一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方及其培养方法

摘要

本发明涉及一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方及其培养方法。包括外植体选择与灭菌，培养基灭菌、愈伤组织诱导，愈伤组织继代增殖四个步骤。黄芪植物愈伤组织培养方法采用黄芪叶片为外植体，在MS基本培养基中加入麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、琼脂粉、海藻酸钠、萘乙酸、6-苄基嘌呤等构成的培养基中进行组织培养，得到黄芪叶片愈伤组织。调培养基pH值，配制好的愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代增殖培养基分别装在三角形培养瓶中，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.10~0.15MPa下灭菌后进行愈伤组织培养。本发明可实现对黄芪叶片愈伤组织的有效诱导和快速增殖，在较短时间内获得大量黄芪叶片愈伤组织，具有生产周期短、增殖速度快的特点，适合工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及植物愈伤组织培养方法，特别是一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方及其培养方法。

背景技术

黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge)为豆科(Leguminosaesp.)黄芪属(AstragalusLinn.)植物，黄芪含皂甙、蔗糖、多糖、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素。黄芪具有较高的药用价值，生用黄芪，有益气固表、利水消肿、脱毒、生肌的功效，适用于自汗、盗汗、血痹、浮肿、痈疽不溃或溃久不敛等症。蜜炙黄芪有补气、养血、益中功效，适用于内伤劳倦、脾虚泄泻、气虚、血虚、气衰等症。现代药理研究表明，黄芪具有增强机体免疫功能，强心降压、降血糖、利尿、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗病毒、镇静及镇痛等作用。目前，虽然黄芪作为临床与食药同源植物得到大量应用，但其植物资源基本来源于野生采挖，难以形成规模化生产，同时，大量采挖将会对采集地生态环境及野生黄芪资源造成极大的损害。利用组织培养技术生产药用植物具有生长速度快、繁殖率高、扩繁周期短、室内繁殖条件可控、可不受季节限制周年培养等特点。目前文献中还未见有关于利用愈伤组织培养技术大规模生产黄芪愈伤组织用于有效成分提取的研究报道。

黄芪为野生植物，由于它的成分独特、资源较少、分布范围狭窄，因此对它的繁殖研究具有重要的意义。目前已有移栽、扦插、愈伤诱导等研究，但文献较少，专利更少。由于黄芪为多年生植物，导致移栽、扦插法无法实现快速大量繁殖。对它的组织培养的研究，包英华等已成功地从黄芪叶片诱导出愈伤组织，叶片愈伤组织中黄芪甲甙含量最高,分别为野生根的3倍、栽培根的3～5倍；张宗申等报道了光照比黑暗更有利于黄芪皂苷合成。但这些研究并没有实现应用。目前仍然没有实现黄芪快速、大量繁殖愈伤组织的技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方及其培养方法，该方法能够在较短时间内获得无褐化大量的黄芪叶片愈伤组织，通过生物技术手段解决黄芪植物资源缺乏的问题，为工业化提取黄芪有效成分提供充足原料。

本发明解决其技术问题采用如下技术方案：

一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方，其特征在于包括如下组分：植物组织培养基MS、细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-BA、生长素萘乙酸NAA、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、琼脂、海藻酸钠，在植物组织培养基MS中添加6-BA0.6～1.5mg/L、NAA0.2～1.6mg/L、蔗糖15.0～20.0g/L、葡萄糖2.0～10.0g/L、麦芽糖3.0～8.0g/L、琼脂3.5～6.0g/L和海藻酸钠0.2～0.5g/L；使用质量比0.5～4.0%NaOH溶液调整培养基溶液pH值为5.6～5.8。

配方分为植物愈伤组织诱导培养基配方和继代增殖培养基配方；

植物愈伤组织诱导培养基配方为：

植物组织培养基MS中添加6-BA0.8～1.5mg/L、NAA0.2～0.8mg/L、蔗糖15.0～20.0g/L、葡萄糖2.0～10.0g/L、琼脂3.5～6.0g/L和海藻酸钠0.2～0.5g/L，用质量比0.5～4.0%NaOH调整培养基溶液pH值为5.6～5.8；

