一种鉴别高油酸与普通油酸花生品种间F

摘要

本发明涉及一种鉴别高油酸与普通油酸花生品种间F

说明书

技术领域

本发明属于农业生物工程领域，具体涉及一种鉴别高油酸与普通油酸花生品种间F₁种子真伪的无破损检测方法。

背景技术

油料作物种子中的脂肪酸组成及其含量是衡量其品质优劣的重要指标。在花生种子的脂肪酸组份中，油酸和亚油酸含量约为80%。油酸具有较好的氧化稳定性，能够减少脂质氧化，如果提高花生脂肪酸中的油酸含量，则能改善由于脂质氧化而产生的不良气味、口味及货架期缩短等缺点。高油酸花生对人体健康有益，食用高油酸花生有利于降低心脑血管疾病的风险，还能反向抑制人体炎症细胞因子TNF-α。因此，高油酸花生倍受青睐，根据市场需要选育优质、高产、抗病（逆）的高油酸品种也成为花生育种的重要目标。

杂交育种仍是花生育种的主要手段，通过杂交可以使杂种后代增加变异性和异质性，由于基因重组而产生双亲所没有的某些新性状，经过对优良性状的综合选择，使后代获得较大的遗传改良。杂交育种技术在培育高油酸花生品种中得到了广泛应用，通常情况下是以综合性状优良的普通油酸含量的品种(油酸含量低于60%)和高油酸品种（油酸含量高于70%）做为亲本，通过有性杂交和选择，使高油酸性状与其他优良性状成功聚合。而杂交育种时，伪杂种的产生是不可避免的，剔除F₁中的伪杂种，可大大减少高油酸选育的工作量，提高育种效率。

自发突变体F435是在Florida育种项目中最早发现的高油酸花生（含80%油酸和2%亚油酸）。将高油酸和普通油酸花生杂交，其杂种F₂的分离比为3:1或15:1，表明高油酸性状是受两对基因（FAD2A和FAD2B）控制的隐性性状。研究表明，高油酸花生与普通油酸花生的基因相比，存在2个突变位点。一个是FAD2A基因起始密码子后448bp处G:C→A:T的突变，另一个是FAD2B基因起始密码子后442bp处A插入的突变或665bp(或997bp)处微型反向重复转座元件（MITE）插入。因此，通过在杂交F1检测这些突变，则可以剔除伪杂种。但是目前检测这些突变的方法如CAPS、实时定量PCR、测序和AS-PCR都需要提取种子的DNA，会造成种子不同程度的破损，这些破损会影响种子的保存和萌发；而且并不是所有的育种机构都具有利用分子生物学手段检测这些突变的实验条件。所以，一种简便的检测技术对于大多致力于培育高油酸花生品种的单位是非常必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题：克服现有技术的缺陷，提供一种通过近红外光谱测定高油酸与普通油酸花生品种间F₁种子的油酸含量鉴别F₁种子真伪的无破损检测方法，该方法具有对种子无任何损毁，无前处理、无污染、方便快捷、测定速度快等优点。

本发明的技术方案：

一种鉴别高油酸与普通油酸花生品种间F1种子真伪的无破损检测方法，包括以下步骤：

（1）收获高油酸与普通油酸品种间杂交组合的所有F₁种子和相同种植条件下母本自交的种子；

（2）利用近红外光谱技术分别测定单粒的母本和F₁种子的油酸含量，母本测定多粒种子的油酸含量，取平均值待用；

（3）当母本是普通油酸花生时，计算单粒F₁种子的油酸含量比母本油酸含量的平均值高的比例；若高的比例大于10%，则该F₁种子为真杂种，否则是伪杂种；计算时母本油酸含量取测定的平均值；

当母本是高油酸花生时，计算单粒F₁种子的油酸含量比母本油酸含量低的比例；若低的比例大于20%，则该F₁种子为真杂种，否则是伪杂种；计算时母本油酸含量取测定的平均值。

当母本的基因型为AABB或aabb时，所述真杂种的基因型为AaBb，伪杂种的基因型为AABB或aabb。

其中普通油酸花生品种的油酸含量低于60%，高油酸品种的油酸含量高于70%，所述的多粒种子为10-20粒。

所述高油酸与普通油酸品种间杂交组合时，母本为高油酸花生或普通油酸花生。

用近红外光谱技术测定油酸含量的步骤为:打开近红外光谱分析仪电源，预热半小时；将花生种子放入样品测定台的中心位置，选取预存的用于油酸分析的光谱曲线，点击测定，保存读数，重复三次即可。

通过近红外光谱技术测定高油酸与普通油酸花生杂交组合的F₁种子及母本的油酸含量，当母本是普通油酸花生（包括AABB和aaBB两种基因型）时，计算单粒的F₁种子的油酸含量比母本油酸含量（取母本油酸测定的平均值）高的比例，若高的比例大于10%，则该F₁种子为真杂种，否则是伪杂种。

当母本是高油酸花生时，计算单粒的F₁种子的油酸含量比母本油酸含量（取供体母本油酸测定的平均值）低的比例，若低的比例大于20%，则该F₁种子为真杂种，否则是伪杂种。

