包含含有大量活性成分的从东北婆婆纳中分离的纯化提取物或从此分离的化合物作为用于预防或治疗慢性阻塞性肺病的活性成分的组合物及其用途

摘要

本发明涉及一种组合物及其用途，所述组合物包含含有大量活性成分的从东北婆婆纳(Pseudolysimachion？rotundum？var.subintegrum)中分离的纯化提取物或从此分离的化合物作为用于预防或治疗慢性阻塞性肺病的活性成分。通过各种体内试验和体外试验，本发明的纯化提取物和化合物显示出有效力的抗COPD活性而无β-2-受体对抗应答。因此，其可以用作用于治疗和预防慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗或功能性保健食品。

说明书

技术领域

本发明涉及一种组合物及其用途，所述组合物包含含有大量活性成分的从东北婆婆纳 (Pseudolysimachionrotundumvar.subintegrum)中分离的纯化提取物或从此分离的化合物 作为用于预防或治疗慢性阻塞性肺病的活性成分。

背景技术

通常，慢性阻塞性肺病(COPD)是由导致呼吸道阻塞的肺的异常炎性疾病引起的肺 病之一。COPD导致由排出气流阻碍引起的呼吸困难并显示出与哮喘的常见特征不同的特 征，例如，气道限制或气道阻塞的不良可逆性，根据经过时间的逐步发展等，并且，可以 分成肺气肿和慢性阻塞性支气管炎(BarnesP.J.20014,Mediatorsofchronicobstructive pulmonarydisease,Pharmacol.Rev.56:515-548)。

COPD已经被报道为2011年世界范围心血管发病率和死亡率的危险因素之一和第五 主要死亡原因。基于慢性阻塞性肺病(COPD)标准(FEV1和FVC的比小于0.7)的全球倡 议的慢性阻塞性肺病的患病率在45岁以上的韩国人中是17.2％(男性,25.8％；女性, 9.6％)(DongSoonKim,YoungSamKim,Ki-SuckJung,JungHyunChang,Chae-ManLim, JaeHoLee,Soo-TaekUh,JaeJeongShim和WooJinLew,代表韩国肺结核与呼吸道疾病研 究院(KoreanAcademyofTuberculosisandRespiratoryDiseases),AmJRespirCritCareMed Vol172.pp842-847,2005；DonD.Sin和S.F.PaulMan,ChronicObstructivePulmonary DiseaseasaRiskFactorforCardiovascularMorbidityandMortality,ProcAmThoracSocVol 2.pp8-11,2005；ASoniaBuist,MaryAnnMcBurnie,WilliamMVollmer,SuzanneGillespie, PeterBurney,DavidMMannino,AnaMBMenezes,SeanDSullivan,ToddALee,KevinB Weiss,RobertLJensen,GuyBMarks,AmundGulsvik,EwaNizankowska-Mogilnicka, InternationalvariationintheprevalenceofCOPD(TheBOLDStudy):apopulation-based prevalencestudy,Lancet,Vol370；741-750,2007年9月1日)

患有COPD的大多数患者具有全部三种病理学机制(慢性阻塞性支气管炎、肺气肿和 粘液性阻塞)因为全部由吸烟诱导，但是他们可在肺气肿和阻塞性支气管炎的比例方面不 同。在发达国家，吸烟是COPD的最常见的起因，但是有一些其他危险因素，包括空气 污染(尤其是,来自燃烧燃料的室内空气污染)、不良饮食和职业性暴露。COPD以随年龄 的增长可见的肺功能正常下降的加快为特征。缓慢发展的气流限制导致残疾和早产儿死 亡，并且，与可变气道阻塞和很少发展为严重程度的哮喘的症状完全不同。

已经报道的是，COPD的病理生理活动和症状与哮喘的病理生理活动和症状根本不 同。尽管COPD和哮喘两者与呼吸道的炎症有关，但是就发炎过程的本质而言有显著差 异，具有炎性细胞、介体、炎症反应、结构分布和抗炎症治疗反应的不同，例如，(a)对 于炎性细胞，肥大细胞、嗜酸性粒细胞、D4+细胞(Th2)、巨噬细胞等主要作用于哮喘的 发生，而嗜中性粒细胞、CD8+(Tc)等主要作用于COPD的发生；(b)对于炎性介体，白 三烯B、组胺、IL-4、IL-5、Il-13、嗜酸性粒细胞趋化因子、RENTES、氧化应激等主要 涉及哮喘的发生，而TNF-α、IL-8、GRO-α等主要涉及COPD的发生；(c)对于发炎症 状，哮喘因在早期作用于总肺气管而显示出的发炎症状(如AHR(气道高反应性)、上皮 脱落、纤维化、无软组织参与、粘液分泌、相对可逆的气道阻塞、咳嗽、打喷嚏、呼吸困 难等)与通过作用于成人的外周气道发生并且显示出各种现象(如上皮化生、实质破坏、 相对可逆的气道阻塞、慢性支气管炎、肺气肿等)的COPD的发炎症状不同(BarnesPJ (2000b)MechanismsinCOPD:differencesfromasthma.Chest117(Suppl):10S-14S.；Saetta M,TuratoG,MaestrelliP,MappCE和FabbriLM(2001)Cellularandstructuralbasesof chronicobstructivepulmonarydisease.Am.J.Respir.Crit.CareMed.163:1304-1309)。

COPD的组织病理学研究显示出外周气道(细支气管)和肺实质的主要参与，而哮喘 包括所有气道的炎症而不包括肺实质。随纤维化和巨噬细胞和T淋巴细胞的渗透，有细 支气管阻塞。既存在肺实质的破坏也存在巨噬细胞和CD8(细胞毒素的)T淋巴细胞数的 增加(SaettaM,DiStefanoA,TuratoG,FacchiniFM,CorbinoL,MappCE,MaestrelliP, CiacciaA和FabbriLM(1998)CD8T-lymphocytesinperipheralairwaysofsmokerswith chronicobstructivepulmonarydisease.Am.J.Respir.Crit.CareMed.157:822-826.)。支气管 的活组织检查显示出在患有严重COPD的患者中具有巨噬细胞和CD8细胞的渗透和嗜中 性粒细胞数增加的相似变化(DiStefanoA,CapelliA,LusuardiM,BalboP,VecchioC, MaestrelliP,MappCE,FabbriLM,DonnerCF和SaettaM(1998)Severityofairflow limitationisassociatedwithseverityofairwayinflammationinsmokers.Am.J.Respir.Crit. CareMed.158:1277-1285.)。

不同于哮喘，除了在恶化期间或当患者具有伴发性哮喘时，嗜酸性粒细胞不显著 (FabbriL,BegheB,CaramoriG,PapiA和SaettaM(1998)Similaritiesanddiscrepancies betweenexacerbationsofasthmaandchronicobstructivepulmonarydisease.Thorax 53:803-808；FabbriLM,RomagnoliM,CorbettaL,CasoniG,BusljeticK,TuratoG,Ligabue G,CiacciaA,SaettaM和PapiA(2003)Differencesinairwayinflammationinpatientswith fixedairflowobstructionduetoasthmaorchronicobstructivepulmonarydisease.Am.J.Respir. Crit.CareMed.167:418-424.)。

因此，慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗方法将不同于哮喘的治疗方法，但是，现有 疗法已经致力于非特定地治疗两种疾病。因此，尚无抗炎疗法特定地批准用于COPD，并 且可用的抗炎疗法起初被开发用于哮喘。面对COPD的研究的挑战是多方面的；潜藏在 该疾病下的复杂和多样的病理学的机制需要阐明；需要确认疾病发展中炎症的作用(Hele Dj,BelvisiMG,2003.Noveltherapiesforthetreatmentofinflammatoryairwaydisease,Expert. Opino.Invest.Drug,12:5-18；JCraigFox和MaryFFitzgerald；Theroleofanimalmodelsin thepharmacologicalevaluationofemerginganti-inflammatoryagentsforthetreatmentof COPD,CurrentOpinioninPharmacology2009,9:231-242)。

对较长效β激动剂、较安全类固醇和结合疗法形式的治疗哮喘有用的现有疗法的改善 正在不断进行，并且向COPD抗胆碱能药提供症状缓解。已经利用类固醇来治疗恶化， 但是，到现在为止，尚无疗法显示出对COPD中的肺功能的逐渐下降或哮喘的发展有显 著影响。

因此，直到现在有很多研究来开发可能成功或特定治疗COPD的新药。

本发明的发明人已经致力于开发源自具有安全性和功效的天然资源(如，具有抑制炎 性细胞繁殖的活性的效力的植物、动物等)的有效力的治疗剂，并且最终发现长叶婆婆纳 (Pseudolysimachionlongifolium)的提取物显示出有效力的抗发炎、抗过敏和抗哮喘活性 (韩国专利第10-860080号)，并且从此分离的各种化合物，如毛蕊花甙(6-O-3,4-二羟基苯 甲酰基梓醇)、胡黄连苷II(6-O-4-羟基-3-甲氧基苯甲酰基梓醇)、梓醇6-咖啡酸酯(6-O-3,4- 二羟基肉桂酰基梓醇)、6-O-藜芦酰梓醇(6-O-3,4-二甲氧基苯甲酰基梓醇)、米内甙 (minecoside)(6-O-3-羟基-4-甲氧基肉桂酰基梓醇)、梓醇等，也显示出有效力的抗发炎、抗 过敏和抗哮喘活性(韩国专利公开第10-2006-125499号)。

东北婆婆纳是分布在韩国、中国、日本、萨哈林岛(OstrovSakhalin)、和俄罗斯的多 年生草本植物。

基于在韩国专利第10-860080号中公开的长叶婆婆纳的提取物的抗发炎、抗过敏和抗 哮喘活性的先前研究，本发明的发明人已尝试开发从东北婆婆纳的提取物分离的显示抗 炎、抗过敏和抗哮喘活性的更有效且更大量的成分的更有效率的制备方法。

然而，尚未有报道或公开有关用于制备从东北婆婆纳的提取物分离的比在上述引用的 文献中更有效且更大量的显示抗炎、抗过敏和抗哮喘活性的成分的有效方法，上述引用的 文献所公开的内容在此通过引用并入本文中。

因此，本发明的发明人已经发现用于从东北婆婆纳的提取物制备含有较大量活性成分 (如，梓醇)的纯化提取物的新工业化方法，并且通过利用BALB/c雄性小鼠进行的各种 体内试验(例如，由COPD发生导致的招募至肺的炎性免疫细胞和嗜中性粒细胞的增殖 和活性的抑制试验；参与肺细胞的损坏的趋化因子(如，MIP-2/CXCL-2、TNF-α、 KC/CXCL-1(趋化因子Gro-α)和CXCL-8等)的再生的抑制试验；在利用SPF(无特定病原 体)Sprague-Dawley大鼠的动物试验中通过降低NF-κB活性减少对IL-1β、IL-6、TNF-α 和MMP-9表达的释放的影响)以及在分子表达谱变化试验中诱导对Th2细胞的IL-4-表 达的影响的体外试验(例如，对MUC5AC(低聚粘液/凝胶形成)的表达的抑制试验)，所 述纯化提取物和从此分离的化合物显示出有效力的抗COPD活性而无β-2-受体对抗应答。

发明内容

技术问题

本发明提供一种包含来自东北婆婆纳的含有活性成分(如梓醇衍生物)的新纯化提取 物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇的至 少一种化合物的药物组合物和保健食品，以治疗和预防慢性阻塞性肺病(COPD)。

本发明还提供来自东北婆婆纳的含有活性成分(如梓醇衍生物)的新纯化提取物或选 自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇的至少一种 化合物用于治疗和预防慢性阻塞性肺病(COPD)的用途。

本发明还提供治疗或预防哺乳动物的慢性阻塞性肺病(COPD)的方法，其包括向该 哺乳动物施用有效量的来自东北婆婆纳的含有活性成分(如梓醇衍生物)的新纯化提取物 或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇的至少 一种化合物，和它们制药上可接受的载体。

技术方案

因此，本发明的目的是提供一种包含来自东北婆婆纳的含有活性成分(如梓醇衍生物) 的新纯化提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜 芦酰梓醇的至少一种化合物的药物组合物和保健食品，以治疗和预防慢性阻塞性肺病 (COPD)。

在此公开的术语“梓醇衍生物”包括毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和 6-O-藜芦酰梓醇等。

在此公开的术语“东北婆婆纳”包括培养的或天然生长的植物和市售的植物，但不意 欲限制到上述范围内。

在此公开的术语“新的纯化提取物”包含：(a)用丁醇分馏的纯化提取物(下文中称 为“ATC1”)和(b)用二级分馏的纯化提取物(下文中称为“ATC2”)。

具体地，术语“用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)”的特征在于，基于东北婆婆纳的 总提取物的重量(100％)，含有15-50％(w/w)毛蕊花甙、0.3-10％(w/w)藜芦酸、 0.5-10％(w/w)梓苷、0.3-10％(w/w)胡黄连苷II、0.3-10％(w/w)异香草酰梓醇 和0.3-10％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；优选地，基于东北婆婆纳的总提取物的重量(100％)， 含有20-25％(w/w)毛蕊花甙、0.5-5％(w/w)藜芦酸、1-5％(w/w)梓苷、0.5-5％ (w/w)胡黄连苷II、0.5-5％(w/w)异香草酰梓醇和1-5％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；

