一种把农作物秸秆转化为猪鸡饲料资源的新工艺

摘要

本发明涉及一种把农作物秸秆转化为猪鸡饲料资源的新工艺，其包括如下步骤：1）秸秆预处理方法Ⅰ：将粉碎后的农作物秸秆按固液比1g：6－9ml与质量浓度2－3%的氢氧化钠溶液混合均匀后，置于压力蒸汽灭菌锅内于121℃处理15－45min，处理后样品用酸或碱调pH至6.0±0.2，放入烘箱中烘干至恒重，用作底物，备用；2）以1.15－4.60FPU/g底物的添加量，将底物与纤维素酶混合后，在pH？4.2－6.0的条件下于30－60℃酶解24－96h，即得。本发明以玉米秸秆为研究对象，将物理、化学方法和生物学方法联合应用于秸秆资源的开发利用，先将物理方法和化学方法联合降解木质素，然后采用生物学酶解释放出半纤维素和纤维素中聚合的单糖，并研究了将其转化为猪鸡饲料资源的可能性。

说明书

技术领域

本发明属于秸秆处理技术领域，具体涉及一种把农作物秸秆转化为猪鸡饲料资源的新工艺。

背景技术

当前，粮食和饲料资源的短缺直接制约着我国畜牧业的快速发展。与此相对的是农作物秸秆资源丰富，由于缺乏有效的处理手段，除少部分被利用外，大部分被焚烧和腐烂掉，不仅造成环境污染而且还造成资源浪费。如果能把农作物秸秆转化为畜禽等单胃动物的饲料资源，将会缓解我国饲料资源的不足，并达到变废为宝目的。秸秆的主要成分为粗纤维，其中纤维素和半纤维素聚合了丰富的单糖成分，但由于木质素的存在导致这些碳水化合物无法被利用。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种把农作物秸秆转化为猪鸡饲料资源的新工艺。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种把农作物秸秆转化为猪鸡饲料资源的新工艺，其包括如下步骤：

1）将粉碎后的农作物秸秆按固液比1g：6－9ml与质量浓度2－3%的氢氧化钠溶液混合均匀后，置于压力蒸汽灭菌锅内于100－121℃处理15－45min；处理后样品用酸调pH至6.0±0.2，放入烘箱中烘干至恒重，用作底物，备用；

2）以1.15－4.60FPU/g底物的添加量，将底物与纤维素酶混合后，在pH4.2－6.0的条件下于30－60℃酶解24－96h，即得。

或者，一种把农作物秸秆转化为猪鸡饲料资源的新工艺，其包括如下步骤：

1）称取粉碎后农作物秸秆重量2－8%的氢氧化钠，用粉碎后农作物秸秆重量2倍的水配制成氢氧化钠溶液，然后与粉碎后的农作物秸秆混合均匀，置于爆破机中在压力为1.5－2.5MPa的条件下保压100－200s后在0.00875s内瞬间释放压力，爆破处理所得样品用酸调pH至6.0±0.2，放入烘箱中烘干至恒重，用作底物，备用；

2）以1.15－4.60FPU/g底物的添加量，将底物与纤维素酶混合后，在pH4.2－6.0的条件下于30－60℃酶解24－96h，即得。

所述的农作物秸秆可以是玉米秸秆、小麦秸秆等。本申请以玉米秸秆为例进行研究。

本发明研制出一种新型的生物秸秆饲料资源，其以玉米秸秆为研究对象，将物理方法、化学方法和生物学方法联合应用于秸秆资源的开发利用，先将物理方法和化学方法联合降解木质素，去除其对半纤维素和纤维素的保护作用，然后采用生物学酶解释放出半纤维素和纤维素中聚合的单糖，并研究了将其转化为猪鸡饲料资源的可能性。

附图说明

图1为葡萄糖标准曲线；

图2为不同处理后秸秆的表观结构图；

图3为不同处理后秸秆的微观结构图；

图4为不同组别饲粮消化能线性关系图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

二、氢氧化钠-蒸汽高压预处理研究

2.1材料和方法

2.1.1试验材料

2.1.1.1玉米秸秆

取自于河南省新乡市，收获后的玉米秸秆自然风干，粉碎过40目筛，装于自封袋中室温保存备用。

2.1.1.2仪器设备

粉碎机（郑州千鼎机械有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-30KBS，上海申安医疗器械厂）；PHS-2C数显酸度计（天津市赛德利斯实验分析仪器制造厂）；电热鼓风干燥箱（101型，北京中兴伟业仪器有限公司）；磁力搅拌器（金坛市中大仪器厂）；电子分析天平（AB204-N，METTLERTOLEDO）。

2.1.2试验方法

本试验先采用单因素试验，研究不同浓度氢氧化钠溶液、不同固液比浸泡玉米秸秆，在立式压力蒸汽灭菌锅121?℃条件下处理不同时间，对玉米秸秆中粗纤维成分的影响。然后根据单因素试验结果，以木质素降解率为主要指标设计三因素三水平正交试验，以期得到效果较好的处理条件组合。