继代增殖培养基配方为：

植物组织培养基MS中添加6-BA0.6～1.2mg/L、NAA0.4～1.6mg/L、蔗糖15.0～20.0g/L、葡萄糖2.0～5.0g/L、麦芽糖3.0～8.0g/L、琼脂3.2～5.0g/L和海藻酸钠0.3～0.5g/L，用质量浓度0.5～4.0%NaOH调整培养基溶液pH值为5.6～5.8。

一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方及其培养方法，其特征在于包括如下步骤：

A、外植体的选择与灭菌：

以黄芪叶片为外植体，采集健康无病害的黄芪叶片，用无菌水清洗黄芪叶片3～5遍，在体积浓度70％～75％的乙醇溶液中浸泡30～50秒，随后放入质量浓度0.10％～0.15％的HgCl₂溶液中浸泡5.0～12.0分钟，随后用无菌水清洗3～5遍；

B、培养基灭菌：

愈伤组织诱导培养基、继代增殖培养基分别分装在100ml三角形培养瓶中，每瓶20.0～25.0ml，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.10～0.15MPa下灭菌20.0分钟，冷却备用；

C、愈伤组织诱导：

取灭菌后的黄芪叶片用无菌手术刀切成长度2.0～5.0mm的小段，接种到灭菌后的植物愈伤组织诱导培养基上，培养温度为22.0～28.0℃，每天连续光照12.0～24.0小时，光照强度1000～3000lx，培养15～20天；

D、愈伤组织继代增殖：

无菌条件下，从步骤C中选取淡黄绿色或绿色无褐变、质地疏松的愈伤组织，将其夹取2.0～5.0mm的组织后，转接入灭菌后的愈伤组织继代增殖培养基中，培养温度为22.0～28.0℃，每天连续光照12.0～24.0小时，光照强度1000～3000lx。培养15～20天。

步骤A中外植体为健康无病害的黄芪叶片，外植体的清洗过程为无菌水清洗3遍，在体积浓度70％的乙醇溶液中浸泡50秒，随后放入质量浓度0.10％～0.15％的HgCl₂溶液中浸泡5～12分钟，随后用无菌水清洗5遍。

本发明的有益效果为：

1、此配方加入葡萄糖、麦芽糖代替部分蔗糖，更好的满足黄芪叶片愈伤组织快速生长的需要。海藻酸钠替代部分琼脂，在减少琼脂用量，降低培养基成本的同时增加固体培养基的支撑强度，更有利于培养基表面固定黄芪植物愈伤组织，促进新生黄绿色疏松愈伤组织快速继代增殖。

2、乙醇、HgCl₂处理可以完全杀灭黄芪叶片表面附着的微生物，在后续无菌培养中，解决残留微生物污染培养基及愈伤组织问题。取灭菌后的黄芪叶片用无菌手术刀切成长度2.0～5.0mm的小段，增加培养基表面放置叶片数量，提高诱导率，降低成本，接种到灭菌后的1号愈伤组织诱导培养基上，培养温度为22.0～28.0℃，每天连续光照12.0～24.0小时，光照强度1000～3000lx，培养15～20天。上述方法增加培养基表面放置叶片数量，提高诱导率，降低成本。连续光照增加愈伤组织的光合作用，促进组织增生。

综上所述采用本发明培养黄芪愈伤组织，增殖速度快、产量大、生产周期短、耗能少，室内愈伤组织生长条件可控，且能够实现大规模生产，有效的解决了黄芪工业化提取有效成分对原料的需求与野生资源保护之间的矛盾。

具体实施方式

一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方，包括如下组分：植物组织培养基MS、细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-BA、生长素萘乙酸NAA、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、琼脂、海藻酸钠，在植物组织培养基MS中添加6-BA0.6～1.5mg/L、NAA0.2～1.6mg/L、蔗糖15.0～20.0g/L、葡萄糖2.0～10.0g/L、麦芽糖3.0～8.0g/L、琼脂3.5～6.0g/L和海藻酸钠0.2～0.5g/L；使用质量比0.5～4.0%NaOH溶液调整培养基溶液pH值为5.6～5.8。