和/或，其特征在于，在东北婆婆纳的总提取物(100％)中含有12.3-47％(w/w) 梓苷衍生物，且各种梓苷衍生物的重量之间具有如下的相对混合比(w/w)：15.0-18.0份 (w/w)毛蕊花甙、2.10-2.60份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.00-1.30份 (w/w)异香草酰梓醇以及2.00-2.30份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；优选地，16.0-17.0份 (w/w)毛蕊花甙、2.20-2.50份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.10-1.20份 (w/w)异香草酰梓醇以及2.10-2.20份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；更优选地，16.20-16.99 份(w/w)毛蕊花甙、2.40-2.45份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.10-1.19 份(w/w)异香草酰梓醇、2.10-2.19份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇。

更具体地，术语“用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)”的特征在于，通过如下方法制 备：在第一步中，向干燥的东北婆婆纳中加入选自水、C1-C4低级醇(例如甲醇、乙醇、 丁醇等)或它们的混合物的至少一种提取溶剂，优选水和乙醇的混合物，更优选30–80％ (w/w)乙醇的水溶液；在第二步中，在10至100℃、优选20至90℃的温度范围内进行 选自热水回流提取、冷水提取、超声波处理或常规提取(优选冷水提取接着回流提取)中 的至少一种提取方法30分钟至72小时、优选6至48小时的时间，更优选地，在10至 60℃、优选20至50℃的温度范围内进行冷水提取30分钟至72小时、优选6至48小时 的时间，然后在40至120℃、优选60至90℃的温度范围内进行回流提取30分钟至72 小时、优选6至48小时的时间，反复进行，以获得第一提取物；在第三步中，将所述第 一提取物悬浮在约0.5-10倍体积(v/v)、优选约1-5倍体积(v/v)的水中，以得到悬 浮提取物；以及加入约0.5-20倍体积(v/v)、优选约1-10倍体积(v/v)的丁醇，分 馏为水层和丁醇层并收集丁醇层以得到用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)，以治疗和预防 慢性阻塞性肺病(COPD)，基于东北婆婆纳的总提取物的重量(100％)，所述用丁醇分 馏的纯化提取物含有15-50％(w/w)毛蕊花甙、0.3-10％(w/w)藜芦酸、0.5-10％(w/w) 梓苷、0.3-10％(w/w)胡黄连苷II、0.3-10％(w/w)异香草酰梓醇和0.3-10％(w/w) 6-O-藜芦酰梓醇。

因此，在本发明的另一个实施方式中，本发明还提供了用于制备从东北婆婆纳中分离 出的用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)的方法，包括以下步骤：在第一步中，向干燥的 东北婆婆纳中加入选自水、C1-C4低级醇(例如甲醇、乙醇、丁醇等)或它们的混合物 的至少一种提取溶剂，优选水和乙醇的混合物，更优选30–80％(w/w)乙醇的水溶液； 在第二步中，在10至100℃、优选20至90℃的温度范围内进行选自热水回流提取、冷水 提取、超声波处理或常规提取中的至少一种提取方法30分钟至72小时，优选6至48小 时的时间，优选冷水提取后接着回流提取，更优选地，在10至60℃、优选20至50℃的 温度范围内进行冷水提取30分钟至72小时、优选6至48小时的时间，然后在40至120℃、 优选60至90℃的温度范围内进行回流提取30分钟至72小时、优选6至48小时的时间， 反复进行，以获得第一提取物；在第三步中，将所述第一提取物悬浮在约0.5-10倍体积 (v/v)、优选约1-5倍体积(v/v)的水中，以得到悬浮提取物；以及加入约0.5-20 倍体积(v/v)、优选约1-10倍体积(v/v)的丁醇，分馏为水层和丁醇层并收集丁醇层 以得到用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)，以治疗和预防慢性阻塞性肺病(COPD)，基 于东北婆婆纳的总提取物的重量(100％)，所述用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)含有 15-50％(w/w)毛蕊花甙、0.3-10％(w/w)藜芦酸、0.5-10％(w/w)梓苷、0.3-10％ (w/w)胡黄连苷II、0.3-10％(w/w)异香草酰梓醇和0.3-10％(w/w)6-O-藜芦酰梓 醇。

具体地，术语“用二级分馏的纯化提取物(ATC2)”的特征在于，基于东北婆婆纳的 总提取物的重量(100％)，含有30-60％(w/w)毛蕊花甙、0.5-10％(w/w)藜芦酸、2 -20％(w/w)梓苷、1-10％(w/w)胡黄连苷II、1-10％(w/w)异香草酰梓醇和2-20％ (w/w)6-O-藜芦酰梓醇；优选地，基于东北婆婆纳的总提取物的重量(100％)，含有40 -50％(w/w)毛蕊花甙、1-5％(w/w)藜芦酸、3-10％(w/w)梓苷、2-5％(w/w) 胡黄连苷II、2-8％(w/w)异香草酰梓醇和3-8％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；

和/或，其特征在于，在东北婆婆纳的总提取物(100％)中含有36.5-91％(w/w) 梓苷衍生物，且各种梓苷衍生物的重量之间具有如下的相对混合比(w/w)：13.0-16.0份 (w/w)毛蕊花甙、2.20-2.50份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.10-1.40份 (w/w)异香草酰梓醇以及2.00-2.20份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；优选地，14.0-15.0份 (w/w)毛蕊花甙、2.30-2.45份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.20-1.35份 (w/w)异香草酰梓醇以及2.00-2.10份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；更优选地，14.50-14.99 份(w/w)毛蕊花甙、2.35-2.43份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.25-1.34 份(w/w)异香草酰梓醇、2.01-2.09份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇。

更具体地，术语“用二级分馏的纯化提取物(ATC2)”的特征在于，通过如下方法制 备：在第一步中，向干燥的东北婆婆纳中加入选自水、C1-C4低级醇(例如甲醇、乙醇、 丁醇等)或它们的混合物的至少一种提取溶剂，优选水和乙醇的混合物，更优选30-80 (w/w)乙醇的水溶液；在第二步中，在10至100℃、优选20至90℃的温度范围内进行 选自热水回流提取、冷水提取、超声波处理或常规提取的至少一种提取方法30分钟至72 小时、优选6至48小时的时间，优选冷水提取后，接着回流提取，更优选地，在10至 60℃、优选20至50℃的温度范围内进行冷水提取30分钟至72小时、优选6至48小时 的时间，然后在40至120℃、优选60至90℃的温度范围内进行回流提取30分钟至72 小时、优选6至48小时的时间，反复进行，以获得第一提取物；在第三步中，将所述第 一提取物悬浮在约0.5-10倍体积(v/v)、优选约1-5倍体积(v/v)的水中，以得到悬 浮提取物；在第三步中，加入约0.5-20倍体积(v/v)、优选约1-10倍体积(v/v) 的丁醇，分馏为水层和丁醇层并收集丁醇层以得到用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)；以 及对用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)进行选自反相分配色谱、正相分配色谱、离子交 换色谱以及尺寸排斥色谱的至少一种纯化工艺以得到用二级分馏的纯化提取物(ATC2)， 以治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)，基于东北婆婆纳的总提取物的重量(100％)， 所述用二级分馏的纯化提取物(ATC2)含有30-60％(w/w)毛蕊花甙、0.5-10％(w/w) 藜芦酸、2-20％(w/w)梓苷、1-10％(w/w)胡黄连苷II、1-10％(w/w)异香草酰 梓醇和2-20％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇。

因此，在本发明的另一个实施方式中，本发明还提供用于制备从东北婆婆纳中分离出 的用二级分馏的纯化提取物(ATC2)的方法，包括以下步骤：在第一步中，向干燥的东 北婆婆纳中加入选自水、C1-C4低级醇(例如甲醇、乙醇、丁醇等)或它们的混合物的 至少一种提取溶剂，优选水和乙醇的混合物，更优选30-80％(w/w)乙醇的水溶液；在 第二步中，进行在10至100℃、优选20至90℃的温度范围内选自热水回流提取、冷水提 取、超声波处理或常规提取的至少一种提取方法30分钟至72小时、优选6至48小时的 时间，优选冷水提取后，接着回流提取，更优选地，在10至60℃、优选20至50℃的温 度范围内进行冷水提取30分钟至72小时、优选6至48小时的时间，然后在40至120℃、 优选60至90℃的温度范围内进行回流提取30分钟至72小时、优选6至48小时的时间， 反复进行，以获得第一提取物；在第三步中，将所述第一提取物悬浮在约0.5-10倍体积 (v/v)、优选约1-5倍体积(v/v)的水中，以得到悬浮提取物；在第三步中，加入约 0.5-20倍体积(v/v)、优选约1-10倍体积(v/v)的丁醇，分馏为水层和丁醇层并收 集丁醇层以得到用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)；以及对用丁醇分馏的纯化提取物 (ATC1)进行选自反相分配色谱、正相分配色谱、离子交换色谱以及尺寸排斥色谱中的 至少一种进一步纯化工艺以得到用二级分馏的纯化提取物(ATC2)，以治疗或预防慢性阻 塞性肺病(COPD)，基于东北婆婆纳的总提取物的重量(100％)，所述二级分馏的纯化 提取物(ATC2)含有30-60％(w/w)毛蕊花甙、0.5-10％(w/w)藜芦酸、2-20％(w/w) 梓苷、1-10％(w/w)胡黄连苷II、1-10％(w/w)异香草酰梓醇和2-20％(w/w)6-O- 藜芦酰梓醇。

具体地，术语“进一步纯化工艺”选自(i)反相分配色谱、(ii)正相分配色谱、(iii) 离子交换色谱或(iv)尺寸排斥色谱，优选反相分配色谱或者使用能够在洗脱极性物质的 同时保留非极性物质的任何树脂作为固定相的任何色谱，例如葡聚糖凝胶树脂(Sephadex resin)，例如葡聚糖凝胶(Sephadex)，葡聚糖凝胶LH20(SephadexLH20)，葡聚糖凝胶 G-25(SephadexLH20)，葡聚糖凝胶G-10(SephadexG-10)，琼脂糖凝胶(Sepharose)， Superdex，甲基丙烯酸酯树脂，羧甲基纤维素，磺丙基纤维素，羧甲基葡聚糖凝胶，磺丙 基葡聚糖凝胶，羧甲基琼脂糖凝胶，磺丙基琼脂糖凝胶等；使用苯乙烯-二乙烯基苯共聚 物(例如聚合物X、HP20、PRP-h1聚合物等)或甲基丙烯酸酯载体树脂等的反向聚合物 树脂；正相硅胶，例如BPC(键合相色谱)产品、从YMC有限公司获得的二氧化硅产品、 从DAISO有限公司获得的二氧化硅产品、从ASAHI有限公司获得的二氧化硅产品、从 COSMOSYL有限公司获得的二氧化硅产品，等；用于HPLC填料的ODS产品，例如从 YMC有限公司获得的ODS产品、从DAISO有限公司获得的ODS产品、从ASAHI有 限公司获得的ODS产品、从CHEMCO有限公司获得的ODS产品、从Merck有限公司 获得的ODS产品、从COSMOSYL有限公司获得的ODS产品、从FUJI有限公司获得的 ODS产品等。

在采用(i)反相分配色谱作为本发明的进一步纯化工艺的优选的实施方式中，“在上 述反相分配色谱中的固定相”可以是例如可以在洗脱极性物质的同时保留非极性物质的反 相物质作为固定相的任何固定相，优选基于硅胶的固定相，基于聚合物的固定相(例如聚 苯乙烯等)等，更优选地，硅胶衍生物，例如C2、C4、C6、C8、C10、C12、14、C16、 C18等；或基于聚合物的固定相，例如PS-2、OasisHLB等，更加优选地，反相硅胶(C18 (Ⅳ)-D)、来自YMC有限公司的ODS-A/ODS-AQ产品、来自CHEMCO有限公司的 SP-C-ODS产品、来自DAISO有限公司的SP-ODS-RPS产品、来自COSMOSYL有限公 司的5C18产品、来自FUJI有限公司的Chromatorex产品等。

在采用(i)反相分配色谱作为本发明的进一步纯化工艺的优选的实施方式中，“在上 述(i)反相分配色谱中的流动相”可以是选自水、乙腈、低级醇(例如甲醇、乙醇、丁 醇等)、四氢呋喃(THF)或它们的混合物的至少一种溶剂；优选是选自水、低级醇(例 如甲醇、乙醇、丁醇等)或它们的混合物的至少一种溶剂；更优选水和甲醇的混合溶剂； 更加优选，从90:10(v/v)至60:40(v/v)的水和甲醇的混合物溶剂，以洗脱极性物质。

在采用(ii)正相分配色谱作为本发明的进一步纯化工艺的优选的实施方式中，“在 上述正相分配色谱中的固定相”可以是例如可以在洗脱非极性物质的同时保留极性物质的 正相物质作为固定相的任何固定相；优选基于硅胶、基于Fluorosyl或基于氧化铝的固定 相，基于CN，基于二醇(Diol)，或基于NH2部分的聚合物的固定相等；更优选基于硅 胶、基于Fluorosyl或基于氧化铝的固定相等。

在采用(ii)正相分配色谱作为本发明的进一步纯化工艺的优选的实施方式中，“在 上述(ii)正相分配色谱中的流动相”可以是选自己烷、庚烷、乙酸乙酯、乙醇、乙醚、 2-丙醇或它们的混合物的至少一种溶剂，优选是选自己烷、庚烷、乙酸乙酯或它们的混合 物的至少一种溶剂，以洗脱非极性物质。