2.1.2.1试验设计

2.1.2.1.1氢氧化钠浓度的确定分别配制不同质量浓度的氢氧化钠溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0%），按1:3固液比（5g玉米秸秆+15ml氢氧化钠溶液）混合秸秆，在立式压力蒸汽灭菌锅121℃条件下处理30min，处理后的样品用HCl调pH至6.0±0.2，然后放于65℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，以普通玉米秸秆为对照，测定半纤维素、纤维素和木质素的含量（每个处理做3个重复，准确记录处理前后干物质的质量）。

2.1.2.1.2固液比的确定配制质量浓度为2.0%的氢氧化钠溶液，分别按照不同的固液比（1:3.0、1:4.5、1:6.0、1:7.5、1:9.0、1:10.5）混合秸秆，在立式压力蒸汽灭菌锅121℃条件下处理30min，处理后的样品用HCl调pH至6.0±0.2，然后放于65℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，以普通玉米秸秆为对照，测定半纤维素、纤维素和木质素的含量（每个处理做3个重复，准确记录处理前后干物质的质量）。

2.1.2.1.3处理时间的确定配制质量浓度为2.0%的氢氧化钠溶液，按1:6.0固液比混合秸秆，在立式压力蒸汽灭菌锅121℃条件下分别处理15、30、45、60min，处理后的样品用HCl调pH至6.0±0.2，然后放于65℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，以普通玉米秸秆为对照，测定半纤维素、纤维素和木质素的含量（每个处理做3个重复，准确记录处理前后干物质的质量）。

2.1.2.1.4正交试验根据单因素试验的结果，各因素分别确定三个水平，按L₉（3⁴）正交表进行三因素三水平正交试验。

2.1.2.2粗纤维成分测定

2.1.2.2.1检测方法各处理样品粗纤维成分的测定采用VanSoest分析方法进行:

2.1.2.2.2试剂配制

中性洗涤剂（3%十二烷基硫酸钠）：准确称取18.6g乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠盐，C₁₀H₁₄O₈Na₂·2H₂O）和6.8g硼酸钠（Na₂B₄O₇·10H₂O）放入烧杯中，加入600ml蒸馏水，加热溶解后，再加入30g十二烷基硫酸钠（C₁₂H₂₅NaSO₄）和10ml乙二醇乙醚（C₄H₁₀O₂）；称取4.56?g无水磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）置于另一烧杯中，加200ml蒸馏水加热溶解，冷却后将上述两溶液转入1000ml容量瓶用蒸馏水定容，其pH值约为6.9～7.1（pH一般不用调整）。

酸性洗涤剂（2%十六烷基三甲基溴化铵）：称取20g十六烷基三甲基溴化铵（C₁₉H₄₂NBr，CTAB）溶于1000ml、1mol/L硫酸（1/2H₂SO₄）溶液中，搅拌溶解，必要时过滤。

72%H₂SO₄溶液：准确移取666.0ml硫酸（ρ=1.84，98%）慢慢倒入内装300ml蒸馏水的烧杯内，注意不断搅拌和冷却，并用水定容至1000ml。

2.1.2.2.3粗纤维各成分的计算

W(半纤维素)=W(NDF)－W(ADF)；

W(纤维素)=W(ADF)－W(残渣1)；

W(木质素)=W(残渣1)－W(残渣2)；

木质素降解率（%）=（处理前木质素含量-处理后木质素含量）/处理前木质素含量*100%

纤维素和半纤维素降解率计算方法同木质素降解率；

注：残渣1为72%H₂SO₄硫酸消解后的固形物质量，残渣2为残渣1经550℃灰化后的质量。

2.1.3数据统计和分析

试验数据均以“平均值±标准差”(mean±SD)表示，结果用SPASS20.0软件进行单因素方差分析，并进行Duncan多重比较，P<0.05为差异显著。

2.2结果与分析

2.2.1不同氢氧化钠浓度对玉米秸秆中粗纤维成分的影响

不同氢氧化钠浓度-蒸汽高压预处理对玉米秸秆中粗纤维成分的影响结果见表2-1。结果表明，氢氧化钠浓度在0.5－1.0%时，木质素含量与对照组相比差异不显著（P>0.05）。当浓度达到1.5%时，木质素含量与对照组相比差异显著（P<0.05），降解率为6.91%，且随着氢氧化钠浓度的增加，木质素的含量逐渐降低。在浓度为2.5%时，降解率达到38.05%，继续增加氢氧化钠浓度到3.0%时，木质素含量与氢氧化钠浓度2.5%相比差异不显著（P>0.05）。在木质素降解的同时，半纤维素也发生较大的降解，且随着浓度的增加，降解率逐渐增大，降解率最大达54.30%；在碱处理过程中，纤维素含量没有发生显著性变化（P>0.05）。根据木质素的降解效果，将正交试验氢氧化钠因素的三个水平确定为2.0、2.5、3.0%。

表2-1不同氢氧化钠浓度对玉米秸秆中粗纤维成分的影响(%，n=3，以绝干计，下同)

