测定急性呼吸窘迫综合征(ARDS)相关生物标志物的方法、监测患者的ARDS的发展和治疗的方法

摘要

本发明涉及用于监测患者的ARDS的发展和用于治疗ARDS的方法。用于监测ARDS的发展的方法基于将在较晚时间点提取的样品中获得的生物标志物的水平或活性与先前时间点提取的样品中的同一生物标志物的水平或活性进行比较。某种生物标志物的水平或活性的有利变化表示疾病消退(患者恢复)，相反地，某种生物标志物的水平或活性的不利变化表示疾病恶化。例如如果所监测的一种或多种生物标志物的水平或活性停止显示有利变化或开始显示不利变化，则通过给予可用于治疗ARDS的治疗活性剂，加强对患者的治疗。本发明另外涉及用于同时确定来自患者的样品中的多种生物标志物的方法，其中所述生物标志物与ARDS有关。确定了生物标志物的水平或活性。本发明还涉及可用于实施所述方法的诊断试剂盒，特别是包含适用于生物芯片技术的芯片（例如微阵列）的试剂盒。

说明书

发明领域

本发明涉及用于监测患者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发展和用于治疗患者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法。用于监测ARDS的发展的方法基于将在较晚时间点提取的样品中获得的生物标志物的水平或活性与先前时间点提取的样品中的相同生物标志物的水平或活性进行比较。某些生物标志物的水平或活性的有利变化表示疾病消退(患者恢复)，相反地，某些生物标志物的水平或活性的不利变化表示疾病恶化。例如，如果所监测的一种或多种生物标志物的水平或活性停止显示有利变化或开始显示不利变化，则通过给予可用于治疗ARDS的治疗活性剂，加强对患者的治疗。

本发明另外涉及用于同时确定患者样品中的多种生物标志物的方法，其中所述生物标志物与ARDS有关。确定了生物标志物的水平或活性。本发明还涉及可用于进行所述方法的诊断试剂盒，特别是包含适用于生物芯片技术的芯片(例如微阵列)的试剂盒。

发明背景

本文用于说明本发明的背景的出版物和其它材料，具体地说提供关于实践的另外的详情的案例，通过引用予以结合。

多重测定，即用于样品中多种分析物的同时检测或定量的方法是本领域本身众所周知的。这类测定是在单一轮中同时测量多种分析物的测定。多重测定可根据每次测定可测量多少分析物来分类：分析物的量的范围在从几种(至少两种)开始直到非常高的数目。商品化多重测定通常被设计用于同时检测多达约50种分析物。这些方法可用于核酸和蛋白质(例如抗体)的分析。还可测量碳水化合物和其它化学化合物。

多重方法可以以许多备选方式进行。

作为实例可提及微阵列，其是同时确定许多生物分析物的固体支持物上的2D阵列。在蛋白质微测定(例如抗体微测定)中，将不同的抗体以预定方式在固体支持物上固定到分开的位置上。这些抗体用作能够俘获存在于样品中的分析物(蛋白质)的俘获分子。

作为市购可得的测定的实例可提及Luminex?xMAP技术，其是直接在微量滴定板中进行的基于珠粒的测定。各测定含有不同微球的混合物(珠粒混合物)，其中各珠粒类型由用于分析物分类的各荧光色调限定，并在其表面上携带特异性俘获试剂，例如特异性蛋白质(抗体)。在珠粒混合物与患者样品温育期间，互补反应配偶体(抗原)与在微球上的俘获抗体结合。在第二温育步骤中，用携带特异性荧光标志物的标记抗体检测结合的抗原。结合的分析物(抗原)的量与检测抗体的荧光强度正相关，这允许定量分析物。珠粒的分类和抗原的定量用Luminex分析系统进行，该系统基于使用两种不同激光的流式细胞术的技术。