其配方分为植物愈伤组织诱导培养基配方和继代增殖培养基配方；

植物愈伤组织诱导培养基配方为：

植物组织培养基MS中添加6-BA0.8～1.5mg/L、NAA0.2～0.8mg/L、蔗糖15.0～20.0g/L、葡萄糖2.0～10.0g/L、琼脂3.5～6.0g/L和海藻酸钠0.2～0.5g/L，用质量比0.5～4.0%NaOH调整培养基溶液pH值为5.6～5.8。

上述配方加入葡萄糖代替部分蔗糖，更好的满足诱导黄芪叶片产生愈伤组织的需要，提高诱导效果。海藻酸钠替代部分琼脂，在减少琼脂用量，降低培养基成本的同时增加固体培养基的支撑强度，更有利于培养基表面固定黄芪叶片，促进叶片边缘产生的新生绿色疏松愈伤组织快速生长。

继代增殖培养基配方为：

植物组织培养基MS中添加6-BA0.6～1.2mg/L、NAA0.4～1.6mg/L、蔗糖15.0～20.0g/L、葡萄糖2.0～5.0g/L、麦芽糖3.0～8.0g/L、琼脂3.2～5.0g/L和海藻酸钠0.3～0.5g/L，用质量浓度0.5～4.0%NaOH调整培养基溶液pH值为5.6～5.8。

上述配方加入葡萄糖、麦芽糖代替部分蔗糖，更好的满足黄芪叶片愈伤组织快速生长的需要。海藻酸钠替代部分琼脂，在减少琼脂用量，降低培养基成本的同时增加固体培养基的支撑强度，更有利于培养基表面固定黄芪植物愈伤组织，促进新生黄绿色疏松愈伤组织快速继代增殖。

一种黄芪植物愈伤组织诱导及继代增殖的培养基配方及其培养方法，其特征在于包括如下步骤：

A、外植体的选择与灭菌：

以黄芪叶片为外植体，采集健康无病害的黄芪叶片，用无菌水清洗黄芪叶片3～5遍，在体积浓度70％～75％的乙醇溶液中浸泡30～50秒，随后放入质量浓度0.10％～0.15％的HgCl₂溶液中浸泡5.0～12.0分钟，随后用无菌水清洗3～5遍；

B、培养基灭菌：

愈伤组织诱导培养基、继代增殖培养基分别分装在100ml三角形培养瓶中，每瓶20.0～25.0ml，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.10～0.15MPa下灭菌20.0分钟，冷却备用；

C、愈伤组织诱导：

取灭菌后的黄芪叶片用无菌手术刀切成长度2.0～5.0mm的小段，接种到灭菌后的植物愈伤组织诱导培养基上，培养温度为22.0～28.0℃，每天连续光照12.0～24.0小时，光照强度1000～3000lx，培养15～20天；

上述方法增加培养基表面放置叶片数量，提高诱导率，降低成本。连续光照增加愈伤组织的光合作用，促进组织增生。

D、愈伤组织继代增殖：

无菌条件下，从步骤C中选取淡黄绿色或绿色无褐变、质地疏松的愈伤组织，将其夹取2.0～5.0mm的组织后，转接入灭菌后的愈伤组织继代增殖培养基中，培养温度为22.0～28.0℃，每天连续光照12.0～24.0小时，光照强度1000～3000lx。培养15～20天。

所述步骤A中外植体为健康无病害的黄芪叶片，外植体的清洗过程为无菌水清洗3遍，在体积浓度70％的乙醇溶液中浸泡50秒，随后放入质量浓度0.10％～0.15％的HgCl₂溶液中浸泡5～12分钟，随后用无菌水清洗5遍。

实施例1：

A、外植体的选择与灭菌：以黄芪叶片为外植体。采集健康无病害的黄芪叶片，无菌水清洗5遍，在体积浓度75％乙醇中浸泡30秒，随后放入质量浓度0.10％的HgCl₂溶液中浸泡12.0分钟，随后用无菌水清洗3遍。

B、培养基灭菌：愈伤组织诱导培养基、继代增殖培养基分别分装在100ml三角形培养瓶中，每瓶20.0ml，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.10MPa下灭菌20.0分钟，冷却备用。