注：同列字母不同表示差异显著（P<0.05），

同列字母相同表示差异不显著（P>0.05）。下同。

2.2.2不同固液比对玉米秸秆中粗纤维成分的影响

不同固液比蒸汽高压预处理对玉米秸秆中粗纤维成分的影响结果见表2-2。结果表明，随着固液比的增大，木质素的含量逐渐减少，当固液比为1:6.0时木质素含量显著降低，其降解率为74.32%，在固液比达到1:7.5时木质素含量进一步降低，降解率达到87.41%，与固液比1:6.0相比差异显著（P<0.05），之后再增大固液比对木质素的降解没有显著影响（P>0.05），因此将正交试验固液比因素的三个水平确定为1:6.0、1:7.5、1:9.0。与氢氧化钠浓度处理结果一致，在木质素降解的同时还伴随着大量半纤维素的降解，随着固液比的增加，半纤维素的降解率也逐渐增大，在固液比为1:9.0时半纤维素降解率达65.71%。不同固液比处理后，玉米秸秆中纤维素含量依然没有显著性变化（P>0.05）。

表2-2不同固液比处理对玉米秸秆中粗纤维成分的影响（%，n=3）

2.2.3不同处理时间对玉米秸秆中粗纤维成分的影响

不同蒸汽高压预处理时间对玉米秸秆中粗纤维成分的影响结果见表2-3。结果表明，在处理时间为15min时木质素含量即显著性降低（P<0.05），其降解率为83.25%，之后木质素含量不再随着处理时间的延长而发生显著性变化（P>0.05）；不同的处理时间对半纤维素的降解没有较大的影响，在处理时间为15min时半纤维素的降解率即达到57.81%，处理时间延长至60min，半纤维素的降解率为63.36%；与对照组相比，不同时间处理后玉米秸秆中纤维素含量没有显著性变化(P>0.05)。根据木质素降解效果，将正交试验处理时间因素的三个水平确定为15、30、45min。

表2-3不同处理时间对玉米秸秆中粗纤维成分的影响（%）

2.2.4正交试验结果与分析

；

表2-5氢氧化钠-蒸汽高压预处理条件优化

玉米秸秆氢氧化钠-蒸汽高压预处理条件优化正交试验因素水平见表2-4，结果与分析见表2-5。结果表明，氢氧化钠浓度的最小K值为K3，固液比的最小K值为K3，处理时间的最小K值为K1，这表明氢氧化钠-蒸汽高压预处玉米秸秆理降解其木质素效果最优的条件为：氢氧化钠浓度3.0%、固液比1:9.0、处理时间15min。极差R值的大小顺序依次为氢氧化钠浓度>固液比>处理时间，这表明氢氧化钠浓度的变化对木质素降解影响较大，其次是固液比，处理时间的变化对木质素降解影响较小。经统计分析，各处理组木质素含量与对照组相比均显著降低（P<0.05），木质素降解率最大的处理组为第9组，此时木质素的降解率为89.78%。

2.2.5正交试验结果验证

由表2-6可知，最优处理组的木质素降解率为91.62%，略高于正交试验第9处理组，在此处理条件下，半纤维素和纤维素降解率分别为72.70%和6.40%。

表2-6氢氧化钠-蒸汽高压预处理条件优化验证(%)

2.3小结

以木质素降解率为主要指标，通过三因素三水平正交试验获得去除木质素较好的处理条件为：3.0%的氢氧化钠溶液，按固液比1:9.0混合秸秆，在蒸汽高压锅中121℃条件下处理15min。处理后玉米秸秆中木质素、半纤维素、纤维素的含量分别为0.50%、8.11%、35.66%，与原始秸秆相比木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为91.62%、72.70%、6.40%，这表明氢氧化钠-蒸汽高压预处理较好的降解了木质素和半纤维素，打破了纤维素的保护屏障，为微生物和酶充分利用纤维素打下了良好的基础。

三、氢氧化钠-蒸汽爆破预处理研究

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.1.1玉米秸秆

参照第二章。

3.1.1.2仪器设备

秸秆蒸汽爆破机（QBS-80B，鹤壁正道生物能源有限公司），其它仪器设备参照第二章。

3.1.2试验方法

3.1.2.1氢氧化钠-干法爆破

按玉米秸秆质量的0、2、4、6、8%比例称取氢氧化钠，将氢氧化钠与玉米秸秆混合后放于QBS-80B型秸秆爆破机中在2.5MPa条件下保压200s，然后在0.00875s内瞬间释放压力，进行爆破处理。将爆破获得样品pH调至6.0±0.2，然后放于65℃鼓风烘箱中烘干至恒重，以普通玉米秸秆为对照，测定半纤维素、纤维素和木质素的含量（每个处理做3个重复，准确记录处理前后干物质的质量）。

3.1.2.2氢氧化钠-湿法爆破

按玉米秸秆质量的0、2、4、6、8%比例称取氢氧化钠，分别用两倍玉米秸秆质量的水溶解配制成氢氧化钠溶液，然后与玉米秸秆混合均匀，放于QBS-80B型秸秆爆破机中在2.5Mpa条件下保压200s，然后在0.00875s内瞬间释放压力，进行爆破处理。将爆破获得样品pH调至6.0±0.2，然后放于65℃鼓风烘箱中烘干至恒重，以普通玉米秸秆为对照，测定半纤维素、纤维素和木质素的含量（每个处理做3个重复，准确记录处理前后干物质的质量）。