还提出了使用用于疾病的诊断和预后的多连续生物标志物（multiplesequentialbiomarkers）。

ChiragRParikh等，CritCareMed2008,第36卷，第4期(Suppl);第S159-S165页，提出使用用于评价AKI(急性肾损伤)的持续时间和用于预测有关透析需要和死亡率的总体预后的多连续生物标志物。生物标志物是血浆组（plasmapanel）中的NGAL(嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白)和胱抑蛋白C和尿液组(urinepanel)中的NGAL、IL-18(白介素-18)和KIM-1(肾损伤分子-1)。

OBeran等，EurJClinMicrobiolInfectDis(2009)28：793-799描述了生物标志物例如IL-6(白介素-6)、IL-1ra(白介素-1受体拮抗剂)、IL-1β(白介素-1β)、IL-8(白介素-8)、MIP-1β(巨噬细胞炎性蛋白-1β)和MCP-1(单核细胞化学引诱蛋白-1)的序贯分析及其与IMD(侵入性脑膜炎球菌病)的相关性及其严重性。

WO2009/053523，FaronPharmaceuticalsOy，公开了CD73是用于监测患者的炎性疾病，具体地说SIRS(全身炎症反应综合征)、ALI(急性肺损伤)、ARDS和MOF(多器官衰竭)的有用生物标志物。在不同时间点从患者中提取组织液样品，确定样品中的CD73活性。发现CD73活性水平的提高与疾病的消退相关。

迄今为止，无人提出将多连续生物标志物用于监测患者的ARDS的发展。特别是，无人提出将由CD73和IL-6组成或包括CD73和IL-6的一组生物标志物用于此目的。

发明概述

本发明的目的在于提供在该病况的治疗期间跟踪ARDS的严重性的方法和手段。通常ARDS患者接受最合理的重症监护，但更重要的是，使用生物标志物预测任何药物治疗正成为评价治疗功效的非常有价值的资源。一种这样的治疗是Traumakine^?FP-1201(干扰素β)，已显示该治疗降低ARDS患者的死亡率。通过获得有关患者病况的有价值的预测数据，ICU医生可使患者的护理最优化。

因此，在一方面中，本发明涉及同时确定从患者中提取的样品中的多种ARDS相关生物标志物的方法，其中生物标志物之一是CD73蛋白。按照本发明，所述方法包括以下步骤

i)通过将样品加入识别生物标志物的结合剂中，定量所述样品中生物标志物的水平，或

ii)通过采用薄层色谱法或通过将所述样品加入生物标志物的底物中，并监测所述底物的变化确定所述样品中生物标志物的活性。

在另一方面中，本发明涉及在用于同时确定从患者中提取的样品中的多种ARDS相关生物标志物的生物亲和力测定方法中使用的诊断试剂盒，其中包括CD73和其它生物标志物的生物标志物的数目为至少2种、优选2-50种、最优选2-8种。按照本发明，所述试剂盒包含

-固定在固体支持物或能够固定在固体支持物上的一组俘获结合剂，其中各俘获结合剂对待确定的某种生物标志物特异，和

-一组标记的生物亲和力组分，其中这类标记的生物亲和力组分各自具有对某种固定化生物标志物特异的生物亲和力，或其中这类标记的生物亲和力组分各自具有与某种固定化生物标志物竞争结合位点的能力。

在第三方面中，本发明涉及用于监测患者的ARDS的发展的方法，其中确定了在不同时间点从患者中提取的样品中的至少2种、优选2-50种、最优选2-8种ARDS相关生物标志物，且其中生物标志物之一是CD73蛋白，所述方法基于将在较晚时间点提取的样品中获得的生物标志物的水平或活性与在先前时间点提取的样品中的同一生物标志物的水平或活性进行比较，其中某种生物标志物的水平或活性的有利变化表示疾病消退，且其中某种生物标志物的水平或活性的不利变化表示疾病恶化。