在采用(iii)离子交换色谱作为本发明的进一步纯化工艺的优选的实施方式中，“在 上述(iii)离子交换色谱中的固定相”可以是作为具有带电的交联部分的固定相的任何高 分子固定相，优选阳离子交换树脂、阴离子交换树脂或合成的吸附剂等，更优选强酸性阳 离子交换树脂，例如AG50W-X8、AmberliteIR-120、Dowex60W-x8，SKIB等；弱酸性 阳离子交换树脂，例如AmberliteIRA-67、Dowex3-x4A等；强碱性阳离子交换树脂，例 如DIAIONSKIB、DIAIONPK216、DIAIONCR20、DIAIONUBK555(MitsubishiChemical 公司)、TRILITESPC160H、TRILITESPC180H、TRILITESPC400JH(Samyang有限公 司)、AMBERLITE200CNa、AMBERLITECG50、AMBERLITECR1310Na、AMBERJET 200H、AMBERLYST131WET、ALBERLYST232WET(ROHM和HAAS有限公司))、 LewatitVPOC1800、LewatitVPOC1812、LewatitMDS1368Na、LewaititK1221(Bayer有 限公司)、PUROLITEPCR833CA、PUROLITEC145(Purolite有限公司)、MFG210、MFG 250(Finex有限公司)等；强碱性阴离子交换树脂，例如SA11A、SA20A、SA21A等； 或者CaptoQ(GEHealthcare有限公司)或具有与其类似性质的树脂，例如ToyopearlQEA (Tosoh有限公司)、QSepharoseFF(GEHealthcare有限公司)、FractogelEMD、Fractogel TMAE、FractogelHICAP(MerckKGaA有限公司或Darmstadt有限公司)；更优选SA21A； 吸附剂，例如SP207、HP20SS、HP20等，更优选HP20。

在采用(iv)尺寸排斥色谱作为本发明的进一步纯化工艺的优选的实施方式中，“在 上述(iv)尺寸排斥色谱中的固定相”可以是作为能够通过样品尺寸分离的固定相的任何 凝胶型固定相，优选基于葡聚糖的凝胶，例如葡聚糖凝胶(例如葡聚糖凝胶G-25)；基于 聚丙烯酰胺的凝胶，例如Sephacryl(例如Sephacryl-S400)；基于琼脂糖的凝胶，例如 Superose或琼脂糖凝胶(Sepharose)(例如琼脂糖凝胶CL-4B)或它们的组合，例如Superdex 200组合葡聚糖(例如Sephadex^TM)，或交联的琼脂糖凝胶(Superose^TM)等，但其不限 于此。“在上述(iv)尺寸排斥色谱中的流动相”可以是选自以下的缓冲液：乙酸钠缓冲 液、磷酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)、二-三[2-二(2-羟乙 基)氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇]、ADA[N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸盐)、PIPES[哌 嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)]、BES[N.N'-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPS[3-(N-吗 啉基)丙磺酸)]、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]、HEPES[N-2-羟乙基-哌嗪 -N'-2-乙磺酸)等；优选乙酸钠缓冲液、磷酸钠缓冲液或乙酸铵缓冲液。

在本发明的一个优选实施方式中，作为本文中所公开的进一步纯化工艺，除了(i) 反相分配色谱法、(ii)正相分配色谱、(iii)离子交换色谱、(iv)尺寸排斥色谱或它们的 组合之外，本发明还可以进行(v)凝胶渗透色谱或凝胶过滤色谱。

本发明还提供由上述制备方法制备的新的纯化提取物，例如(a)用丁醇分馏的纯化 提取物(下文中称为“ATC1”)或(b)用二级分馏的纯化提取物(下文中称为“ATC2”)。

本发明还提供由上述制备方法制备的用丁醇从东北婆婆纳的提取物分馏的新的纯化 提取物(ATC1)，其在东北婆婆纳的总提取物(100％)中含有12.3-47％(w/w)梓苷衍 生物，其中，基于东北婆婆纳的总提取物的重量(100％)，所述梓苷衍生物由15-50％ (w/w)毛蕊花甙、0.3-10％(w/w)藜芦酸、0.5-10％(w/w)梓苷、0.3-10％(w/w) 胡黄连苷II、0.3-10％(w/w)异香草酰梓醇和0.3-10％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇组成； 优选地，由20-25％(w/w)毛蕊花甙、0.5-5％(w/w)藜芦酸、1-5％(w/w)梓苷、 0.5-5％(w/w)胡黄连苷II、0.5-5％(w/w)异香草酰梓醇和1-5％(w/w)6-O-藜芦 酰梓醇组成。

本发明还提供由上述制备方法制备的用丁醇从东北婆婆纳的提取物分馏的新的纯化 提取物(ATC1)，其显示了各种梓苷衍生物的重量之间的如下的相对混合比(w/w)：15.0 -18.0份(w/w)毛蕊花甙、2.10-2.60份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.00- 1.30份(w/w)异香草酰梓醇以及2.00-2.30份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；优选地，16.0-17.0 份(w/w)毛蕊花甙、2.20-2.50份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.10-1.20 份(w/w)异香草酰梓醇以及2.10-2.20份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；更优选地，16.20-16.99 份(w/w)毛蕊花甙、2.40-2.45份(w/w)梓苷、1(w/w)份胡黄连苷II、1.10-1.19 份(w/w)异香草酰梓醇、2.10-2.19份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇。

本发明还提供由上述制备方法制备的从东北婆婆纳的提取物用二级分馏的纯化提取 物(ATC2)，其在东北婆婆纳的总提取物(100％)中含有36.5-91％(w/w)梓苷衍生物， 其中，基于东北婆婆纳的总提取物的重量(100％)，所述梓苷衍生物由30-60％(w/w) 毛蕊花甙、0.5-10％(w/w)藜芦酸、2-20％(w/w)梓苷、1-10％(w/w)胡黄连苷II、 1-10％(w/w)异香草酰梓醇和2-20％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇组成；优选地，由40-50％ (w/w)毛蕊花甙、1-5％(w/w)藜芦酸、3-10％(w/w)梓苷、2-5％(w/w)胡黄连 苷II、2-8％(w/w)异香草酰梓醇和3-8％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇组成。

本发明还提供由上述制备方法制备的从东北婆婆纳的提取物用二级分馏的纯化提取 物(ATC2)，其显示了各种梓苷衍生物的重量之间的如下的相对混合比(w/w)：13.0-16.0 份(w/w)毛蕊花甙、2.20-2.50份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.10-1.40 份(w/w)异香草酰梓醇以及2.00-2.20份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；优选地，14.0-15.0 份(w/w)毛蕊花甙、2.30-2.45份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.20-1.35 份(w/w)异香草酰梓醇以及2.00-2.10份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；更优选地，14.50-14.99 份(w/w)毛蕊花甙、2.35-2.43份(w/w)梓苷、1份(w/w)胡黄连苷II、1.15-1.24 份(w/w)异香草酰梓醇、2.01-2.09份(w/w)6-O-藜芦酰梓醇。

在本文中公开的术语“纯化提取物”可以以通过真空蒸发法、冷冻干燥法或热空气干 燥法等制备的干燥形式使用。

在本文中公开的术语“预防”包括通过施用本发明组合物以抑制或延迟本文公开的某 些疾病或病症的发生的任何行为；以及在本文中公开的术语“治疗”包括通过施用本发明 组合物以缓解或有利地改变与本文公开的某些疾病或病症有关的症状的任何行为。

通过各种HPLC分析，本发明人发现，与通过现有技术中公开的常规方法制备的粗 提物(其中，梓醇衍生物含量只有8.49％(w/w))相比，用于制备纯化提取物的新的工 业化方法可以从东北婆婆纳的提取物提供更大量(即36.5％至91.0％(w/w))的活性成 分(例如梓醇衍生物)，例如，基于东北婆婆纳的总提取物(100％)的重量，本发明的纯 化提取物(ATC1)含有17.60％(w/w)毛蕊花甙、0.72％(w/w)藜芦酸、2.62％(w /w)梓苷、1.08％(w/w)胡黄连苷II、1.26％(w/w)异香草酰梓醇和2.36％(w/w) 6-O-藜芦酰梓醇(参见实施例2)，以及本发明的纯化提取物(ATC2)含有43.83％(w/w) 毛蕊花甙、1.80％(w/w)藜芦酸、7.07％(w/w)梓苷、2.93％(w/w)胡黄连苷II、 3.85％(w/w)异香草酰梓醇和6.15％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇，而由现有技术中公开 的常规方法制备的粗提物(CX)只含有5.9％(w/w)毛蕊花甙、0.21％(w/w)藜芦 酸、0.82％(w/w)梓苷、0.40％(w/w)胡黄连苷II、0.42％(w/w)异香草酰梓醇和 0.74％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇；粗提物；以及通过利用BALB/c雄性小鼠进行的各种体 内试验(例如，由COPD发生导致的招募至肺的炎性免疫细胞和嗜中性粒细胞的增殖和 活性的抑制试验；参与肺细胞的损坏的趋化因子(如，MIP-2/CXCL-2、TNF-α、KC/CXCL-1 (趋化因子Gro-α)和CXCL-8等)的再生的抑制试验；在利用SPF(无特定病原体) Sprague-Dawley大鼠的动物试验中通过降低NF-κB活性减少对IL-1β、IL-6、TNF-α和 MMP-9表达的释放的影响)以及在分子表达谱变化试验中诱导对Th2细胞的IL-4-表达的 影响的体外试验(例如，对MUC5AC(低聚粘液/凝胶形成)的表达的抑制试验)，所述纯 化提取物和从此分离的化合物显示出有效力的抗COPD活性而无β-2-受体对抗应答。

本发明的发明人还发现藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O- 藜芦酰梓醇之间的最大化的组合的重量比，以治疗和预防慢性阻塞性肺病(COPD)，即， 毛蕊花甙(ATC1-68.6％；ATC2-66.8％。基于化合物的总重计算的含量范围:45-90w/w％), 藜芦酸(ATC1-2.8％；ATC2-2.7％。基于化合物的总重计算的含量范围:1.5-4.0w/w％),梓 苷(ATC1-10.2％；ATC2-10.8％。基于化合物的总重计算的含量范围:7.0-14.0w/w％),胡黄 连苷II(ATC1-4.2％；ATC2-4.5％。基于化合物的总重计算的含量范围:3.0-6.0w/w％),异 香草酰梓醇(ATC1-4.9％；ATC2-5.8％。基于化合物的总重计算的含量范围:3.0-8.0w/w％) 和6-O-藜芦酰梓醇(ATC1-9.2％；ATC2-9.4％。基于化合物的总重计算的含量范围: 6.0-12.0w/w％)。

因此，根据本发明的其他方面，本发明提供一种药物组合物或功能性保健食品，其包 含具有40-93％毛蕊花甙、1.0-10％藜芦酸、2.0-25％梓苷、1.0-15％胡黄连苷II、1.0-15％ 异香草酰梓醇和2.0-25％6-O-藜芦酰梓醇的混合重量比的组合的化合物，优选具有45-90％ 毛蕊花甙、1.0-7.0％藜芦酸、3.0-15％梓苷、2.0-10％胡黄连苷II、2.0-10％异香草酰梓醇和 2.0-15％6-O-藜芦酰梓醇的混合重量比的组合的化合物，以治疗治疗或预防慢性阻塞性肺 病(COPD)。

为了慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗或预防，本发明提供一种药物组合物或功能性 保健食品，其包含具有40-93％毛蕊花甙、1.0-10％藜芦酸、2.0-25％梓苷、1.0-15％胡黄连 苷II、1.0-15％异香草酰梓醇和2.0-25％6-O-藜芦酰梓醇的混合重量比的组合的化合物，优 选具有45-90％毛蕊花甙、1.0-7.0％藜芦酸、3.0-15％梓苷、2.0-10％胡黄连苷II、2.0-10％ 异香草酰梓醇和2.0-15％6-O-藜芦酰梓醇的混合重量比的组合的化合物，和制药上可接受 的载体或赋形剂。

因此，根据本发明的其他方面，本发明提供一种药物组合物或功能性保健食品，其包 含由上述方法制备的含有活性成分的新纯化提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄 连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇的至少一种化合物，以治疗或预防慢性阻塞性 肺病(COPD)。

为了慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗或预防，本发明提供一种药物组合物，其包含 由上述方法制备的含有活性成分的新纯化提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连 苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇的至少一种化合物，和制药上可接受的载体或赋 形剂。

根据本发明的另一方面，还提供的是由上述方法制备的新纯化提取物或选自藜芦酸、 毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇的至少一种化合物用于 制造用于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)的药物的用途。

在本文中限定的术语“制药上可接受的载体或赋形剂”包括“药物添加剂，用于构成 药物的非活性成分。它们包括染料、香料、粘合剂、软化剂、填料、润滑剂、防腐剂以及 更多种类。常规赋形剂包括玉米淀粉、乳糖、滑石、硬脂酸镁、蔗糖、明胶、硬脂酸钙、 二氧化硅、虫胶和釉，这是现有技术中已公知的(参见：食品和药物管理局(FoodandDrug Administration)的主页：www.fda.gov或药品信息在线(druginformationonline)： www.drugs.com)或以前的文献(例如，Rowe、RaymondC等人，药用辅料手册(Handbook ofPharmaceuticalExcipients)，医药出版社(PharmaceuticalPress)，第7版，2012)。

根据本发明的另一方面，还提供的是治疗或预防哺乳动物的慢性阻塞性肺病(COPD) 的方法，其中，所述方法包括向患有慢性阻塞性肺病(COPD)的哺乳动物施用治疗有效 量的由上述方法制备的新纯化提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香 草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇的至少一种化合物。