3.1.2.3粗纤维成分的测定：同上

3.2结果与分析

3.2.1氢氧化钠-干法爆破对玉米秸秆粗纤维成分的影响

由表3-1可知，与对照组相比，在干法爆破条件下普通爆破和不同浓度的氢氧化钠爆破均能显著降低半纤维素、纤维素和木质素的含量（P<0.05）。普通爆破组半纤维素、纤维素和木质素降解率分别为73.00%、4.09%、14.17%。添加不同浓度氢氧化钠爆破与普通爆破相比，木质素含量没有显著性变化（P>0.05）；半纤维素含量显著降低（P<0.05），不同浓度氢氧化钠爆破组间除浓度为6%处理组的半纤维素含量偏高外，其它浓度之间差异不显著(P>0.05)，半纤维素最高降解率为83.01%。氢氧化钠浓度为2%时纤维素含量与普通对照组相比差异不显著(P>0.05)，之后随着氢氧化钠浓度的增大，纤维素含量显著降低（P<0.05），当氢氧化钠浓度为8%时，纤维素降解率达到21.08%。

表3-1氢氧化钠-干法爆破对玉米秸秆粗纤维成分的影响（%）

3.2.2氢氧化钠-湿法爆破对玉米秸秆粗纤维成分的影响

由表3-2可知，与对照组相比，在湿法爆破条件下普通爆破和不同浓度的氢氧化钠爆破均能显著降低半纤维素和木质素的含量（P<0.05），纤维素含量无显著性变化（P>0.05）。普通爆破组半纤维素、纤维素和木质素降解率分别为76.73%、1.55%、16.04%。氢氧化钠浓度为2%时木质素含量与普通爆破组相比差异不显著（P>0.05），随着氢氧化钠浓度的增大，木质素含量显著降低（P<0.05），当氢氧化钠浓度达到8%时，木质素降解率达到74.77%（P<0.05）；不同浓度氢氧化钠处理组之间半纤维素含量差异不显著（P>0.05），其降解率约为72.77%，低于普通爆破组半纤维素降解率76.73%（P<0.05）。

表3-2氢氧化钠-湿法爆破对玉米秸秆粗纤维成分的影响

3.3小结

本试验结果表明，在干法爆破条件下，普通爆破组和不同氢氧化钠添加组均能有效降解半纤维素、纤维素和木质素；与普通爆破组相比，添加不同质量分数的氢氧化钠能够促进半纤维素和纤维素的降解，但对木质素降解作用不明显。

在湿法爆破条件下，普通爆破组和不同氢氧化钠添加组均能有效降解半纤维素和木质素，对纤维素成分无显著影响；与普通爆破组相比，添加不同质量分数的氢氧化钠促进了木质素的降解，木质素含量随氢氧化钠添加量的增大而逐渐减少。

四、生物学酶解条件优化及糖化预处理秸秆效果研究

4.1材料与方法

4.1.1试验材料

4.1.1.1玉米秸秆

参照第二章。

4.1.1.2纤维素酶

受赠于湖南尤特尔生化有限公司，滤纸酶活为57.47FPU/g。

4.1.1.3仪器设备

双层气浴振荡培养箱(HZQ-C，金坛市杰瑞尔电器有限公司)；紫外可见分光光度计（752型，上海菁华科技仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（H1850R，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；扫描电子显微镜（S-3400NII，JapanHITACHICo.,Ltd）；电热鼓风干燥箱（101型，北京中兴伟业仪器有限公司）；磁力搅拌器（金坛市中大仪器厂）；其它仪器设备参照第二章。

4.1.2试验方法

4.1.2.1纤维素酶液的制备

称取一定质量的纤维素酶粉，按1:10的比例加入蒸馏水，摇床振荡3h后先用定性滤纸过滤，除去较粗的载体残渣，然后在无菌条件下用0.25μm滤膜过滤器过滤，配制成滤纸酶活单位为5.75FPU/ml的无菌纤维素酶液。

4.1.2.2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的制备

分别配制0.1mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠溶液，根据表4-1的体积混合，然后边搅拌边加入少量的柠檬酸或柠檬酸钠调至相应pH，分别配制成pH为4.2、4.8、5.4、6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

表4-1不同pH柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配制

柠檬酸C₆H₈O₇·H₂O：分子量210.14g/mol，0.1mol/L溶液为21.014g/L；

柠檬酸钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O：分子量294.12g/mol,0.1mol/L溶液为29.412g/L。

4.1.2.3酶解底物的制备

4.1.2.3.1氢氧化钠-蒸汽高压预处理：以正交试验获得的最优处理条件进行预处理，即：用浓度为3.0%的氢氧化钠溶液按照1:9.0的固液比混合玉米秸秆，在立式压力蒸汽灭菌锅121℃条件下处理15min。

4.1.2.3.2氢氧化钠-蒸汽爆破预处理

干爆0：将普通玉米秸秆放于QBS-80B型秸秆爆破机中在2.5Mpa条件下保压200s，然后在0.00875s内瞬间释放压力，进行爆破处理；

干爆4：按秸秆质量的4%添加氢氧化钠，混合均匀后放于QBS-80B型秸秆爆破机中在2.5Mpa条件下保压200s，然后在0.00875s内瞬间释放压力，进行爆破处理；

