方法替代基于传统接种针/环的常规筛选技术，对于提高溶藻微生物的筛选效率具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种高通量的筛选溶藻微生物的方法。

背景技术

由于水体富营养化蓝藻水华的频繁爆发,造成严重的生态破坏及巨大的经济损失,而且产生的蓝藻毒素给人类的健康带来极大的隐患。微生物方法控制有害藻类以其安全、环保、有效,已备受人们的广泛关注。分泌胞外溶藻物质的溶藻微生物在使用时无需向水体中接种活菌，故无外来种入侵的风险（生态安全），溶藻范围较广（效果稳定），代表了溶藻微生物技术发展的主要方向。

目前，从环境中分离筛选溶藻微生物的过程包括：1、先通过至少3轮的平板划线（采用接种针/环实现）才能获得纯的溶藻微生物菌落；2、对分离得到的每一株纯化菌株均需通过专门的溶藻试验才能初步确定该纯化菌株的溶藻能力。综上所述，分离筛选溶藻微生物至少要对溶藻微生物连续培养4代，在此过程中，仅有不到1%的菌株能始终保持溶藻活性，如此低的效率意味着超过99%的人力、物力和时间的消耗是不能得到回报的！因此，研发溶藻微生物的高通量筛选技术，替代基于传统接种针/环的常规筛选技术，对于提高溶藻微生物的筛选效率具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种溶藻微生物的高通量筛选方法。

使用的接种影印工具，包括圆盘状、同样大小的底板、中间板和面板，它们通过边缘上均匀分布的四根不锈钢螺丝固定，在四根不锈钢螺丝外套铜螺柱，底板、中间板、面板的中心与一手柄通过螺母固定连接；在中间板和面板上有1448个小孔，有10~1448根平头不锈钉穿过中间板和面板的小孔，且钉头在底板和中间板之间可上下移动。

筛选溶藻微生物的样品为水库底泥，具体过程包括如下步骤：

1）、底泥菌悬液的制备

称取1g底泥加到锥形瓶中，然后加入50ml灭菌的生理盐水，再加入玻璃珠，置于摇床中，25℃，160r/min震荡lh，然后静置备用。

2）、平板影印接种菌

取底泥菌悬液倒入清洁的灭菌培养皿内，用所述接种影印工具沾取菌悬液后放置于事先制备好的高氏一号固体平板上，盖上平皿盖25℃倒置培养；

3）、平板影印传代

待平板中菌落明显但又尚未黏连融合时，采用无菌操作，用同一接种影印工具沾染原平板上对应的菌落，再转印于另一个含有高氏一号培养基的平板上面进行传代，盖上平皿盖25℃倒置培养，如此重复传代5~8代（传代过程中将淘汰掉大量溶藻效果不稳定的菌落）；将原代平板于4℃保藏待用；

4）、双层平板制备：

底层平板：将预培养的3mL铜绿微囊藻FACHB905和融化并冷却到7ml50℃的BG11培养基混均后迅速倾注到10cm培养皿中形成底层平板；

上层平板：待底层平板凝固后，在底层平板上倾注融化并冷却至50℃的高氏一号培养基，10mL/皿，待上层培养基凝固后，将平板置于25℃，光照强度620lux，光暗比12h:12h的光照培养箱中倒置培养3天；

5）、溶藻微生物菌落识别：

用接种影印工具将将步骤3）所得的最后一代子代菌落平板的影印于双层平板上，将平板置于25℃，光照强度620lux，光暗比12h:12h的光照培养箱中倒置培养观察1~5天，记录有抑藻圈出现的菌落，在原代平板上挑取同一菌落采用平板划线法分离纯化溶藻微生物；

6）、纯化后的溶藻微生物溶藻效果检测：

将纯化后的菌落接种至高氏一号液体培养基，25℃，150r/min振荡培养3天后，按1:10（V/V）接种至对数期的铜绿微囊藻FACHB905藻液中，光照培养箱25℃，光照强度2000lx，光暗比12h：12h培养3~5天，观察藻的生长情况。对照组为将高氏一号液体培养基按1:10（V/V）添加至藻液中。

本发明方法与传统方法的对比如下：

附图说明

图1，接种影印工具结构示意图。

图2，原代平板，显示接种效果。

图3，子代平板，显示影印效果。

图4，藻类生长良好的双层平板。

图5，出现抑藻圈的双层平板，显示溶藻效果。

图6，液体溶藻试验效果对比，左边试验组，右边对照组。

具体实施方式

1、材料

藻种：铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa，FACHB905），来源于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。藻种活化后于光照培养箱25℃，光照强度2000lx，光暗周期为12h：12h进行培养，每天定时振荡3-4次。