本发明的积极有益效果（优点）：

（1）本发明是以近红外光谱检测技术为基础，通过检测普通油酸与高油酸花生的杂种组合的F₁种子的油酸含量，准确区分真伪杂种。该方法对种子无任何损毁，无前处理、无污染、方便快捷，测定速度快；检测时除了近红外光谱分析仪外，无需其他实验设备，简便快捷，易于实施。

（2）本发明方法操作简单，结果稳定，成本低。与定量PCR方法、酶切方法比较，该方法操作简单；不用荧光染料及限制性内切酶，除近红外光谱分析仪以外无需其他仪器，检测成本低，对于实验基础薄弱的育种单位非常有利。

（3）由于杂交育种时，伪杂种的产生是不可避免的，利用该方法剔除杂交组合F₁中的伪杂种，可大大减少育种后期选育的工作量和无效劳动。本发明为高油酸花生品种选育提供了新的技术手段，可显著提高高油酸性状选择的准确性，具有简单、高效、不对种子造成损伤等特点，可显著提高育种效率，降低育种成本。

附图说明

图1FAD2A的突变基因型测序结果图；

图2FAD2B的突变基因型测序结果图。

具体实施方式

以下实施例可以更好的理解本发明，但以下并不表示对本发明的任何限制。

实施例1、一种鉴别高油酸与普通油酸花生品种间F1种子真伪的无破损检测方法，包括以下步骤：

（1）收获高油酸与普通油酸品种间杂交组合的所有F₁种子和相同种植条件下母本自交的种子；

（2）利用近红外光谱技术分别测定单粒的母本和F₁种子的油酸含量。母本测定10-20粒种子的油酸含量，取平均值待用；

用近红外光谱技术测定油酸含量的步骤:打开近红外光谱分析仪（DA7200DiodeArrayAnalyzer）的电源，预热半小时；将花生种子放入样品测定台的中心位置，选取预存的用于油酸分析的光谱曲线，点击测定，保存读数，重复三次。

（3）当母本是普通油酸花生时，计算单粒F₁种子的油酸含量比母本油酸含量高的比例；若高的比例大于10%，则该F₁种子为真杂种，否则是伪杂种；计算时以母本油酸测定的平均值为基准；

当母本是高油酸花生时，计算单粒F₁种子的油酸含量比母本油酸含量低的比例；若低的比例大于20%，则该F₁种子为真杂种，否则是伪杂种；计算时以母本油酸测定的平均值为基准。

其中普通油酸花生品种的油酸含量低于60%，高油酸品种的油酸含量高于70%。

当母本的基因型为AABB或aabb时，得到真杂种的基因型为AaBb，得到伪杂种的基因型为AABB或aabb。

实施例2：用分子标记方法鉴定杂交种子中的真伪杂种。

分别收获杂交组合wt09-0023×远杂9102和远杂9102×wt09-0023的杂交F₁种子，对每粒F₁种子编号，在种子远胚端切取少量组织提取DNA。远杂9102的FAD2基因(ahFAD2A和ahFAD2B)的基因型为AABB，wt09-0023的FAD2基因的基因型为aabb，所以上述两个组合的真杂交种子的FAD2基因的基因型为AaBb；wt09-0023×远杂9102组合的伪杂种的基因型为aabb，远杂9102×wt09-0023组合的伪杂种的基因型为AABB。

用测序的方法能够获得各F₁种子的基因型，根据基因型区分真伪杂种。以各杂交F₁种子的DNA为模板，用引物aF19/R3和bF19/R3(Patel,2004)进行PCR，根据PCR产物的测序峰值可以区分基因型。

如图1，FAD2A的448bp处只有一个峰G或A，分别为纯合的AA或aa；若有G和A两个峰叠在一起，为杂合基因型Aa。

如图2，FAD2B的442bp处只有一个峰A为纯合bb，若有A和G两个峰叠在一起，为杂合基因型Bb，若没有多一个峰A，则为纯合基因型BB。

实施例3、近红外光谱技术和气相色谱法测定花生种子油酸含量的比较

来源于杂交组合远杂9102×wt09-0023的F₁种子经过基因型鉴定，基因型是AABB的种子为伪杂种，基因型是AaBb的种子是真杂种。来源于杂交组合wt09-0023×远杂9102的F₁种子经过基因型鉴定，基因型是aabb的种子为伪杂种，基因型是AaBb的种子是真杂种。将鉴定过基因型的F₁种子和供体亲本远杂9102和wt09-0023的单粒种子分别用近红外光谱技术和气相色谱法测定油酸和亚油酸含量，测定结果见表1。

结果表明两种方法测定的油酸含量差异不显著。远杂9102、伪杂种、真杂种、伪杂种、真杂种和wt09-0023来源于近红外光谱技术和气相色谱法测定的油酸含量都差异不显著，亚油酸含量也差异不显著。所以近红外光谱技术在花生油酸测定上的结果完全可靠。