在第四方面中，本发明涉及用于通过给予患者有效治疗ARDS的治疗活性剂来治疗患有ARDS的患者的方法，其中按照本发明，用于监测ARDS的发展的一种或多种生物标志物，

-一停止显示有利变化，或

-一开始显示不利变化

就开始给药。

附图简述

图1A显示具有能够结合俘获结合剂的点的支持物，

图1B显示俘获结合剂在其上固定的图1A的支持物，

图1C显示在其上待确定的生物标志物已经固定在俘获结合剂上的图1B的支持物，

图1D显示在其上标记的结合剂已经固定在待确定的生物标志物上的图1C的支持物，

图2显示标记的抗体，其包含定向到生物标志物的第一抗体和携带标记并与第一抗体的Fc区结合的第二抗体的套件，

图3显示所测量的生物标志物的水平随时间而变的一组曲线。B1-B4的直线表明随时间的变化是有利的。B5的虚线意味着其水平的降低表示不利变化。

图4a-4h显示从ALI或ARDS恢复的一组患者的8种生物标志物随时间而变的水平或活性(图4a-4g显示水平；图4h显示活性)。

图5显示作为实例的从ALI或ARDS恢复的一名患者的可溶性CD73随时间而变的活性和水平(浓度)两者。从相同样品的等分试样中测量可溶性CD73活性(■，左y轴)和可溶性CD73浓度(●，右y轴)。图5显示活性和浓度测量相当。可以看出，CD73(图5)和IL-6(图4b)值显示在血浆浓度中的显著变化，这表明了有利变化。

发明详述

样品可以是任何组织液，其浸润并围绕着细胞。该术语包括例如血浆、血清、全血、淋巴、尿液、渗出液(胸膜、腹膜)和脑脊液。

ARDS相关生物标志物是指存在于来源于患者的样品中的一组生物标志物。该组生物标志物包含至少两种、优选2-8种生物标志物、特别是约5种生物标志物，其中之一是CD73蛋白。作为其它生物标志物的实例可提及细胞因子，其是在生物体中用作信号转导化合物的蛋白质或肽。细胞因子包括例如干扰素、白介素特别是IL-6、趋化因子例如嗜伊红粒细胞趋化蛋白。作为其它生物标志物的实例可提及CRP(C-反应蛋白)和其它五聚环蛋白。

优选生物标志物选自：IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17A、碱性FGF、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、VEGF、IL-1α、IL-2Rα、IL-3、IL-12(p70)、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL、CD73、CRP、新蝶呤、MxA和β-2-微球蛋白。

特别优选的生物标志物组包括CD73和IL-6、这两种生物标志物或这两种生物标志物与一种或几种另外的生物标志物组合。具体地说，所述另外的生物标志物选自IL-8、IL-15、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、MPC-1、MIP-1a和IL-1ra。优选所述生物标志物组包含生物标志物CD73、IL-6、IL-8、IL-15、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、MPC-1、MIP-1a和IL-1ra的3-8种，条件是它们的至少两种是CD73和IL-6。特别优选的组包含所有8种生物标志物CD73、IL-6、IL-8、IL-15、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、MPC-1、MIP-1a和IL-1ra。

在一个备选方法中，确定了生物标志物的活性。这通过例如采用薄层色谱法或通过将样品加入生物标志物的底物中，并监测所述底物的变化来进行。

例如，可按照已公布的方法，采用薄层色谱法测量生物标志物的活性。还可采用测量合适底物的转化的任何酶测定来测量活性。例如对于CD73，通过AMP或可用作CD73底物的另一种嘌呤单核苷酸转化成相应的核苷来测量活性。例如，测定可基于放射性或荧光标记的底物的转化。检测方法可依赖于底物浓度降低或产物浓度增加或磷酸基释放的定量。可通过在已知的CD73抑制剂(例如AMPCP)存在和不存在时进行该测定，来确定反应的CD73依赖性。