干爆8：按秸秆质量的8%添加氢氧化钠，混合均匀后放于QBS-80B型秸秆爆破机中在2.5Mpa条件下保压200s，然后在0.00875s内瞬间释放压力，进行爆破处理；

湿爆0：用两倍玉米秸秆质量的水混合玉米秸秆后放于QBS-80B型秸秆爆破机中在2.5Mpa条件下保压200s，然后在0.00875s内瞬间释放压力，进行爆破处理；

湿爆4：用两倍玉米秸秆质量的水溶解玉米秸秆质量4%的氢氧化钠，然后与玉米秸秆混合均匀放于QBS-80B型秸秆爆破机中在2.5Mpa条件下保压200s，然后在0.00875s内瞬间释放压力，进行爆破处理；

湿爆8：用两倍玉米秸秆质量的水溶解玉米秸秆质量8%的氢氧化钠，然后与玉米秸秆混合均匀放于QBS-80B型秸秆爆破机中在2.5Mpa条件下保压200s，然后在0.00875s内瞬间释放压力，进行爆破处理。

4.1.2.4酶解条件的优化

以氢氧化钠-蒸汽高压预处理后的玉米秸秆为底物，以酶用量（1.15、2.30、3.45、4.60FPU/g）、pH（4.2、4.8、5.4、6.0）、酶解时间（24、48、72、96h）及酶解温度（30、40、50、60℃），进行四个因素四水平的正交试验，共16个处理组，每个处理组设3个重复。正交试验因素和水平见表4-2。

表4-2正交试验因素水平表

酶解：玉米秸秆经过氢氧化钠-蒸汽高压预处理后在无菌超净工作台中用盐酸调至相应的pH，加入相应的pH缓冲液和纤维素酶液，使总的固液比为1:20。

4.1.2.5生物学酶解试验设计

以普通玉米秸秆和氢氧化钠-蒸汽高压最优预处理后的秸秆为对照，对氢氧化钠-蒸汽爆破预处理秸秆进行酶解，试验分组见表4-3。

表4-3酶解试验设计与分组

4.1.2.6理化指标检测方法

4.1.2.6.1还原糖的测定

采用3,5一二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定酶解液中可溶性糖的含量。精确称取经105℃烘干至恒重的无水葡萄糖1.000g，用pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解并定容至100ml，配制成浓度为10mg/mL的标准葡萄糖液。分别吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0ml浓度为10mg/ml的标准葡萄糖液于50mL的容量瓶中，用pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至50mL，配制成浓度为0、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000μg/mL的标准溶液。取不同浓度的标准溶液1mL于25ml刻度试管中，加入3mLDNS试剂于沸水中煮沸5min，流水冷却后用蒸馏水定容至25ml，在540nm下，用紫外可见分光光度计测吸光度值，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线见图1。

4.1.2.6.2粗纤维成分的测定：同上。

4.1.2.6.3秸秆扫描电镜样品的制备

取少量普通秸秆、氢氧化钠-蒸汽高压最优条件预处理秸秆、氢氧化钠（8%）-湿法爆破预处理秸秆、氢氧化钠-蒸汽高压-酶解后秸秆、氢氧化钠（8%）-湿法爆破-酶解后秸秆放于-20℃冰箱预冷冻，然后放于冷冻干燥机干燥12h后用导电胶粘于样品台上，用HITACHIE-1010型离子溅射仪器进行真空喷金镀膜，置于S-3400NII型扫描电子显微镜下观察其微观结构。

4.1.3数据统计和分析

试验数据均以“平均值±标准差”(mean±SD)表示，结果用SPASS20.0软件进行单因素方差分析，并进行Duncan多重比较，P<0.05为差异显著。

4.2结果与分析

4.2.1酶解最优条件的确定

由表4-4可知，酶用量的最大k值为k4，pH的最大k值为k2，酶解时间的最大k值为k4，酶解温度的最大k值为k2。这表明纤维素酶酶解的最优条件为酶用量4.60FPU/g、pH4.8、酶解时间96h、酶解温度40℃。极差R值的大小顺序依次为pH>酶解温度>酶用量>酶解时间，这表明pH的变化对酶解糖化效果的影响最大，其次为酶解温度和酶用量，酶解时间的变化对酶解糖化的影响较小。

表4-4纤维素酶解条件优化

4.2.2生物学酶解对预处理秸秆糖化效果的研究

利用最优酶解条件对各预处理秸秆进行酶解，还原糖产量结果见表4-5。结果表明，生物学酶解能够显著提高秸秆可溶性糖的含量（P<0.05），酶解后还原糖含量最高的处理组为氢氧化钠-蒸汽高压最优处理组，其还原糖含量达到575.51mg/g，与酶解前相比提高了47倍，与原始秸秆相比提高了5.21倍；其次为氢氧化钠8%-湿法爆破处理组，还原糖含量达到508.17mg/g，与酶解前相比提高了43.54倍，与原始秸秆相比提高了4.49倍。氢氧化钠-干法爆破处理酶解前还原糖含量表现出随着氢氧化钠浓度的增大逐渐减少的趋势(P<0.05)，酶解后三个不同氢氧化钠处理组之间还原糖含量没有显著性差异（P>0.05）。氢氧化钠-湿法爆破处理酶解前还原糖含量也表现出随着氢氧化钠浓度的增大逐渐减少的趋势(P<0.05)，但酶解后表现出随着氢氧化钠浓度的增大逐渐升高的趋势(P<0.05)。