根据本发明的另一方面，还提供的是治疗或预防哺乳动物的慢性阻塞性肺病(COPD) 的方法，其中，所述方法包括向患有慢性阻塞性肺病(COPD)的哺乳动物施用包含由上 述方法制备的新纯化提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇 和6-O-藜芦酰梓醇的至少一种化合物和制药上可接受的载体或赋形剂的组合物。

根据本发明的另一方面，还提供的是治疗或预防哺乳动物的慢性阻塞性肺病(COPD) 的方法，其中，所述方法包括向患有慢性阻塞性肺病(COPD)的哺乳动物施用治疗有效 量的具有40-93％的毛蕊花甙、1.0-10％的藜芦酸、2.0-25％的梓苷、1.0-15％的胡黄连苷II、 1.0-15％的异香草酰梓醇和2.0-25％的6-O-藜芦酰梓醇的混合重量比的组合的化合物，优 选具有45-90％的毛蕊花甙、1.0-7.0％的藜芦酸、3.0-15％的梓苷、2.0-10％的胡黄连苷II、 2.0-10％的异香草酰梓醇和2.0-15％的6-O-藜芦酰梓醇的混合重量比的组合的化合物。

根据本发明的另一方面，还提供的是治疗或预防哺乳动物的慢性阻塞性肺病(COPD) 的方法，其中，所述方法包括向患有慢性阻塞性肺病(COPD)的哺乳动物施用包含治疗 有效量的具有40-93％的毛蕊花甙、1.0-10％的藜芦酸、2.0-25％的梓苷、1.0-15％的胡黄连 苷II、1.0-15％的异香草酰梓醇和2.0-25％的6-O-藜芦酰梓醇的混合重量比的组合的化合 物，优选具有45-90％的毛蕊花甙、1.0-7.0％的藜芦酸、3.0-15％的梓苷、2.0-10％的胡黄连 苷II、2.0-10％的异香草酰梓醇和2.0-15％的6-O-藜芦酰梓醇的混合重量比的组合的化合 物，和制药可接受的载体或赋形剂的组合物。

根据本发明的另一方面，为，还提供的是包含由上述方法制备的新纯化提取物或选自 藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇的至少一种化 合物和制药上可接受的载体或赋形剂的组合物用于制造用于治疗或预防慢性阻塞性肺病 (COPD)的药物的用途。

根据本发明的另一方面，还提供的是包含具有40-93％的毛蕊花甙、1.0-10％的藜芦酸、 2.0-25％的梓苷、1.0-15％的胡黄连苷II、1.0-15％的异香草酰梓醇和2.0-25％的6-O-藜芦酰 梓醇的混合重量比的组合的化合物，优选具有45-90％的毛蕊花甙、1.0-7.0％的藜芦酸、 3.0-15％的梓苷、2.0-10％的胡黄连苷II、2.0-10％的异香草酰梓醇和2.0-15％的6-O-藜芦酰 梓醇的混合重量比的组合的化合物，和制药可接受的载体或赋形剂的组合物，用于制造用 于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)的药物的用途。

基于组合物的总重，用于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)的发明的组合物可包 含按重量计0.1至99％、优选0.1至50％的上述提取物或化合物。

根据本发明的组合物可以提供为药物组合物，所述药物组合物包含制药上可接受的载 体、辅料或稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦 芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙 烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂可 以另外包括填料、抗凝集剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。本发明的组 合物可以通过使用本领域公知的任何方法来配制以在给患者施用后提供活性成分的快速、 持续或延迟释放。

例如，本发明的组合物可以溶解在油、丙二醇或者常用于制备注射剂的其他溶剂中。 所述载体的合适的实例包括生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油、肉豆蔻酸异丙酯等，但 不限于它们。对于局部给药，本发明的提取物可以配制为软膏和乳膏的形式。

可以以任何形式来制备含有本发明组合物的药物制剂，例如口服剂型(散剂、片剂、 胶囊剂、软胶囊剂、含水药物、糖浆剂、酏剂、丸剂、散剂、囊剂、颗粒剂)，或局部用 制剂(乳膏剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、香膏剂、贴剂、糊剂、喷雾溶液、气雾剂等)， 或注射制剂(溶液、悬浮液、乳液)。

在药物剂型中的本发明的组合物可以以它们制药上可接受的盐的形式使用，并且也可 以单独使用或适当联合使用，以及与其他药学上的活性化合物组合使用。

本发明提取物的理想的剂量根据患者的病情和体重、严重性、药物形式、给药途径和 时间而不同，并且可以由本领域技术人员来选择。然而，为了获得理想的效果，通常建议 以0.0001至1000mg/kg重量/天的量、优选0.001至100mg/kg重量/天的量施用本发明的 发明的提取物。所述剂量可以单次施用或分成每天几次。

本发明的药物组合物可以经由各种途径施用给受试动物(例如哺乳动物(大鼠、小鼠、 家畜或人))。考虑了给药的所有模式，例如，给药可以通过口服、经直肠或通过静脉内、 肌内、皮下、皮内、鞘内、硬膜外或脑室内注射而进行。

本发明的发明提取物还可以在各种功能性健康食品和保健食品的制备中用作主要成 分或添加剂和辅助剂。

因此，本发明的另一个目的是提供包含治疗有效量的由上述方法制备的含有活性成分 的新纯化提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜 芦酰梓醇的至少一种化合物的健康功能食品，以预防或缓解慢性阻塞性肺病(COPD)。

因此，本发明的另一个目的是提供包含具有40-93％的毛蕊花甙、1.0-10％的藜芦酸、 2.0-25％的梓苷、1.0-15％的胡黄连苷II、1.0-15％的异香草酰梓醇和2.0-25％的6-O-藜芦酰 梓醇的混合重量比的组合的化合物，优选具有45-90％的毛蕊花甙、1.0-7.0％的藜芦酸、 3.0-15％的梓苷、2.0-10％的胡黄连苷II、2.0-10％的异香草酰梓醇和2.0-15％的6-O-藜芦酰 梓醇的混合重量比的组合的化合物的健康功能食品，以预防或缓解慢性阻塞性肺病 (COPD)。

在本文中定义的术语“功能性健康食品”是指通过将本发明的提取物加入到常规食品 中以预防或改善人或哺乳动物的目标疾病的“具有增强的功能性(例如物理功能性或生理 功能性)的功能性食品。

本发明的其他目的是提供包含治疗有效量的由上述方法制备的含有大量活性成分的 新纯化提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦 酰梓醇的至少一种化合物和饮食学上可接受的添加剂的保健食品，以预防或缓解慢性阻塞 性肺病(COPD)。

在本文中定义的术语“保健食品”是指“以作为添加剂的形式少量或以作为散剂、颗 粒、胶囊剂、丸剂、片剂等的形式全部量不显示特定的预期效果但显示一般预期的效果的 含有本发明的提取物的食品。

在本文中定义的术语“饮食学上可接受的添加剂”包括“预期用途直接或间接地导致 或可合理地预期会导致-直接或间接地-其成为一种组分或以其他方式影响任何食物的特 性的任何物质”，并且根据其来源可分类为三组，即(1)化学合成的添加剂，例如酮、甘 氨酸、柠檬酸钾、烟酸等；(2)天然添加剂，例如柿子染料、甘草提取物、结晶纤维素、 瓜达姆(guadum)等；(3)与此有关的混合添加剂，例如L-谷氨酸钠、防腐剂、焦油染 料等，或者根据其在食品中的功能可分类为各种类别，例如增稠剂(thickeningagent)、 熟化剂、漂白剂、螯合剂、保湿剂、防结块剂、澄清剂、固化剂、乳化剂、稳定剂、稠化 剂(thickener)、碱和酸、发泡剂、营养素、着色剂、风味剂、甜味剂、防腐剂、抗氧化 剂等，这些是在现有技术或者先前的文献中已公知的(见GSFAOnline： www.codexalimentarius.net/gsfaonline/index.html首页页面中的“CodexGeneralStandard forFoodAdditives”(GSFA，CODEXSTAN192-1995))。

如果为了在食品中特定目的而将一种物质添加到该食品中，则其被称为直接添加剂， 而间接食品添加剂是由于其包装、储存或以其他处理而以痕量成为食品的部分的那些食品 添加剂。

为了预防或改善目标疾病，在本文中公开的术语“保健食品或健康功能食品”可以包 含在食品、保健饮料、膳食补充剂等中，并且可以配制成药学剂型的形式，例如散剂、颗 粒剂、片剂、悬浮液、乳剂、糖浆剂、咀嚼片剂、胶囊剂、饮料等；或食品的形式，例如 面包、米糕(ricecake)、干果(dryfruit)、糖果、巧克力、口香糖、冰淇淋、奶(例如低 脂奶、水解乳糖奶、山羊奶、加工奶)、乳制品(例如发酵乳、黄油，炼乳、精制奶油、 奶油、天然乳酪、加工乳酪、干乳、乳清等)、加工的肉制品(例如汉堡包、火腿、香肠、 腊肉等)、加工蛋制品、鱼肉制品(例如鱼饼等)、面条制品(例如方便面、挂面、湿面条、 炒面、非油炸面条、糊化干面条、熟面条、冷冻面条、意大利面(Pasta)等)、茶产品(例 如袋包茶、过滤茶等)、健康饮料(例如水果饮料、蔬菜饮料、碳酸软饮料、豆奶饮料、 乳酸饮料、混合饮料等)、调味食品(例如酱油、豆酱、红辣椒酱、甜面酱(chunjang， 一种由焦糖着色的发酵大豆产品)、cheonggukjang(用枯草芽孢杆菌(B.subtillis)天然 发酵的大豆)、混合酱、醋、沙司(sauce)、番茄酱、咖喱、调味品(dressing)等)、人 造黄油(margarine)、起酥油(shortening)、比萨饼等，但本发明并不限于此。

另外，上述提取物可以添加到食品或饮料中用于预防和改善目标病症。在作为功能性 健康食品或保健食品的食品或饮料中的上述提取物的量一般为功能性健康食品组合物的 食品的总重量的约0.01至100w/w％。特别是，虽然在功能性健康食品、保健食品或特殊 营养食品中的本发明的提取物的优选量可以根据每种食品的预期目的而变化，对于100％ 的比例的食品组合物，通常优选在食品(例如面条等)中以约0.01至5％的范围、在保健 食品中以40至100％的范围的量作为添加剂使用本发明的提取物。

如果本发明的健康饮料组合物以所指示的比率包含上述提取物作为必要成分，对于其 他液体组分没有特别的限制，其中所述其它组分可以是各种除臭剂或天然碳水化合物等 (例如常规饮料)。上述天然碳水化合物的实例是单糖，例如葡萄糖、果糖等；双糖，例 如麦芽糖、蔗糖等；常规糖类，例如糊精、环糊精；以及糖醇，例如木糖醇和赤藓醇等。 作为除了上述那些之外的其他除臭剂，天然除臭剂，例如索马甜(taumatin)、甜叶菊提取 物(例如levaudiosideA)、甘草甜素等；以及合成除臭剂，例如糖精、阿斯巴甜等可以有 利地使用。在100ml的本发明饮料组合物的比例中，上述天然碳水化合物的量一般在约1 至20g、优选5至12g的范围内。

除了前述组分之外的其它组分是各种营养素、维生素、矿物质或电解质、合成风味剂、 在奶酪、巧克力等的情况下的着色剂和改进剂，果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、 保护性胶体粘合剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料中的碳化剂 等。除了前述成分之外的其它成分可以是用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果汁， 其中，所述成分可以单独使用或组合使用。各成分的比例不重要，但通常为每100w/w％ 本发明组合物中约0至20w/w％。含有上述提取物的可添加的食品的实例为各种食品、 饮料、口香糖、维生素复合物、健康改善食品等。

本发明的发明提取物或化合物没有毒性和，因此没有副作用；因此可以安全使用它们。

对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的精神或范围内，在本发明的组合物、用 途和制备中能够进行各种修改和变型是显而易见的。

通过以下实施例对本发明进行更具体地说明。然而，应该理解的是，本发明并不以任 何方式限定于这些实施例。

有益效果

如本发明所述，通过利用BALB/c雄性小鼠进行的各种体内试验(例如，由COPD 发生导致的招募至肺的炎性免疫细胞和嗜中性粒细胞的增殖和活性的抑制试验；参与肺细 胞的损坏的趋化因子(如，MIP-2/CXCL-2、TNF-α、KC/CXCL-1(趋化因子Gro-α)和CXCL-8 等)的再生的抑制试验；在利用SPF(无特定病原体)Sprague-Dawley大鼠的动物试验中通 过降低NF-κB活性减少对IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9表达的释放的影响)以及在分 子表达谱变化试验中诱导对Th2细胞的IL-4-表达的影响的体外试验(例如，对MUC5AC (低聚粘液/凝胶形成)的表达的抑制试验)，来自东北婆婆纳的提取物的含有大量活性物质 (如梓醇衍生物)的发明的纯化提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异 香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇的至少一种化合物显示出有效力的抗COPD活性而无β-2- 受体对抗应答。因此，其可以用作用于治疗和预防慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗或功 能性健康食品。