一般而言，用于活性测量的报道细胞系是这样的基因工程细胞系，其中目标化合物或分子(即生物标志物)特异性地诱导报道基因表达。这类报道基因表达可导致光产生或可定量的另一种可测量的功能。报道基因活性的定量可然后用于计算目标化合物或分子的活性和/或水平。

对上述生物标志物特异的单克隆抗体描述于文献中，并且可获自许多商业来源，例如Bio-RadLaboratories，Inc.，JenaBioscienceGmbH和SinoBiological，Inc。

为了定量“ARDS相关生物标志物”，所述生物标志物应被发现与ARDS疾病的状态相关使得生物标志物随时间的水平变化表明疾病状态的变化。具有最强相关性的这些生物标志物将合并成ARDS生物标志物组。例如，CD73从一个时间点到后一时间点的水平提高表明用治疗活性剂治疗的功效，和由此的ARDS消退。然而，对于CRP，水平提高表明疾病恶化。因此重要的是，首先研究待各个合适的生物标志物以查明是否其水平的提高或降低对于疾病状态是有利变化或不利变化。

“生物亲和力测定”当生物标志物是蛋白质时可为免疫测定。或者，它当生物标志物是核酸时是指杂交测定。

当待确定的生物标志物是蛋白质或肽时，“结合剂”(俘获结合剂或标记的结合剂)是指抗体等(例如亲和体(affibodies)和适体)。如果生物标志物是核酸，则结合剂优选为寡核苷酸。

术语“固体支持物”是例如携带标记的微球或珠粒。或者，固体支持物是指微量滴定板或芯片。优选固体支持物是适用于生物芯片技术的芯片，例如微阵列。在此，微阵列是生物芯片技术组件中的组分，所述生物芯片技术组件包含用于转导、信号处理和结果显示的更多装置。

术语“抗体”应理解为包括多克隆和单克隆抗体、其任何片段和基因工程抗体。

“标记”可以是例如酶或荧光标记。特别优选的荧光标记组是时间分辨荧光标记，例如镧系螯合物。如果标记是酶，则加入所述酶的底物，其中酶与其底物间的后续反应产生可检出的信号。如果标记是荧光标记，则通过辐射(例如通过激光)进行激发，其中产生可检出信号。

优选待确定的所有生物标志物是蛋白质或肽，其每一个都可固定在某种俘获抗体上。在这种情况下，标记的结合剂也是抗体。各标记抗体定向到某种生物标志物的表位，其中所述表位不同于与俘获抗体结合的表位。

多种ARDS相关生物标志物使用所阐述的生物亲和力测定从样本中同时确定，例如以下：将俘获结合剂固定在固体支持物表面的预定位置上，通常在微量滴定板等的生物素化点或孔上。俘获结合剂因此将以阵列的形式排列在固体支持物(微量滴定板)上。各俘获结合剂对待确定的某种生物标志物是特异的。将样品加到阵列上并使其中的生物标志物与固定化俘获结合剂一起温育，使得各生物标志物固定在相应的俘获结合剂上。

生物标志物的检测可以两种方式进行：通过所谓的非竞争性“三明治测定”或通过竞争测定。在非竞争测定中，将标记的生物亲和力组分(例如标记抗体)加入携带固定化生物标志物的板中。在温育和任选除去未结合的标记生物亲和力组分后，激发标记以产生可检出信号。在这种类型的测定中，信号的强度与固定化生物标志物的浓度成正比。微量滴定板上“三明治”的位置报告哪种生物标志物被检出。

在Luminex?技术中，将俘获抗体固定在珠粒上，所述珠粒用荧光颜料标记使得某种颜色是指某种俘获抗体。在与含有待检测的生物标志物的样品一起温育且随后加入一组第二抗体(用不同于珠粒颜色的荧光颜色标记的标记抗体)时，形成包含“珠粒-俘获抗体-生物标志物-标记抗体”的三明治。将每一种这类三明治转移到流式细胞仪中，使用双激光器对各三明治进行分类和定量。