表1近红外光谱技术和气相色谱法测定花生种子的油酸及亚油酸含量的对比

（1）测定普通油酸与高油酸花生的杂种F₁及母本的油酸含量，能够区分真伪杂种。

花生是自花授粉植物，而伪杂种来源于杂交组合远杂9102×wt09-0023，所以理论上伪杂种是供体母本远杂9102自交的产物。表1中，不管是近红外光谱测定还是气相色谱法测定，伪杂种和远杂9102的油酸含量都差异不显著，这一结果与前面的理论相同。伪杂种来源于杂交组合wt09-0023×远杂9102，而伪杂种和wt09-0023的油酸含量差异不显著，也支持了伪杂种是供体母本自交的产物这一理论。表1中，真杂种和伪杂种的油酸含量差异显著，而理论上伪杂种是供体母本的自交的产物，所以F₁真杂种的油酸含量与供体母本的油酸含量也差异显著，而伪杂种与母本的油酸含量差异不显著，这一结论在表1得到验证。所以在F₁种子基因型未知的情况下，分别测定F₁种子与母体的油酸含量，通过比对F₁种子和供体母体油酸含量的差异，可以区别真伪杂种。

远杂9102是一个普通油酸品种，其油酸含量平均值为38.97%，来源于杂交组合远杂9102×wt09-0023的F₁中真杂种的油酸含量在45.21~48.33%之间，伪杂种的油酸含量38.83~40.81%，真杂种的油酸含量比其母本（远杂9102）平均值高16.01%~24.02%，伪杂种的油酸含量与其母本非常接近，比母本油酸平均值高的比例小于4.72%，所以利用真杂种油酸含量显著高于其母本及伪杂种（差异10%以上）这一特性可以区分真伪杂种。

wt09-0023是一个高油酸材料，其油酸含量平均值为74.63%，来源于杂交组合wt09-0023×远杂9102的F₁中真杂种的油酸含量在46.78%~49.92%之间，比其母本平均值低33.11%~37.32%，伪杂种的油酸含量在74.06%~75.12%之间，非常接近其母本，比母本油酸平均值低的比例小于7.64%，利用真杂种油酸含量显著低于其母本及伪杂种（差异20%以上）这一特性可以区分真伪杂种。

（2）在不同的高油酸与普通油酸品种间杂交组合中，F₁真杂种的油酸含量与供体母本之间存在的差异高于伪杂种与供体母本之间的差异。

表2中，豫花14、豫花9326、远杂9102、白沙1016、豫花4号和海花1号是普通油酸花生品种（基因型为AABB），豫花9620和豫花9719也是普通油酸品种，但它们的基因型是aaBB，由于FAD2A基因突变，其编码的△12脂肪酸脱氢酶失活，致使油酸向亚油酸转变减慢，所以其油酸含量比前面的几个品种高一些。开农403-3、开农61、开农选01-6、wt09-0023和wt08-0923都是高油酸花生品种或材料。

杂交组合1-3都是以普通油酸花生作为母本，真杂种的油酸含量与其母本差异都远高于伪杂种与其母本的差异（差异10%以上）。组合1真杂种的油酸含量比其母本（豫花14）油酸平均值高17.34%~26.62%，伪杂种油酸含量比其母本平均值高的比例小于4.58%；组合2真杂种的油酸含量比其母本（豫花9326）油酸平均值高16.21%~23.38%，伪杂种油酸含量比其母本平均值高的比例小于3.40%；组合3真杂种的油酸含量比其亲本（远杂9102）油酸平均值高15.53%~23.77%，伪杂种油酸含量比其母本平均值高的比例小于3.53%。

杂交组合4-6都是以高油酸花生作为母本，真杂种油酸含量与其母本的差异远高于伪杂种与其母本的差异（差异20%以上）。组合4真杂种的油酸含量比其母本（开农选01-6）油酸含量平均值低35.69%~39.74%，伪杂种油酸含量比其母本平均值低的比例小于3.76%；组合5真杂种的油酸含量比其母本（开农选01-6）油酸含量平均值低36.38%~40.33%，伪杂种油酸含量比其母本低的比例小于3.90%；组合6真杂种的油酸含量比其母本（开农选01-6）油酸含量平均值低38.12%~41.88%，伪杂种油酸含量比其母本平均值低的比例小于3.63%。

杂交组合7和8都是以普通油酸材料（基因型aaBB）作为母本，真杂种油酸含量与其母本差异都显著高于伪杂种油酸含量与其母本的差异（差异10%以上）。组合7真杂种的油酸含量比其母本（豫花9620）油酸含量平均值高23.74%-31.48%，伪杂种油酸含量比其母本平均值高的比例小于2.90%；组合8真杂种的油酸含量比其母本（豫花9719）油酸含量平均值高24.15%-32.02%，伪杂种油酸含量比其母本平均值高的比例小于2.57%。

所以不管以普通油酸花生还是以高油酸花生为杂交组合的母本，F₁真杂种的油酸含量都与伪杂种存在显著差异，利用这个差异，完全可以区分真伪杂种。

表2近红外光谱方法测定不同组合的F1杂交种子的油酸含量鉴别真伪杂种的统计表