附图说明

结合附图从以下详细描述，可以更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其他 优点，其中：

图1显示在比较例1中制备的东北婆婆纳的粗提物的HPLC分析；

图2显示中实施例1中制备本发明的的东北婆婆纳的纯化提取物(ATC1)的HPLC 分析；

图3显示在实施例2中制备的本发明的东北婆婆纳的纯化提取物(ATC2)的HPLC 分析；

图4显示建立ADRB2GPCR-表达细胞系模型的简要步骤；

图5显示用已知的ADRB激动剂处理的U2OS细胞的斑点形成；

图6显示用本发明的纯化提取物和化合物处理的U2OS细胞的斑点形成；

图7显示使用HSC进行的MUC5AC表达的数字化结果；

图8表示在使用TGFb1处理的A549细胞中MUC5AC表达的变化；

图9表示在使用本发明的纯化提取物或化合物预处理然后使用TNF-α处理的A549 细胞中MUC5AC表达的变化；

图10表示在使用丙烯醛、本发明的纯化提取物或化合物处理的A549细胞中 MUC5AC表达的变化；

图11显示本发明的纯化提取物或化合物对从初始CD4⁺T细胞(CD4⁺CD62L+)诱导 Th2分化的影响；

图12显示本发明的纯化提取物或化合物对小鼠Th2的分化的影响；

图13显示本发明的纯化提取物或化合物对小鼠Th2细胞的分化标记IL-4表达的影 响；

图14显示在LPS吸入(i.t)至Balb/c小鼠和香烟烟激发后，本发明的纯化提取物或化 合物对免疫细胞、嗜中性粒细胞的总数和T淋巴细胞的水平的影响；

图15显示本发明的纯化提取物或化合物对BALF的CD4⁺&CD8⁺T细胞数的影响(A: 总细胞数(x10⁵)/BALF(mL)；B:嗜中性粒细胞数(x10⁴)/BALF(mL)；C:CD4⁺&CD8⁺T 细胞的绝对数(x10⁴)/BALF(mL),数据被表达为平均细胞数±SEM(P<0.05,P<0.01,P <0.001对LPS+CS；n＝10)；

图16显示在LPS吸入(i.t)至Balb/c小鼠和香烟烟激发后，本发明的纯化提取物或化 合物对CXCL-1、TNF-α、和MIP-2的水平的影响；

图17显示本发明的纯化提取物或化合物对炎性细胞数的影响；

图18显示本发明的纯化提取物或化合物对BALF的总细胞数的影响；

图19显示本发明的纯化提取物或化合物对肺组织的MMP-9活性的影响；

图20显示本发明的纯化提取物或化合物对肺组织的促炎性蛋白的表达的影响；

图21表示通过利用支气管肺泡灌洗的组织学检查，本发明的纯化提取物或化合物对 肺组织细胞的炎性应答的抑制效应。

具体实施方式

对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的精神或范围内，对本发明的组合物、用 途和制备进行各种修改和变型是显而易见的。

通过以下实施例对本发明进行更具体地说明。然而，应该理解的是，本发明并不以任 何方式限定于这些实施例。

实施例

以下参考实施例、实施例和实验实施例旨在进一步说明本发明而不限制其范围。

比较例1.东北婆婆纳的粗提物的制备

1-1粗提物(ATE)的制备

将1kg干东北婆婆纳(按照GAP，在韩国忠清北道阴城郡蘇伊面244号(244， Soi-myeonEumseong-gunChungcheongbuk-do)栽培)切成小块，并与10L40％乙醇混合。 将混合物在室温下搅拌24小时，并在78℃下用回流提取进行提取12小时，收集滤液， 重复三次。用滤纸过滤提取物以除去碎屑。将收集的滤液在55至65℃下通过旋转蒸发仪 (EYELA，N-2100，日本)减压浓缩，并用冷冻干燥机干燥以获得202g干燥粗提物(下 文中称为“ACE”)，用于作为比较例。

1-2成分分析

通过使用HPLC(Agilent1260型号，USA)，根据表1中的条件进行成分分析，其结 果示于图1中。

如在图1中所示，已确认，分别在以下时间检测到各个成分：9.548分钟(毛蕊花甙)、 10.817分钟(藜芦酸)、16.728分钟(梓苷)、20.346分钟(胡黄连苷II)、21.853分钟(异 香草酰梓醇)和30.462分钟(6-O-藜芦酰梓醇)。

根据数学式1，基于HPLC图谱(保留时间)，计算样品中每种成分的含量(％)。

[数学式1]

每种成分的含量＝标准的浓度(mg/ml)/测试样品的浓度(mg/ml)×At/As×标准的 纯度(％)

其中，“At”表示在测试样品中的成分面积，“As”表示在标准中的成分面积，条件 是测试样品和标准的采样体积彼此相同。

表1

[表1]

HPLC条件

如在表2中所示，在结果中，已经证实，东北婆婆纳的粗提物仅包含8.49％(w/w) 梓苷衍生物，即分别为5.9％(w/w)毛蕊花甙、0.21％(w/w)藜芦酸、0.82％(w/w) 梓苷、0.40％(w/w)胡黄连苷II、0.42％(w/w)异香草酰梓醇和0.74％(w/w)6-O- 藜芦酰梓醇。

表2

[表2]

HPLC结果(粗提物：ACE)

实施例1.东北婆婆纳的纯化提取物(ATC1)的制备

将根据比较例1的常规方法制备的东北婆婆纳的粗提物(ACE)悬浮于2L蒸馏水中， 在悬浮液中加入2L丁醇，分馏成可溶于丁醇的馏分和水溶性馏分。收集可溶于丁醇的馏 分，减压浓缩并干燥，得到82g本发明的用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)用作实验例。

通过使用HPLC(Agilent1260型号，USA)，根据表1中的条件进行成分分析，其结 果示于图2中。

如在图2中所示，已确认，分别在以下时间检测到各个成分：9.545分钟(毛蕊花甙)、 10.821分钟(藜芦酸)、16.727分钟(梓苷)、20.345分钟(胡黄连苷II)、21.853分钟(异 香草酰梓醇)和30.462分钟(6-O-藜芦酰梓醇)。

根据数学式1，基于HPLC图谱(保留时间)，计算样品中每种成分的含量(％)。

如在表3中所示，在结果中，已经证实，东北婆婆纳的本发明的用丁醇分馏的纯化提 取物(ATC1)包含25.64％(w/w)梓苷衍生物，即分别为17.60％(w/w)毛蕊花甙、 0.72％(w/w)藜芦酸、2.62％(w/w)梓苷、1.08％(w/w)胡黄连苷II、1.26％(w/ w)异香草酰梓醇和2.36％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇。

表3

[表3]

HPLC结果(纯化提取物：ATC1)

实施例2.东北婆婆纳的纯化提取物(ATC2)的制备

将根据实施例1的东北婆婆纳的本发明的用丁醇分馏的纯化提取物(ATC1)溶解于 75ml混合溶剂(蒸馏水:甲醇＝1:0.003)，并将75g该溶液装载在反相柱色谱(C18(Ⅳ) -D-75-120nm，AGCSi-Tech有限公司，日本，450g)，通过使用洗脱溶剂(蒸馏水:甲醇＝ 90:10→60:40)洗脱该悬浮液。收集在初始洗脱溶剂系统(蒸馏水:甲醇＝90:10)中运行的 8.4L洗脱溶液，并减压浓缩。收集在晚期洗脱溶剂系统(蒸馏水:甲醇＝60:40)中运行的 5.6L洗脱溶液，减压浓缩并干燥，得到33g本发明的用二级分馏的纯化提取物(ATC2) 用作实验例。

通过使用HPLC(Agilent1260型号，USA)，根据表1中的条件进行成分分析，其结 果示于图3中。

如在图3中所示，已确认，分别在以下时间检测到各个成分：9.525分钟(毛蕊花甙)、 10.818分钟(藜芦酸)、16.721分钟(梓苷)、20.346分钟(胡黄连苷II)、21.857分钟(异 香草酰梓醇)和30.462分钟(6-O-藜芦酰梓醇)。

根据数学式1，基于HPLC图谱(保留时间)，计算样品中每种成分的含量(％)。

如在表4中所示，在结果中，已经证实，东北婆婆纳的本发明的用二级分馏的纯化提 取物(ATC2)包含65.63％(w/w)梓苷衍生物，即分别为43.83％(w/w)毛蕊花甙、 1.80％(w/w)藜芦酸、7.07(w/w)梓苷、2.93％(w/w)胡黄连苷II、3.85％(w/w) 异香草酰梓醇和6.15％(w/w)6-O-藜芦酰梓醇。

表4

[表4]

HPLC结果(纯化提取物：ATC2)

实施例3.来自东北婆婆纳的本发明的化合物的制备

根据在韩国专利公开第10-2006-125499号中公开的分离方法，从东北婆婆纳的提取 物中纯化本发明的化合物，即，具有以下物理-化学性质的毛蕊花甙、藜芦酸、梓苷、胡 黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇，并且，为每种化学结构的识别，比较每种 化合物的物理-化学性质和在已经发表的文献中的化合物的物理-化学性质。

1.毛蕊花甙(＝6-O-(3,4-二羟基苯甲酰基)梓醇)

¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:2.47(1H,dd,J＝8.0,9.2Hz,H-9),2.59(1H,dddd,J＝1.6, 4.0,8.0,8.0,H-5),3.00(1H,m,H-G4),3.05(1H,m,H-G2),3.14(1H,m,H-G5),3.18(1H,m, H-G3),3.42,3.71(2H,m,H-G6).3.67(1H,s,H-7),3.71,3.91(2H,d,J＝13.2Hz,each,H-10), 4.61(1H,d,J＝7.6Hz,H-G1),4.94(1H,dd,J＝4.0,6.0Hz,H-4),5.03(1H,d,J＝8.0Hz,H-6), 5.09(1H,d,J＝9.2Hz,H-1),6.41(1H,dd,J＝1.6.6.0Hz,H-3),6.82(1H,d,J＝8.0Hz,H-5'), 7.35(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6'),7.39(1H,d,J＝2.0Hz,H-2')。

¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:93.0(C-1),141.1(C-3),101.8(C-4),35.2(C-5), 79.5(C-6),58.2(C-7),65.8(C-8),41.8(C-9),120.0(C-1'),116.4(C-2'),145.1(C-3'),150.8(C-4'), 115.4(C-5'),122.6(C-6'),165.6(C-7'),97.9(C-G1),73.4(C-G2),76.4(C-G3),70.3(C-G4), 77.5(C-G5),61.4(C-G6)。

2.胡黄连苷II(＝6-O-(4-羟基-3-甲氧基苯甲酰基)梓醇)

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:2.47(1H,dd,J＝8.0,9.6Hz,H-9),2.58(1H,dddd,J＝1.2, 6.0,8.0,8.4Hz,H-5),3.00(1H,m,H-G4),3.05(1H,m,H-G2),3.14(1H,m,H-G5),3.18(1H,m, H-G3),3.42,3.71(2H,m,H-G6),3.67(1H,brs,H-7),3.72,3.92(2H,d,J＝13.2,each,H-10), 4.62(1H,d,J＝7.6Hz,H-G1),4.99(1H,dd,J＝4.4,6.0Hz,H-4),5.06(1H,d,J＝8.4Hz,H-6), 5.11(1H,d,J＝9.6Hz,H-1),6.42(1H,dd,J＝1.2.6.0Hz,H-3),6.89(1H,d,J＝8.4Hz,H-5'), 7.46(1H,d,J＝2.0Hz,H-2'),7.52(1H,dd,J＝2.0,8.4Hz,H-6'),3.83(3H,s,3'-O-CH3)。

¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:93.0(C-1),141.1(C-3),101.8(C-4),35.2(C-5), 79.7(C-6),58.2(C-7),65.8(C-8),41.8(C-9),58.5(C-10),120.0(C-1'),112.7(C-2'),147.5(C-3'), 152.0(C-4'),115.3(C-5'),123.8(C-6'),165.6(C-7'),97.9(C-G1),73.4(C-G2),76.4(C-G3), 70.3(C-G4),77.5(C-G5),61.4(C-G6),55.7(3'-OCH3)。

3.梓苷(＝6-O-(4-羟基苯甲酰基)梓醇)

₁H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:2.47(1H,dd,J＝8.0,9.6Hz,H-9),2.56(1H,dddd,J＝1.2, 4.0,8.0,8.0Hz,H-5),3.00(1H,m,H-G4),3.05(1H,m,H-G2),3.14(1H,m,H-G5),3.18(1H,m, H-G3),3.43,3.72(2H,m,H-G6),3.69(1H,brs,H-7),3.72,3.92(2H,d,J＝13.2Hz,each,H-10), 4.62(1H,d,J＝8.0Hz,H-G1),4.96(1H,dd,J＝4.0,6.0Hz,H-4),5.05(1H,dd,J＝1,2,8.0Hz, H-6),5.11(1H,d,J＝9.6Hz,H-1),6.42(1H,dd,J＝1.2.6.0Hz,H-3),6.86(2H,d,J＝8.0Hz,H-3', -5'),7.85(2H,d,J＝2.0Hz,H-2',-6')。

¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:92.9(C-1),141.1(C-3),101.8(C-4),35.1(C-5), 79.6(C-6),58.2(C-7),65.8(C-8),41.8(C-9),119.6(C-1'),131.7(C-2',6'),115.5(C-3',5'), 162.6(C-4'),165.5(C-7'),97.8(C-G1),73.4(C-G2),76.4(C-G3),70.3(C-G4),77.5(C-G5), 61.4(C-G6)。

4.异香草酰梓醇(＝6-O-(3-羟基-4-甲氧基苯甲酰基)梓醇)