在竞争测定中，使携带来源于样品的固定化生物标志物的板经过一组标记抗原处理，其中各标记抗原能够与来源于样品的相应的固定化生物标志物竞争俘获结合剂上的结合位点。当标记被激发时，检出的信号将与来源于样品的生物标志物的浓度成反比。

通过参照附图，其中图1A显示具有点S1-S5的支持物(微量滴定板)，更详细地对本发明进行说明。俘获抗体C1-C5与预定的点结合(图1B)，所述点可被生物素化以能够结合其上的俘获抗体。各俘获抗体对待确定的某种生物标志物B1-B5是特异的。在将样品加入图1B所示的板中时，各俘获抗体将固定针对其产生俘获抗体的生物标志物。可洗去未结合的生物标志物，之后加入标记抗体L1-L5，其中一种标记抗体对某种固定化生物标志物是特异的。在标记L激发(照射或加入酶底物，这取决于标记L)时，产生可检出信号。

虽然标记抗体可以是一个单一的携带必要特异性和标记的抗体，但是标记抗体可备选地为定向至生物标志物的第一抗体(PA)和携带标记L并结合第一抗体的Fc区的第二抗体(SA)的套件。参见图2。该套件避免了针对可能想要检测的每个生物标志物都产生标记抗体的昂贵工序。

当用对在不同时间点提取的样品重复该方法时，记录从各个标记抗体获得的信号，并相对于时间作图(图3)。对于一些生物标志物(B1和B2)，水平提高表示患者疾病的有利变化，而B3和B4的水平降低也表示有利变化。相反，B5的水平降低表示患者疾病的不利变化，因此曲线优选用不同的标记或颜色画出，以便快速与表示有利变化的曲线区分开。

将来自确定的数据，任选与临床观察结果、治疗手段等一起收集入数据库。

通过下列非限制性实施例对本发明进行说明。

实施例1

在临床研究中，连续6天给予26名患有ALI或ARDS的患者10微克干扰素β-1a的剂量。如果与未治疗观察到的正常频度相比，该治疗降低死亡达75%。针对以下生物标志物分析来源于患者的血清样品：IL-1ra(ra=受体拮抗剂)、IL-6、IL-8、IL-15、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、MCP-1(单核细胞趋化蛋白1)、MIP-1a(巨噬细胞炎性蛋白)和CD73。在图4a)-h)中，各生物标志物的水平(CD73的活性)表示为所有患者的平均值以及均值的标准误差(S.E.M)，对时间作图。第1天是指干扰素β给予前的值。第2天是指第一次干扰素β给予后22小时的值；第3天是指第二剂(第2天)后22小时的值等。第7天表示最后给予干扰素β后22小时的水平。图4显示生物标志物IL-1ra、IL-6、IL-8、IL-15和MCP-1的水平随时间即随患者恢复快速下降。另一方面，可溶性CD73活性(nmol/mL/小时)提高直到第9天，即最后一剂后两天，接着向基线值下降。生物标志物嗜伊红粒细胞趋化蛋白和MIP-1a的水平也随时间即随患者恢复提高。

实施例2

采用之前公布的基于薄层色谱法的技术在上述研究中的所示时间点(参见图5)测量受治疗的患者之一的样品的可溶性CD73活性。该名患者显示可溶性CD73活性的极强的诱导。基于使用三明治测定中俘获抗体和检测抗体的ELISA测定，测量可溶性CD73浓度。测量同一样品的等分试样的可溶性CD73的活性和浓度。图5显示可溶性CD73活性和浓度表现类似。

要认识到，本发明的方法可以各种各样实施方案的形式结合，所述实施方案仅少数公开于本文中。对本领域专业技术人员而言显而易见的是，存在其它实施方案，并且不偏离本发明的精神。因此，所述实施方案是说明性的，不应解释为限制性的。