C、愈伤组织诱导：取灭菌后的黄芪叶片用无菌手术刀切成长度2.0mm的小段，接种到灭菌后的愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.8mg/L+蔗糖20.0g/L+葡萄糖10.0g/L+琼脂6g/L+海藻酸钠0.5g/L，pH值为5.8。培养温度为28.0℃，每天连续光照24.0小时，光照强度3000lx。培养20天后，愈伤组织诱导率为96.1％。

D、愈伤组织继代增殖：无菌条件下，选取淡黄绿色或绿色无褐变、质地疏松的愈伤组织，将其夹取2.0mm的组织后，转接入灭菌后的愈伤组织继代增殖培养基中。愈伤组织继代增殖培养基的配方为：MS+6-BA1.2mg/L+NAA1.6mg/L+蔗糖20.0g/L+葡萄糖5.0g/L+麦芽糖8.0g/L+琼脂5.0g/L+海藻酸钠0.5g/L，pH值为5.8。培养温度为28.0℃，每天连续光照24.0小时，光照强度3000lx。培养20天后，愈伤组织增殖4.3倍。

实施例2：

A、外植体的选择与灭菌：以黄芪叶片为外植体。采集健康无病害的黄芪叶片，无菌水清洗3遍，在体积浓度72％乙醇中浸泡40秒，随后放入质量浓度0.12％的HgCl₂溶液中浸泡8.0分钟，随后用无菌水清洗4遍。

B、培养基灭菌：愈伤组织诱导培养基、继代增殖培养基分别分装在100ml三角形培养瓶中，每瓶22.0ml，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.15MPa下灭菌20.0分钟，冷却备用。

C、愈伤组织诱导：取灭菌后的黄芪叶片用无菌手术刀切成长度4.0mm的小段，接种到灭菌后的愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为：MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖15.0g/L+葡萄糖2.0g/L+琼脂3.5g/L+海藻酸钠0.2g/L，pH值为5.6。培养温度为22.0℃，每天连续光照12.0小时，光照强度1000lx。培养15天后，愈伤组织诱导率为86.4％。

D、愈伤组织继代增殖：无菌条件下，选取淡黄绿色或绿色无褐变、质地疏松的愈伤组织，将其夹取3.0mm的组织后，转接入灭菌后的愈伤组织继代增殖培养基中。愈伤组织继代增殖培养基的配方为：MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.4mg/L+蔗糖15.0g/L+葡萄糖2.0g/L+麦芽糖3.0g/L+琼脂3.2g/L+海藻酸钠0.3g/L，pH值为5.6。培养温度为22.0℃，每天连续光照12.0小时，光照强度1000lx。培养15天后，愈伤组织增殖2.8倍。

实施例3：

A、外植体的选择与灭菌：以黄芪叶片为外植体。采集健康无病害的黄芪叶片，无菌水清洗3遍，在体积浓度70％乙醇中浸泡50秒，随后放入质量浓度0.15％的HgCl₂溶液中浸泡5.0分钟，随后用无菌水清洗5遍。

B、培养基灭菌：愈伤组织诱导培养基、继代增殖培养基分别分装在100ml三角形培养瓶中，每瓶25.0ml，瓶口盖透气塑料封口膜，在压力为0.12MPa下灭菌20.0分钟，冷却备用。

C、愈伤组织诱导：取灭菌后的黄芪叶片用无菌手术刀切成长度5.0mm的小段，接种到灭菌后的愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.6mg/L+蔗糖18.0g/L+葡萄糖8.0g/L+琼脂4.0g/L+海藻酸钠0.3g/L，pH值为5.7。培养温度为25.0℃，每天连续光照20.0小时，光照强度2000lx。培养18天后，愈伤组织诱导率为91.6％。

D、愈伤组织继代增殖：无菌条件下，选取淡黄绿色或绿色无褐变、质地疏松的愈伤组织，将其夹取5.0mm的组织后，转接入灭菌后的愈伤组织继代增殖培养基中。愈伤组织继代增殖培养基的配方为：MS+6-BA0.8mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖18.0g/L+葡萄糖3.0g/L+麦芽糖5.0g/L+琼脂4.0g/L+海藻酸钠0.4g/L，pH值为5.6。培养温度为26.0℃，每天连续光照20.0小时，光照强度2000lx。培养18天后，愈伤组织增殖倍3.2。