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:2.47(1H,m,H-9),2.55(1H,mH-5),3.00(1H,m,H-G4), 3.05(1H,m,H-G2),3.14(1H,m,H-G5),3.18(1H,m,H-G3),3.43,3.70(2H,m,H-G6),3.70(1H, brs,H-7),3.72,3.92(2H,d,J＝13.2,each,H-10),4.62(1H,d,J＝8.0Hz,H-G1),4.95(1H,dd, J＝4.4,6.0Hz,H-4),5.06(1H,d,J＝8.0Hz,H-6),5.11(1H,d,J＝9.2Hz,H-1),6.42(1H,d,J＝6.0 Hz,H-3),7.04(1H,d,J＝8.4Hz,H-5'),7.42(1H,brs,H-2'),7.48(1H,d,J＝8.4Hz,H-6'), 3.84(3H,s,4'-O-CH3)。

¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:93.0(C-1),141.0(C-3),101.6(C-4),35.2(C-5), 79.7(C-6),58.2(C-7),65.8(C-8),41.8(C-9),58.4(C-10),121.7(C-1'),115.7(C-2'),146.3(C-3'), 152.1(C-4'),111.4(C-5'),121.3(C-6'),165.3(C-7'),97.8(C-G1),73.4(C-G2),76.4(C-G3), 70.3(C-G4),77.4(C-G5),61.4(C-G6),55.7(4'-OCH3)。

5.6-O-藜芦酰梓醇(＝6-O-(3,4-二甲氧基苯甲酰基)梓醇)

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:2.47(1H,dd,J＝8.0,9.6Hz,H-9),2.59(1H,dddd,J＝1.6, 4.8,8.0,8.0Hz,H-5),3.00(1H,m,H-G4),3.05(1H,m,H-G2),3.14(1H,m,H-G5),3.18(1H,m, H-G3),3.42,3.71(2H,m,H-G6),3.70(1H,brs,H-7),3.72,3.90(2H,d,J＝13.2Hz,each,H-10), 4.61(1H,d,J＝7.6Hz,H-G1),4.97(1H,dd,J＝4.8,6.0Hz,H-4),5.08(1H,d,J＝8.8Hz,H-6), 5.10(1H,d,J＝9.6Hz,H-1),6.42(1H,dd,J＝1.6.6.0Hz,H-3),7.09(1H,d,J＝8.4Hz,H-5'), 7.46(1H,d,J＝2.0Hz,H-2'),7.64(1H,dd,J＝2.0,8.4Hz,H-6'),3.81,3.84(6H,seach,3', 4'-OCH3)。

¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:92.9(C-1),141.1(C-3),101.8(C-4),35.2(C-5), 79.9(C-6),58.2(C-7),65.9(C-8),41.8(C-9),58.4(C-10),121.3(C-1'),111.8(C-2'),148.5(C-3'), 153.2(C-4'),111.2(C-5'),123.5(C-6'),165.5(C-7'),97.8(C-G1),73.4(C-G2),76.4(C-G3), 70.3(C-G4),77.5(C-G5),61.4(C-G6),55.6,55.7(3',4'-OCH₃)。

实验实施例1.基于ADBR2GPCR-靶向细胞的测定系统的建立

为开发基于ADBR2GPCR-靶向细胞的测定系统，进行以下试验。

1-1.ADBR2GPCR表达细胞系的开发

将ADBR2(β-2肾上腺素能受体)GPCR(G-蛋白偶联受体,SincoBiologicalInc., HF10378-M)克隆到pIRESpuro载体(Clontech,MountainView,CA)，转化到U2OS(ATCC, HTB-96,人骨肉瘤细胞系)，并且使用补充有DEME(HyClone)、10％FBS(HyClone, SH30071.03)和1％抗生素(Gibco,15140)的生长培养基处理来选择单菌落。

将选择的稳定菌落接种到96孔平板，并且检验样本，即，茚达特罗(阳性对照，芝宇 生物科技，中国)，在接种后24小时，在此处理在实施例中制备的ATC2提取物。用福尔 马林溶液固定所述细胞5分钟，用无菌水洗涤，并且利用斑点探测器软件(ThermoFisher， 美国)确定如图4描述的斑点形成。

1-2.阳性对照的功效的评估

将10微摩已熟知的ADBR2激动剂(即，异丙肾上腺素、沙美特罗、福莫特罗、沙丁 胺醇和茚达特罗(芝宇生物科技，中国))对所选的稳定表达ADBR2GPCR的U2OS细胞进 行处理，并且由所述处理引起的斑点形成通过使用Cellomics仪器中的斑点探测器软件来测 定(ThermoFisher，美国)。

如在图5中可见，已经确定的是所有用已熟知的ADBR2激动剂(异丙肾上腺素、沙 美特罗、福莫特罗、沙丁胺醇和茚达特罗)处理的组，尤其是，茚达特罗处理的组，显示 出明显的斑点形成，并且β2-激动剂(如茚达特罗)通过起ADBR2激动剂(β2-受体)的作 用形成明显的斑点，而40mg/ml的ATC2不形成斑点形成。

1-3.实验样本的功效的评估

将40μg/ml的ATC2和本发明的化合物(即，毛蕊花甙、藜芦酸、梓苷、胡黄连苷 II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇分别20微摩)对所选的稳定表达ADBR2GPCR的 U2OS细胞进行处理，并且由所述处理引起的斑点形成通过使用Cellomics仪器中的斑点 探测器软件来测定(ThermoFisher，美国)。

如在图6中可见，已经确定的是用ATC2和本发明的化合物(即，20微摩的毛蕊花 甙、藜芦酸、梓苷、胡黄连苷II、异香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇)处理的所有组不显 示斑点形成，其意味着，在受体上存在ADRB2-GFP。根据所述结果，已经确定的是ATC 提取物和本发明的化合物不起ADBR2激动剂的作用。

因此，还可确定的是直接靶向主要治疗靶点MUC5AC并且阻止MUC5AC表达的本 发明的提取物和本发明的化合物可以解决常规处理(如通过β2激动剂的处理)存在的问 题，例如，对β2受体的肾上腺素反应(如低钾血症、痛性痉挛、焦虑、心动过速、室性 早搏等)和在口服施用的情况下的不良反应(如由血药浓度的不规则变化导致心率不齐、 癫痫等)。

实验实施例2.基于粘蛋白5AC-靶向细胞的测定系统的建立

已经报道的是粘蛋白5A/C是开发COPD治疗剂的重要靶标(BussePJ,ZhangTF, SrivastavaK,SchofieldB,LiXM.2007.Effectofageingonpulmonaryinflammation,airway hyperresponsivenessandTandBcellresponsesinantigen-sensitizedand-challengedmice. Clinical&ExperimentalAllergy.37(9):1392403.,SmirnovaMG,BirchallJP,PearsonJP.2000. TNF-alphaintheregulationofMUC5ACsecretion:someaspectsofcytokine-inducedmucin hypersecretionontheinvitromodel.Cytokine,12:17326)。

因此，本发明的发明人通过引入可以定量地测定动物细胞水平的靶蛋白的表达的高含 量筛选系统而开发新型高通量筛选试验，并且，为了筛选粘蛋白5AC表达的抑制剂，通 过修改在CellomicsBioApplication上发表的靶激活剂法进行以下实验。

2-1.利用HSC使粘蛋白5A/C表达数字化

将从人肺癌组织中分离的上皮细胞系，A549细胞系(ATCC,CCL-185)，接种到96 孔平板上(5,000个细胞/孔)，并且，中接种后24小时，随即处理20ng/ml的bFGF、100ng/ml 的EGF、20μmol的IGF、5ng/ml的TGF-β1、30nmol的丙烯醛、5nmol的PMA、1μg/ml 的LPSand20ng/ml的IL-1β。粘蛋白5A/C的表达通过Cellomics仪器中的靶激活剂程序 而数字化。

如图7可见，已经确定的是除了TGF-β1的所有试验的物质都增加MUC5A/C的表达。

2-2.TGF-β1对粘蛋白5A/C表达的抑制作用的数字化

用A549细胞系(ATCC,CCL-185)处理各种浓度的TGF-β1(PeproTech,#100-21)，即， 1、5和10ng/ml的TGF-β1，并且，粘蛋白5A/C的表达通过Cellomics仪器中的靶激活 剂程序而数字化。

如图8可见，已经确定的是TGF-β1比对照介质(GM、DMEM、10％FBS、1％抗生 素)更加抑制MUC5A/C的表达。

2-3.TNF-α对粘蛋白5A/C表达的抑制作用的数字化

用A549细胞系处理各种浓度的ATC2提取物2小时，然后随即处理20g/mlTNF-α (Sigma,H8916)24小时。粘蛋白5A/C的表达通过Cellomics仪器中的靶激活剂程序而数字 化。

如图9可见，已经确定的是，在预处理ATC2的情况下以取决于剂量的形式增加 MUC5AC的表达的TNF-α的处理有效抑制MUC5A/C的表达。

2-4.本发明的实验样本对粘蛋白5A/C表达的抑制作用

将用补充有5％酚红和FBS(胎牛血清)的DMEM培养基稀释的A549细胞系(ATCC, CCL-185)接种在6孔平板(4x10⁵个细胞/孔)粘附于此一夜，并且，用A549细胞系处理20 和40μg/ml的ATC2提取物1小时。随即处理30nM丙烯醛诱导粘蛋白5A/C表达。从细 胞中移除所述培养基，用PBS溶液洗涤并且用Trizol(Invitrogen,CA,USA)均质来从细胞 中分离核糖核酸5分钟。收集细胞，转移至离心分离机，用氯仿完全混合15秒，静置3 分钟并且以14,000rpm的速度离心15分钟。将含有核糖核酸的上清液转移至新试管中并 且与异丙醇混合10分钟。将溶液离心以弃去上清液并且加入75％的乙醇至沉淀中。将所 述沉淀以10,000rpm的速度离心5分钟并且弃去上清液。将沉淀的核糖核酸在室温下干燥 20分钟。将干燥的核糖核酸悬浮在用DEPC(焦碳酸二乙酯，W2004，www.biosesang.com， 韩国)处理的蒸馏水中。在核糖核酸定量之后，互补DNA利用1μg的RNA和RT试剂盒 (OmniscriptRT试剂盒,Qiagen,USA)来合成，并且，将合成的cDNA用作模板。随即混合 粘蛋白5A/C引物(正向；5-CGACAACTACTTCTGCGGTGC-3,反向:5-GCACTCATC CTTCCTGTCGTT-3)，在94℃下使用PCRmix(DreamTaq^TMPCRMasterMix,Fermentas, USA)变性5分钟，反应40个循环(即，在94℃下30秒，在58℃下30秒，在72℃下45 秒)，并且，在72℃下进行PCR5分钟以便酶失活。将GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶， Bioneer公司，www.bioneer.co.kr，韩国)用作内标准。

如图10可见，已经确定的是，醛处理增加了MUC5A/C的表达，而以取决于剂量的 方式用发明提取物(ARC2)或本发明的化合物(如毛蕊花甙和6-O-藜芦酰梓醇)的处理 抑制MUC5A/C的表达。

实验实施例3.对小鼠Th2细胞分化的抑制作用

3-1.小鼠Th2细胞分化的建立

利用MACS(MiltenyiBiotec,预定编号130-090-976)将CD4⁺T细胞(CD4⁺CD62L⁺) 从C57BL6小鼠的淋巴结和脾脏中分离，并且，在使用抗-CD3(1μg/mL,BDpharmingen) 和抗-CD28(0.5μg/mL,BDpharmingen)包被的平板上培养收集的CD4⁺T细胞。

TH2细胞的分化由补充有抗-IFN-γ和rmIL-4(Hyclone)的RPMI培养基诱导，并且， 分化程度由FACS(流式细胞仪,Becton-Dickinson,FACSCalibur)测定。

如图11可见，已经确定的是，使用建立的试验条件，因为该条件的分化程度测定为 29.6％，与用于诱导TH2细胞(38％,MerckMilipore,FCIM025162)分化的市售培养基的常 规可用条件的那些分化程度相似，并且，在使用Th2分化标记(IL-4和GATA3)通过RT-PCR (S1000热循环仪,Bio-Rad)实验重新确认标记表达的诱导而诱导分化以确定它们的mRNA 表达之后第三天诱导TH2细胞的分化。

3-2.对小鼠Th2细胞分化的影响

当细胞被诱导分化成Th2细胞时，使用MACS(MiltenyiBiotec,预定编号130-090-976) 从C57BL6小鼠的淋巴结和脾脏中分离初始CD4⁺T细胞(CD4⁺CD62L⁺MiltenyiBiotec, 130-093-227)，并且，随即处理5、10、20和40μg/ml的ATC2。Th2分化的程度由IL-4 分化标记的表达来测定。

如图12可见，已经确定的是，在用各种浓度的ATC2处理的实验组中Th2分化的程 度已经以剂量依赖的方式下降，在5μg/ml的ATC2的情况下是19.2％，而其在对照组中 是29.6％。但是在用20和40μg/ml的ATC2处理的实验组中细胞的总数下降，从而实际 上已经确定的是少于10μg/ml的ATC2从Th2分化中显示出有效抑制浓度，而不影响细 胞总数。

因此，可以确定的是，少于10μg/ml的ATC2是试验中的适合浓度。

3-3.对参与Th2细胞分化的分子表达的光谱变化的影响

当细胞被诱导分化成Th2细胞时，使用MACS(MiltenyiBiotec,预定编号130-090-976) 从C57BL6小鼠的淋巴结和脾脏中分离初始CD4⁺T细胞(CD4⁺CD62L⁺MiltenyiBiotec, 130-093-227)，并且，随即处理2.5、5和10μg/ml的ATC2。Th2分化的程度由IL-4分化 标记的表达来测定。