表4-5酶解对还原糖产量的影响（mg/g）

注：同列大写字母不同表示差异显著（P<0.05），

同行小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。下同。

4.2.3酶解前后粗纤维成分的变化

4.2.3.1酶解前后半纤维素含量的变化

表4-6酶解对半纤维素含量的影响（%）

酶解前后各处理秸秆中半纤维素含量的变化见表4-6。结果表明，生物学酶解能够显著降低各处理组秸秆中的半纤维素的含量(P<0.05)，其中氢氧化钠-蒸汽高压最优处理组酶解后半纤维素降解率最大，与酶解前对比降解率达到94.38%，与原始秸秆相比降解率达到98.57%。氢氧化钠-蒸汽爆破处理组中以氢氧化钠(8%)-湿法爆破处理组较好，与酶解前相比降解率为84.25%，与原始秸秆相比降解率为95.72%。

4.2.3.2酶解前后纤维素成分的变化

由表4-7可知，生物学酶解能够显著降解各处理组秸秆中纤维素成分的含量(P<0.05)，其中氢氧化钠-蒸汽高压最优处理组酶解后纤维素降解率最大，与酶解前相比降解率达到93.33%，与原始秸秆相比降解率达到94.10%。氢氧化钠-蒸汽爆破处理组中以氢氧化钠(8%)-湿法爆破处理组较好，与酶解相比降解率为83.49%，与原始秸秆相比降解率为85.21%。

表4-7酶解前后纤维素含量的变化(%)

4.2.3.3酶解前后木质素成分的变化

由表4-8可知，生物学酶解对各处理秸秆中木质素成分没有显著性影响，酶解前后木质素含量无显著性差异(P>0.05)。

表4-8酶解对木质素含量的影响

4.2.4理化预处理与酶解对秸秆表观和微观结构的影响

不同处理后秸秆的表观结构见图2。由图2可见，氢氧化钠-蒸汽高压预处理对玉米秸秆的表观结构没有较大的影响，而氢氧化钠-蒸汽爆破预处理则明显改变了玉米秸秆的表观结构，爆破后的秸秆质地膨松柔软，硬度和尺寸降低，带有爆米花的清香味。氢氧化钠-蒸汽高压和氢氧化钠-蒸汽爆破预处理秸秆辅以酶解后均显著降低了秸秆的尺寸，变为粉末状，肉眼几乎看不到秸秆的存在。

对普通秸秆、氢氧化钠-蒸汽高压最优处理、氢氧化钠(8%)-湿法爆破、氢氧化钠-蒸汽高压最优处理-酶解、氢氧化钠(8%)-湿法爆破-酶解处理后的秸秆进行扫描电子显微镜观察，不同处理秸秆的微观结构见图3。由图3可见，普通秸秆表面光滑平整，结构致密完整，经不同处理后，秸秆表面结构均受到不同程度的破坏。氢氧化钠-蒸汽高压预处理后结构较为完整，但秸秆表面与对照组相比较为粗糙，蜡质层被破坏，二氧化硅溶解形成了许多坑洞，暴露出纤维束成分；氢氧化钠-蒸汽爆破预处理后秸秆结构被破坏，断裂成较多细小的结构，断裂面增加，秸秆表面有破坏但仍有部分较为平整；氢氧化钠-蒸汽爆破-酶解后秸秆被彻底破坏，看不到完整的秸秆结构，被降解成密密麻麻的小分子物质；氢氧化钠-蒸汽爆破-酶解后秸秆结构进一步减小，秸秆表面较为粗糙。

4.3小结

以氢氧化钠-蒸汽高压预处理后的秸秆为底物，在底物浓度为50g/L，转速200r/min条件下，利用四因素四水平正交试验对纤维素酶的酶解条件（酶用量、pH、温度、时间）进行优化。结果表明：纤维素酶用量4.6FPU/g秸秆、pH4.8、温度40℃、酶解96h，此条件下还原糖得率最大。

在最佳酶解条件下对氢氧化钠-蒸汽高压、氢氧化钠-干法爆破和氢氧化钠-湿法爆破的秸秆进行酶解。结果表明：酶解均显著提高了各处理组的还原糖含量，其中氢氧化钠-蒸汽高压-酶解组还原糖产量最大，达575.51mg/g，其次为氢氧化钠(8%)-湿法爆破-酶解组，还原糖产量为508.17mg/g。去除秸秆中的木质素可以促进半纤维素和纤维素的酶解，提高还原糖产量。

对普通秸秆、氢氧化钠-蒸汽高压、氢氧化钠(8%)-湿法爆破、氢氧化钠-蒸汽高压-酶解、氢氧化钠(8%)-湿法爆破-酶解处理后的秸秆，使用扫描电镜观察其微观结构。结果表明，各处理均破坏了秸秆表面光滑平整的结构，其中氢氧化钠-蒸汽高压-酶解后的秸秆结构被彻底破坏，充分降解为小分子物质。本试验确定了两种还原糖产量较高的处理方式，即氢氧化钠-蒸汽高压-酶解和氢氧化钠(8%)-湿法爆破-酶解，利用这两种方式制备生物秸秆饲料，用作后续的代谢试验。