分离微生物的样品来源：来自湖北省某水库的底泥。

培养基

1）放线菌分离培养基（高氏一号）：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，NaCl0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄0.5g，FeSO₄0.01g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH=7.2。用于传代的固体培养基琼脂粉含量为1.6％，用于双层平板的固体培养基琼脂糖含量为0.6％。

2）藻种培养基（BG11）：NaNO31.5g，K₂HPO₄·3H₂O0.04g，MgSO₄·7H₂O0.075g，CaCl₂·2H₂O0.036g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁0.006g，EDTA·Na₂0.001g，Na₂CO₃0.02g，A5液1mL，蒸馏水999mL，固体培养基琼脂糖含量为0.6％。其中，A5液：H₃BO₃2.86g，MnCl₂·H₂O1.81g，ZnSO₄·7H₂O0.222g，CuSO₄·5H₂O0.079g，Na₂MoO₄·2H₂O0.39g，Co(NO₃)₂·6H₂O0.049g，蒸馏水1L。

接种影印工具：包括圆盘状、同样大小的底板、中间板和面板，它们通过边缘上均匀分布的四根不锈钢螺丝固定，在四根不锈钢螺丝外套铜螺柱，底板、中间板、面板的中心与一手柄通过螺母固定连接；在中间板和面板上有1448个小孔，有10~1448根平头不锈钉穿过中间板和面板的小孔，且钉头在底板和中间板之间可上下移动。

中间板与底板的距离是4mm。

中间板与面板的距离是8mm。

所述底板、中间板、面板厚1.6mm，直径95mm。

平头不锈钉长30±1mm，直径1mm。平头不锈钉10~1448根，根据微生物菌落大小自由调节，为避免菌落互相黏连融合同时兼顾分离效率，菌落较大时针数应较少，菌落较小时针数应较多。

2、底泥菌悬液的制备

称取1g底泥加到锥形瓶中，然后加入50ml灭菌的生理盐水，再加入玻璃珠，置于摇床中，25℃，160r/min震荡lh，然后静置备用。

3、平板影印接种菌（制备原代平板）

取在121℃的温度下灭菌的10cm培养皿放入洁净工作台中紫外线照射30分钟，取底泥菌悬液>10mL倒入清洁的灭菌培养皿内，用接种影印工具沾取菌悬液后放置（依靠工具的自身重力，无需按压）于事先制备好的高氏一号固体平板（10cm培养皿）上，用记号笔在接种影印工具定位孔对应的培养皿边缘做定位孔标记，盖上平皿盖25℃倒置培养。

4、平板影印传代（制备子代平板）

待平板中菌落长到适当大小（菌落明显但又尚未黏连融合），采用无菌操作，用同一接种影印工具的定位孔对准培养皿上的定位孔标记，放下接种影印工具（依靠工具的自身重力，无需按压），钢针针头上将沾染原平板上对应的菌落，再转印于另一个含有高氏一号培养基的平板上面进行传代（依靠工具的自身重力放置即可，同时做定位孔标记），盖上皿盖25℃倒置培养，如此重复传代5~8代；影印完成后，将原代平板于4℃保藏待用。

5、双层平板制备：

底层平板：将预培养的3mL铜绿微囊藻FACHB905和融化并冷却到7mL50℃的BG11培养基（凝固剂为0.6％琼脂糖）混均后迅速倾注到10cm培养皿中形成底层平板。

上层平板：待底层平板凝固后，在底层平板上倾注融化并冷却至50℃的高氏一号培养基，10ml/皿，待上层培养基凝固后，将平板置于25℃，光照强度620lux（过高的光强将产生大量气泡，从而不利于后期识别抑藻圈），光暗比12h:12h的光照培养箱中倒置培养3天。

6、溶藻微生物菌落识别：

用接种影印工具将最后一代子代平板的菌落影印于双层平板上（方法同步骤4），将平板置于25℃，光照强度620lux，光暗比12h:12h的光照培养箱中倒置培养观察1~5天，记录有抑藻圈出现的菌落，在原代平板上挑取同一菌落采用常规平板划线法分离纯化溶藻微生物。

7、纯化后的溶藻微生物溶藻效果检测：

将纯化后的菌落接种至高氏一号液体培养基，25℃，150r/min振荡培养3天后，按1:10（V/V）接种至对数期的铜绿微囊藻FACHB905藻液中，光照培养箱25℃，光照强度2000lx，光暗比12h：12h培养3~5天，观察藻的生长情况。对照组为将高氏一号液体培养基按1:10（V/V）添加至藻液中。