如图13可见，已经确定的是，与初始细胞相比较，Il-4表达仅在Th2细胞中被诱导， 并且，IL-4分化标记的表达在用2.5μg/ml的ATC2处理的组中急剧下降至大约60％，在 用5μg/ml的ATC2处理的组中急剧下降至大约30％，在用10μg/ml的ATC2处理的组中 急剧下降至大约5％。

由吸烟或空气污染导致的氧化性应激引起破坏肺泡的保持，增加细胞凋亡和炎性应 答，诱导蛋白酶/抗蛋白酶的紊乱，并且通过老化和自身免疫应答增强炎症，从而导致在 30-50年的时间流逝后COPD疾病的发生。COPD显示出特有的特征，例如，空气滞留的 阻塞和肺气肿或肺的特有炎症，如增加的巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、CD8 细胞、趋化因子等的水平。

本试验通过LPS和CS的气管内滴注法(i.t.)分析试验样本(ATC2、毛蕊花甙、罗氟司 特)在COPD诱导的小鼠中的有效浓度。

在结果中，已经确定的是，关于BALF的总免疫细胞、嗜中性粒细胞和T淋巴细胞 等的数量，15mg/kg以上的ATC2、15mg/kg的毛蕊花甙和15mg/kg的罗氟司特，显示 出相似的抑制作用。关于TNF-a、KC/CXCL-1和MIP-2(破坏肺泡的介体)的再生水平， 15mg/kg以上的ATC2、15mg/kg的毛蕊花甙和罗氟司特15mg/kg的罗氟司特，显示出 相似的抑制作用。

通过那些结果，已经确定的是，15mg/kg以上的ATC2、15mg/kg的毛蕊花甙和15 mg/kg的罗氟司特，通过抑制由COPD的发生导致的招募至肺的嗜中性粒细胞的增殖和活 化显示出有效力的抗COPD活性。

实验实施例4.动物模型实验(小鼠)

为测定本发明的提取物或化合物对BALF的总免疫细胞、嗜中性粒细胞和T淋巴细 胞等的抗COPD作用，和TNF-a、KC/CXCL-1和MIP-2的再生水平，利用COPD诱导 的小鼠进行以下试验。

4-1.实验动物

从ORIENT公司(www.orient.co.kr，首尔，韩国)购买血清学常规筛查相关呼吸病原 体的8周龄的无特定病原体的雄性BALB/c小鼠(大约18-20g，)，并且，在控制22±2℃的 温度和55±15％的湿度的饲养室中在明-暗循环下允许随意取得饲料和水的喂养12小时， 并且适应实验环境一周。

4-2.药物和施用

(1)实验样本

在0.5％CMC(羧甲基纤维素钠)中溶解4种试验样本，即，ATC2(30mg/kg)、毛蕊花 甙(30mg/kg)、茚达特罗(30mg/kg)、罗氟司特(30mg/kg)，并且用作试验样本。

(2)施用

在气管内滴注(i.t.)前1小时，将ATC2、毛蕊花甙、茚达特罗、罗氟司特各30mg/kg 与100μl的LPS+CS混合物{LPS(100μg/ml)+标准香烟提取物(吸烟(CS),4㎎/ml)＝ 1:1}混合，并且，向小鼠口服施用。

(3)标准香烟提取物的制备(吸烟；CS)

-试验材料：60片的标准香烟CM7(CorestaMoniteringCigarette7，HeinrBorgwaldt， 德国)和异丙醇、乙醇(Merck，德国)、正十七烷(Sigma-Aldrich，美国)用作试验材料，并 且自动吸烟机(ISO3308标准产品，自动吸烟机，型号:RM20，HeinrBorgwaldt)用于实 验。

4-3.主流烟的收集

(1)主流烟的收集

根据在KSHISO(标准化国际组织)3402标准(烟草和烟草产品–用于调节和检验大 气)中公开的步骤和韩国指南(香烟种类吸烟欲望抑制因子的有害成分的测定指南，2012 年10月，KFDA)收集标准香烟的主流烟，并且在吸烟室(温度:22±2℃,相对湿度:60± 5％)进行。

根据吸烟程序ISO标准(即，熏体积(35.0±0.3mL)、吸烟间隔(60±0.5秒)、吸烟时 间(2.00±0.02秒)和烟蒂的长度(滤嘴纸+3mm,外包装纸+3mm))使用依照ISO3308标 准(常规分析的香烟–吸烟机–定义和标准条件)的自动吸烟机(ISO3308标准化产品， 自动吸烟机，型号:RM20/CS，HeinrBorgwaldt，德国)燃烧香烟，并且，依照ISO3308 标准(KSHISO3308,2000)使用92mm剑桥过滤器(ISO3308标准化产品,RM20,Heinr Borgwaldt,德国)收集香烟的TPM(总颗粒物)。

(2)总颗粒物(TPM)的重量

根据ISO4387标准和韩国指南(香烟种类吸烟欲望抑制因子的有害成分的测定指南， 2012年10月，KFDA)测定含有预燃的剑桥过滤器的烟斗的重量，然后含有燃烧后由剑桥 过滤器收集的香烟烟的的烟斗(RM20/CS,HeinrBorgwaldt,德国)的重量来计算TPM含量 (KSHISO4387,2000；香烟-使用常规分析吸烟机器的总的和无尼古丁干颗粒物的测 定)。

在结果中，已经确定的是，在标准香烟已经燃烧三次的情况下的TPM的含量被分别 测定为16.0621mg(19支),15.9135mg(20支),15.5380mg/cig(20支)。标准香烟的检测总 数是59支，并且，TPM是47.5136mg。

(3)香烟TPM的提取

从烟斗中分离含有RPM的剑桥过滤器，并且，倒入100mL锥形瓶中，在此加入50ml 的异丙醇50mL，彻底混合，在室温下静置超过8小时来提取。提取后，过滤溶液，在真 空下浓缩，并且转移至闪烁管(WHEATON,03-340-25N,USA)以在氮气下浓缩。

根据以下经验式1计算主流烟的香烟TPM含量。

[经验式1]

<TPM含量的计算>

$TPM(mg/cig)=\frac{W_{FHA}-W_{FHB}}{N}$

其中TPM表示总颗粒物；

W_FHA指吸烟后滤材支架(FilterHolder)的重量；

W_FHB指吸烟前滤材支架的重量；

N表示吸烟的总数(vig.)/Trap。

4-4.实验步骤

(1)COPD动物模型

用7％水合氯醛麻醉8周龄BALB/c雄性小鼠，并且，100μl的LPS+CS混合物 {LPS(100μg/ml)+标准香烟提取物(香烟(CS),4㎎/ml)＝1:1}吸入至小鼠(i.t.)每周一 次进行三周来制备COPD动物模型。简单地说，100μl的LPS+CS混合物被均匀地吸入至 固定的小鼠的鼻和口中(i.t.)。实验组被分为六个组，即，(i)没有处理的正常组(未 受损伤的)，(ii)用LPS+CS混合物处理的对照组(COPD-对照)，(iii)在LPS+CS处 理之前1小时用ATC2(30㎎/㎏,p.o)处理的试验样本组(COPD-ATC2)，(iv)在LPS+CS 处理之前1小时用毛蕊花甙(30㎎/㎏,p.o)处理的试验样本组(COPD-毛蕊花甙)，(v)在 LPS+CS处理之前1小时用茚达特罗(30㎎/㎏,p.o)处理的试验样本组(COPD-茚达特罗)， 和(vi)在LPS+CS处理之前1小时用罗氟司特(30㎎/㎏,p.o)处理的试验样本组(COPD- 罗氟司特)。在实验结束后，分离并收集各个小鼠的血液、BALF和肺细胞来试验。

(2)从血液中分离PBMCs和细胞数的测定

在实验结束后，从注射40μl的30I.U肝素(APU8AF,JW制药,韩国)的小鼠中收集 800～1000μl的血液，然后根据心脏穿刺用乙醚麻醉。将500μl的收集的血液加入至 9.5mL的ACK溶液(A1049201.Invitrogen,美国)，并且静置5分钟来溶解红细胞。以 1200rpm速度离心血液5分钟来分离PBMCs(外周血单核细胞)，并且用0.04％台盼蓝 (15250061,Invitrogen,美国)染色来计数总细胞数/ml。

(3)BALF(BAL液体)的分离和总细胞数的测定

在血液收集后，将注射器中含有的1ml的无FBS/DMEM培养基注射到经尸体解剖的 小鼠的气管中，并且，用线固定小鼠来循环血液三次并从BALF中分离细胞。分离血液， 在37℃下用AK溶液处理5分钟来溶解红细胞，用无FBS/DMEM培养基洗涤并用0.04％ 的台盼蓝染色来计数总细胞数。

(4)肺细胞(pneumocyte)的分离和总细胞数的测定

将肺从BALF没被分离的小鼠中移出，并且将肺组织切成薄片。所述薄片加入至无 胎牛血清(FBS)的3ml的DMEM培养基(LM001-05,Welgene,韩国)，并且1㎎/ml的胶 原酶IV(C5138,Sigma-Aldrich,美国)加入到所述培养基。在37℃下用振荡培养箱 (KMC480S,VISIONSCI,韩国)孵育所述培养基30分钟，并且所述组织被消化4次以上来 分离肺细胞。将分离的肺细胞用培养基洗涤，并且允许通过细胞滤网(352350,FALCON, 美国)来移除除细胞或杂质之外的未被消化的组织。在37℃下用ACK溶液处理所述细胞 5分钟来溶解红细胞，用所述培养基再次洗涤，用0.04％的台盼蓝(15250061,Invitrogen,美 国)染色来计数总细胞数。

(5)FACS分析

将分离的PBMCs、BAL(支气管肺泡)和肺细胞调节至5x10⁵个细胞，并在4℃下进 行免疫荧光染色。分别在此加入PE-抗-CD3e(553064,BDPharmingen,美国)、FITC-抗 -CD8(553031,BDPharmingen,美国)、PE-抗-CD4(553047,BDPharmingen,美国)、PE-抗 -Gr-1(553128,BDPharmingen,美国)和FITC-抗嗜中性粒细胞(ab55453,Abcam,英国)， 并且在冰中反应30分钟。反应之后，用磷酸盐缓冲的生理盐溶液洗涤三次以上，并且， 使用流式细胞仪(FACSCalibur,Becton,Dickinson,美国)的CellQuest程序(643274,BD Biosciences,美国)测定CD3⁺CD4⁺&CD3⁺CD8⁺和Gr-1⁺嗜中性粒细胞⁺的细胞频率(％)， 并且各个组织中的绝对总数通过使用总细胞来计算。

(6)ELISA分析

从小鼠分离的BALF中的IL-1β、IL-6、TNF-a、IL-17、MCP-1和GRO-a(BioSource, 美国)的水平通过酶联免疫吸附检测来测定。将抗IL-1β、IL-6、TNF-a、IL-17、MCP-1和 GRO-a的各个抗体用包被缓冲溶液(291195,R&DSystem,美国)稀释，包被在微孔上并在 4℃下静置过夜。用洗涤缓冲溶液洗涤各孔三次，并且在此加入100μl的10倍稀释的血 清。将所述溶液在室温下静置1小时，用洗涤缓冲溶液(Tween-20,Sigma-Aldrich,美国) 洗涤2次，加入100μl的抗体抗生物素蛋白–HRP结合物(DY998,R&DSystem,美国)， 在室温下静置1小时并再次洗涤。在此加入100μl的TMB底物(555214,BD,美国)。将 所述溶液在阴暗中静置30分钟，并加入50μl的终止液(DY994,R&Dsystem,美国)在 450nm下利用ELISAleader(340PC384,MolecularDevices,美国)来测定吸光度。

(7)肺组织的mRNA基因表达的测定

(7-1)从肺组织中分离RNA

将小鼠的肺组织移出并压成通过加入500ml的RNAzol^B(CS-105B,Tel-Test,美国)被 溶解的片。将50mL的氯仿(CHCl₃)加入混合的漂浮溶液并再次混合15秒。将所述溶液 在冰中静置15分钟，以13,000rpm离心重获大约200mL的上清液，并且将200mL的2- 丙醇加至相等体积的上清液。将所述混合物在冰中静置15分钟，再次以13,000rpm离心， 用80％EtOH洗涤，并用真空泵(ULVAC,美国)干燥3分钟来提取RNA。将提取的RNA 溶解在用焦碳酸二乙酯(DEPC,IBS-BW1004,Intron,韩国)处理的20mL的蒸馏水中，用 75℃的热休克(2050,Lab-Line,印度)使其失活，以用于第一链cDNA的合成。

(7-2)逆转录-聚合酶链式反应

逆转录反应通过以下步骤进行：2μg的用热休克制备的总RNA在37℃下通过加入 DNA酶I(10U/mL)2U/试管反应30分钟，在75℃下变性10分钟，加入2.5mL的10mM dNTPsmix(4026,4027,4028,4029,TaKaRA,日本)、1mL的任意序列六核苷酸(25pmole/ 25mL(11034731001,Roche,德国)、1mL的RNA酶抑制剂(2313A,TaKaRa,日本,20 U/mL)作为RNA抑制剂、1mL的100mMDTT(P1171,Progmega,美国)、4.5mL的5×RT 缓冲液(M531A,Promega,美国)和250mMTris-HCl(pH8.3,375mMKCl,15mM MgCl₂)，再加入1mL的M-MLVRT(200U/mL,M1705,Promega,美国)，并且，溶液的 最终体积通过加入用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的蒸馏水调节至20mL。将20mL的反应 混合物彻底混合，以2,000rpm离心5秒，在37℃下以热休克反应60分钟来合成第一链 cDNA，在95℃下静置5分钟以灭活M-MLVRT，并且合成的cDNA用于聚合酶链式反 应(PCR)。