五、生物秸秆表观代谢能的测定

5.1材料与方法

5.1.1试验材料

5.1.1.1玉米秸秆

见第二章。

5.1.1.2饲料原料

取自河南德邻生物制品有限公司

5.1.1.2仪器设备

同第四章

5.1.2.3生物秸秆的制备

氢氧化钠-蒸汽高压预处理：用3.0%的氢氧化钠溶液按照1:9固液比混合秸秆，在立式高压蒸汽灭菌器中121℃处理15min；

氢氧化钠-蒸汽爆破预处理：用2倍玉米秸秆质量的水溶解玉米秸秆质量8%的氢氧化钠，与玉米秸秆混合均匀后，放于QBS-80B型秸秆爆破机中在2.5Mpa条件下保压200s，然后在0.00875s内瞬间释放压力，进行爆破处理；

生物学酶解：在pH4.8条件下，按照每克底物添加4.60FPU纤维素酶，以总固液比1:20配制酶解体系，在40℃恒温摇床培养箱中酶解96h，转速200r/min。

5.1.2试验方法

5.1.2.1强饲法测定生物秸秆的表观代谢能

选用15只公鸡（平均体重1.93±0.12kg），随机分成3个处理组，每组5个重复，每个重复1只鸡，进行单笼编号饲养。对照组饲喂30g普通秸秆，试验1组饲喂30g普通秸秆制成的生物秸秆Ⅰ，试验2组饲喂30g普通秸秆制成的生物秸秆Ⅱ。试验分组见表5-1。

表5-1强饲法测定鸡生物秸秆表观代谢能的试验设计

采用全收粪法测定鸡表观代谢能，剪去鸡肛门周围的羽毛，并系上收粪袋，预试期5d，预试期内饲喂基础日粮，最后一顿饲喂30g供试料；第二天早上8:00开始禁食，禁食48h，使之排空消化道内容物，禁食期间自由饮水；禁食期结束后每只鸡强饲30g供试料，强饲后及时系上新的收粪袋，准确记录每只鸡的强饲时间，正式期48h，每12h收集一次粪便，粪便收集后立即加入10%盐酸，放于电热鼓风干燥器中65℃烘干，混合每只鸡48h内风干排泄物并记录其质量，粉碎过40目筛备用。

饲料和排泄物总能的测定：饲料和排泄物中能量的测定采用德国IKA公司生产的全自动氧弹量热仪(IKA-C2000)进行。

试验日粮表观代谢率（AMR）和表观代谢能（AME）的计算公式如下：

AMR=（E₁－E₂）/E₁*100

AME=（E₁－E₂）/F_I

式中：E₁为总能采食量，E₂为总能排出量，F_I为饲料采食量。

5.1.2.2套算法测定生物秸秆的表观代谢能

选用20只公鸡（平均体重2.05±0.14kg），随机分成4个处理组，每组5个重复，每个重复1只鸡，进行单笼编号饲养。对照组饲喂50g基础日粮，试验1组饲喂用15g生物秸秆Ⅰ替代30%基础日粮，试验2组饲喂用15g生物秸秆Ⅱ替代30%基础日粮，试验3组饲喂用25g生物秸秆Ⅱ替代50%基础日粮，试验分组见表5-2。基础日粮营养水平参照NRC（1994）标准配制，基础日粮的饲料配方和营养水平见表5-3。

表5-2套算法测定鸡生物秸秆表观代谢能的试验设计

表5-3基础日粮的组成与营养水平(%)

采用全收粪法测定鸡表观代谢能的操作流程同上。基础日粮和试验日粮表观代谢率（AMR）和表观代谢能（AME）的计算公式如下：

AMR=（E₁－E₂）/E₁*100

AME=（E₁－E₂）/F_I

式中：E₁为总能采食量，E₂为总能排出量，F_I为饲料采食量。

生物秸秆能量表观代谢率（AMR）的计算公式如下：

式中：AMR为生物秸秆的能量表观代谢率，A为基础日粮能量表观代谢率，B为套算后混合日粮能量表观代谢率，F为生物秸秆占混合日粮的比例。生物秸秆表观代谢能的计算公式同能量表观代谢率。

5.2结果与分析

5.2.1强饲法测定鸡对生物秸秆的表观代谢能

由表5-4可知，生物秸秆Ⅰ和生物秸秆Ⅱ的表观代谢率（AMR）和表观代谢能（AME）差异不显著（P>0.05），但均显著高于普通秸秆（P<0.05），生物秸秆Ⅰ和生物秸秆Ⅱ与普通秸秆相比其表观代谢率分别提高了5.55倍和4.99倍（P<0.05），表观代谢能分别提高了5.53倍和5.10倍。

表5-4强饲法测定生物秸秆的鸡表观代谢率和表观代谢能

5.2.2套算法测定鸡对生物秸秆的表观代谢能

由表5-5可知，试验1组和试验2组的表观代谢能差异不显著（P>0.05），二者均显著低于基础日粮的表观代谢能（P<0.05）。推算出来生物秸秆Ⅰ和生物秸秆Ⅱ的表观代谢能分别为8.87和8.66MJ/Kg，二者差异不显著（P>0.05）且均显著低于基础日粮和试验日粮（P<0.05）。

表5-5套算法测定生物秸秆的鸡表观代谢率和表观代谢能

5.3小结

本试验采用两种常用的代谢能评定方法即强饲法和套算法，对生物秸秆的表观代谢能进行测定。结果表明，强饲法测定出普通秸秆、生物秸秆Ⅰ和生物秸秆Ⅱ的表观代谢能分别为1.69、9.35、8.62MJ/Kg；套算法测定出生物秸秆Ⅰ和生物秸秆Ⅱ的表观代谢能分别为9.01MJ/Kg及8.66-8.91MJ/Kg。两种方法的测定结果无显著性差异。

本研究制备的生物秸秆表观代谢能分别是普通秸秆和小麦麸的5.3和1.3倍，与豆粕的代谢能（9.62MJ/Kg）相当，约为玉米表观代谢能的67%，显著提高了秸秆的营养价值。这表明生物秸秆饲料可以作为一种非常规饲料资源应用到鸡的生产中，对于缓解我国饲料粮的短缺问题具有重要意义。

六、生物秸秆的猪表观消化能测定

6材料和方法

6.1生物秸秆的制备：同前。

6.2试验动物与日粮

6.2.1消化试验的设计与分组

选取28头健康的体重在70kg左右的阉割育肥公猪，随机分成四组，每组7头，对照组饲喂基础日粮。试验组1、2和3分别饲喂以5%、10%和15%的生物秸秆Ⅰ来替代相应比例的玉米。分组如下：

6.2.2试验日粮的组成及营养水平

试验日粮的组成及营养水平见6-1。

6.3试验方法

消化试验共设8天，其中预试期5d，正试期3d，在正式期的三天内，每天采集新鲜的粪便。粪便收集后立即加入10%硫酸，在60～65℃烘干称重，粉碎后过40目筛备用。同时将各组仔猪采食的饲粮样品进行备份。对饲料和粪便中的营养成分和酸不溶灰分进行检测，计算饲粮中能量的消化率。

利用4NHCl的不溶灰分测定饲粮的消化率。

消化能=饲料中总能×能量消化率(%)。

表6-1基础日粮的组成及营养水平(%)

6.4结果与分析

本研究用斜率法来测定猪生物秸秆的表观消化能：各组饲粮的表观消化能见表6-2，由此可知，随着生物秸秆的添加量的不断增加，饲粮中的消化能不断减小，且与添加比例呈线性关系。由图4可知，相关系数R²=0.9975，说明结果可信。该曲线的斜率值K=9.5312即使生物秸秆的表观消化能。即生物秸秆猪的表观消化能为9.5312MJ/kg.。

表6-2各组饲粮消化能值

总结

本申请采用理化预处理去除玉米秸秆中的木质素，然后联合生物学酶解将纤维素降解成单胃动物可利用的单糖，并研究了秸秆饲料对鸡和猪的表观代谢能，结果如下：

1）对氢氧化钠-蒸汽高压预处理和氢氧化钠-蒸汽爆破预处理条件进行了研究，获得去除木质素效果较好的条件为：①用浓度为3.0%的氢氧化钠溶液按固液比1:9.0混合玉米秸秆在立式蒸汽高压灭菌锅内121℃处理15min，木质素去除率为91.62%；②用浓度为4%的氢氧化钠溶液按固液比1:2混合秸秆在蒸汽爆破机中2.5MPa条件下保压200s后瞬间释放，木质素降解率为74.77%。

2）对纤维素酶解条件进行优化，获得最佳酶解条件为：在底物浓度为50g/L，转速200r/min条件下，每克底物添加4.60FPU纤维素酶、pH4.8、40℃酶解96h。对预处理秸秆进行酶解，氢氧化钠-蒸汽高压最优处理和氢氧化钠-蒸汽爆破最优处理组酶解后，获得了较高的还原糖产量，分别为575.71和508.17mg/g。

3）按上述两种还原糖产量较高的秸秆处理工艺，即氢氧化钠-蒸汽高压-酶解和氢氧化钠-蒸汽爆破-酶解制备生物秸秆饲料。氢氧化钠-蒸汽高压-酶解饲料采用强饲法和套算法测定的表观代谢能分别为9.35和9.01MJ/Kg；氢氧化钠-蒸汽爆破-酶解饲料采用强饲法和套算法测定的表观代谢能分别为8.62和8.79MJ/Kg。两种方法测定的两种生物秸秆饲料表观代谢能差异不显著，但均显著高于普通秸秆的表观代谢能(1.69MJ/Kg)。本研究制备的生物秸秆表观代谢能分别是普通秸秆和小麦麸的5.3和1.3倍，与豆粕的代谢能（9.62MJ/Kg）相当，约为玉米表观代谢能的67%，显著提高了秸秆的营养价值。另外，生物秸秆猪的表观消化能为9.5312MJ/kg。这表明生物秸秆饲料可以作为一种非常规饲料资源应用到猪鸡的生产中，对于缓解我国饲料粮的短缺问题具有重要意义。