(7-3)实时荧光定量RT-PCR

合成的cDNA用于使用AppliedBiosystems7500实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems,美国)实时荧光定量PCR(GalliSJ.Allergy,Curr.Biol.,10:R93-95,2006)。 CATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG(VIC,由AppliedBiosystems有限责任公司提供 的产品)用作TGF-β1、MUC5AC和小鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)的探针，并且， Sper-TaqmanPCRMastermix(4369016,ABI)用于实验来反应至最终浓度已达到200nM的 程度。如下进行实时荧光定量PCR：预变性：在50℃下进行2min、在94℃下进行10min, 并且40个循环在95℃下进行0.15min、在60℃下进行1min。G3PDH(4351309,ABI,美 国)在RME处理组和对照组中用作内标准，并且根据以下经验式2计算RQ(相对定量)。 (见表5)

[经验式2]

目标组定量PCRy＝x(1+e)n

x＝起始量，y＝产率，n＝循环数，e＝效率

表5

[表5]

小鼠实时PCR低聚核苷酸的核苷酸序列

(8)组织病理学检查

移出的肺用10％甲醛溶液(F0161,SAMCHUN,韩国)立即固定，用切片机(SM2000R, LEICA,德国)切成薄片，用Hematoxylin&Eosin和用于胶原蛋白沉积染色法的马森三色 染剂来染色。为观察杯状细胞，将所述细胞用PAS(过碘酸-希夫(PeriodicAcid-Schiff))染 色法染色以通过使用400x光学显微镜(333246,NIKON,日本)来观察。

4-5.统计学

从各种实验中获得的所有结果记录为均数+标准误差，并且显著性的检验使用b Student'sT-检验来测定。根据单向方差分析检验(one-wayANOVAtest)分析以上数据来 测定对于各测定的终点的各组之间的统计学上的显著差异，以及各组之间统计学的显著性 根据非参数Mann-Whitney检验和杜恩氏多重比较检验(IBMSPSSstatisticsversion19.0 statisticsoftware,Inc,IBM,美国)测定。各对照(COPD-对照)之间的差异是显而易见的，因 此没有在图片和表格中显示。所述结果(显示为均数±均数的标准误差)表示为P值：< 0.05(*)、<0.01(**)或<0.001(***)作为统计上的显著性。

4-6.实验结果

(1)对BALF的总免疫细胞、嗜中性粒细胞和T-淋巴细胞数的影响

与正常组(Balb/c正常组)的那些相比，对照组(COPD-对照)的总免疫细胞的细胞数、 嗜中性粒细胞⁺Gr-1⁺细胞的总绝对细胞数和CD4⁺&CD8⁺T细胞的总绝对细胞数急剧增 加。与对照组相比，用15mg/kg以上的ATC2(5、10、15、30mg/kg)处理的试验组的总 免疫细胞数减少，并且，与对照组相比，用毛蕊花甙(15mg/kg)和罗氟司特(15mg/kg) (p<0.05)处理的试验组的那些急剧减少(图14)。与对照组相比，用15mg/kg(p<0.001) 和30mg/kg(p<0.001)以上的ATC2(5、10、15、30mg/kg)处理的试验组的嗜中性粒细胞 ⁺Gr-1⁺细胞的总绝对细胞数(总绝对数)分别减少73.2％和81.9％以上，并且，与对照组 相比，用毛蕊花甙(15mg/kg)(p<0.001)和罗氟司特(15mg/kg)(p<0.001)处理的试验组的那 些分别减少93.9％和97.5％以上(图14)。与对照组相比，用15mg/kg(p<0.01)和30mg/kg (p<0.001)的ATC2(5、10、15、30mg/kg)处理的试验组的CD4⁺T细胞的总绝对细胞数(总 绝对数)分别减少47.7％和19.7％以上，并且，与对照组相比，用毛蕊花甙(15mg/kg)和 罗氟司特(15mg/kg)(p<0.001)处理的试验组的那些分别减少32.9％和73.2％以上(图14c)。 与对照组相比，用ATC2(5、10、15、30mg/kg)和毛蕊花甙(15mg/kg)处理的试验组的 CD8⁺T细胞的总绝对细胞数(总绝对数)没有显著性差异，而与对照组的那些相比，用 罗氟司特(15mg/kg)(p<0.001)处理的试验组的那些减少67.2％以上(图14)。

在结果中，已经确定的是，用15mg/kg以上的ATC2(5、10、15、30mg/kg)、毛蕊 花甙(15mg/kg)和罗氟司特(15mg/kg)处理的组对招募至肺的炎性免疫细胞和嗜中性粒细 胞的增殖和活化显示出有效力的抑制作用，引起有效力的抗-COPD活性。

(2)对BALF的嗜中性粒细胞数的影响

与正常组(Balb/c正常组)的那些相比，在小鼠BALF中利用细胞离心涂片机的对照组 (COPD-对照)的Diff-Qick染色的嗜中性粒细胞数急剧增加大约184倍(图15)。如图 15中可见，与对照组相比，用15mg/kg(p<0.001)和30mg/kg(p<0.001)的ATC2(5、10、 15、30mg/kg)处理的试验组的嗜中性粒细胞数分别减少89.1％和72.4％以上，并且，与对 照组相比，用毛蕊花甙(15mg/kg)(p<0.001)和罗氟司特(15mg/kg)(p<0.001)处理的组的 那些分别减少94.2％和99.0％以上。

在结果中，已经确定的是，用15mg/kg以上的ATC2(5、10、15、30mg/kg)、毛蕊 花甙(15mg/kg)和罗氟司特(15mg/kg)处理的组对招募至肺的嗜中性粒细胞的增殖显示出 有效力的抑制作用，引起有效力的抗-COPD活性。

(3)对BALF的CXCL-1、TNF-α和MIP-2的再生的影响

由肺组织中的炎性巨噬细胞产生的、释放的各种趋化因子MIP-2/CXCL-2、TNF-α和 蛋白酶等破坏肺泡层，并且，KC/CXCL-1(趋化因子Gro-α)和CXCL-8刺激嗜中性粒细胞、 释放蛋白酶从而再次破坏肺泡，导致COPD(BlidbergK,PalmbergL,DahlenB,LantzAS, LarssonK.2012.Chemokinereleasebyneutrophilsinchronicobstructivepulmonarydisease. InnateImmun.18:503-510)。

如显示出由ELISA法测定的小鼠的BALF的趋化因子KC/CXCL-1(趋化因子Gro-α) 的再生的图16A可见，与对照组(Balb/c正常组)的那些相比，对照组的趋化因子 KC/CXCL-1(趋化因子Gro-α)的再生急剧增加大约5.9倍。与对照组相比，用15mg/kg和 30mg/kg(p<0.01)的ATC2(5、10、15、30mg/kg)处理的组的趋化因子KC/CXCL-1(趋化 因子Gro-α)的再生分别减少46.8％和83.9％以上，并且，与对照组相比，用毛蕊花甙(15 mg/kg)(p<0.05)和罗氟司特(15mg/kg)(p<0.01)处理的组的那些分别减少57.4％和82.7％以 上。如显示出由ELISA法测定的小鼠的BALF的TNF-α的再生的图16B可见，与对照组 (Balb/c正常组)的那些相比，对照组的TNF-α的再生已经急剧增加大约2.8倍。与对照组 相比，用15mg/kg(p<0.05)和30mg/kg(p<0.01)的ATC2(5、10、15、30mg/kg)处理的组 的TNF-α的再生分别降低45.5％和63.4％以上，并且，与对照组相比，用毛蕊花甙(15 mg/kg)(p<0.05)和罗氟司特(15mg/kg)(p<0.01)处理的组的那些分别减少42.2％和65.0％以 上。如显示出由ELISA法测定的小鼠的BALF的趋化因子MIP-2/CXCL-2的再生的图16C 可见，与对照组(Balb/c正常组)的那些相比，对照组的趋化因子MIP-2/CXCL-2的再生已 经急剧增加大约5.2倍。与对照组相比，用15mg/kg(p<0.05)和30mg/kg(p<0.001)的ATC2 (5、10、15、30mg/kg)处理的组的趋化因子MIP-2/CXCL-2的再生分别降低48.4％和86.4％ 以上，并且，与对照组相比，用毛蕊花甙(15mg/kg)(p<0.01)和罗氟司特(15mg/kg)(p<0.001) 处理的组的那些分别减少63.0％和81.9％以上。

在结果中，已经确定的是，用15mg/kg以上的ATC2(5、10、15、30mg/kg)、毛蕊 花甙(15mg/kg)和罗氟司特(15mg/kg)处理的组对参与肺细胞的破坏的趋化因子 MIP-2/CXCL-2、TNF-α、KC/CXCL-1(趋化因子Gro-α)和CXCL-8等的再生显示出有效力 的抑制作用，引起有效力的抗-COPD活性。

实验实施例5.动物模型实验(大鼠)

为了测定本发明的提取物或化合物对BALF的总免疫细胞、嗜中性粒细胞等的数量、 细胞因子(如IL-1beta、IL-6、TNF-a)的再生水平、MMP-9的活化、促炎性蛋白(如 MMP-9、NF-kB)的表达和肺组织的炎性反应的抗COPD作用，使用COPD诱导的小鼠 进行以下试验。

5-1.实验动物

从ORIENT公司(www.orient.co.kr，首尔，韩国)购买血清学常规筛查相关呼吸病原 体的6周龄的无特异病原体雄性Sprague-Dawley大鼠(大约180-200g)，并且，在控制 22±2℃的温度、和55±15％的湿度的饲养室中在明-暗循环下允许随意取得饲料和水的喂 养12小时，并且适应实验环境一周。

5-2.药物和施用

(1)试验样本

将3种试验样本，即，ATC2(30mg/kg)、毛蕊花甙(30mg/kg)、Daxas(主要成分:罗 氟司特,1mg/kg)，溶解在PBS中，并用作试验样本。

(2)施用

气管内滴注(i.t.)前1小时，将ATC2、毛蕊花甙、Daxas以4mg/kg的剂量向小鼠口服 施用。

5-3.COPD大鼠模型的制备

(1)标准香烟

3R4F肯塔基参考香烟(3R4FKentuckyReferenceCigarettes(美国加州大学))用作产 生香烟烟的标准香烟。在启动48～72小时后在协调22±1℃的温度和60±2％的湿度后，使 用每支含有9.4mg的焦油、11mg的TPM(总颗粒物)和12mg的一氧化碳的香烟。

(2)步骤

通过使用香烟烟发生器(美国CH科技公司)进行香烟烟的暴露。根据鼻式吸入法利用 气管式吸入暴露设备(TSESystem,德国)在口服施用试验样本1小时后，香烟烟通过吸入 暴露3天每小时。在实验中进行标准香烟的每一支8次呼吸(体积35mL,持续时间2秒,间 隔1次/分钟)。将试验组分成五组，即，(i)没有处理的正常组(正常对照，NC)，(ii) 暴露于香烟烟的对照组(COPD)，(iii)在香烟烟暴露前1小时用Daxas(1mg/kg,p.o) 处理的试验样本组(DA)，(iv)在香烟烟暴露前1小时用ATC2(30㎎/㎏,p.o)处理的 试验样本组(YPL)和(v)在香烟烟暴露前1小时用毛蕊花甙(30㎎/㎏,p.o)处理的试验 样本组(Ver)。在实验结束后，将各小鼠的血液、BALF和肺细胞分离并收集用来试验。

5-4.BALF分离和免疫细胞数的测定

在结束所述实验后，将小鼠用Zoletil50(3VX9,Virbac,法国,p.o)麻醉，并且将血液通 过尾静脉移出。为了从肺中分离BALF。右肺的支气管用缝合线结扎，然后进行气管切开 术。将IV-use导管(16GA,3S-Cath,Dukwoo,韩国)放入支气管，并且将支气管和导管两 者用缝合线固定。将含有5mL的DPBS(Dubecco氏磷酸盐缓冲盐溶液,14190-250, Invitrogen,美国)的注射器连接于此，并且，强迫DPBS循环三次分离BALF。将用缝合 线结扎的右肺分离，用10％中性福尔马林溶液固定，并且，将剩余的肺组织保留在-70℃ 的冰箱中。将分离的BALF以1500rpm离心15分钟制备细胞团，并且，将上清液保留在 -70℃的冰箱中用于细胞因子分析。将所述细胞团悬浮在DPBS中，并且，所述细胞利用 细胞涂片离心机(CS03270047,Hanil,韩国)附着于载玻片。进行Diff-Quik染色(ZS1003, Sysmex,日本)，并且，通过光学显微镜(DM1000,Leica,德国)观察所述细胞来计数各试验 样本中的免疫细胞数。

5-5.BALF的细胞因子分析

从大鼠分离的BALF中的IL-1β、IL-6和TNF-a(R&DSystem,美国)的水平通过酶联 免疫吸附检测(ELISA)来测定。根据制造商的手册进行各细胞因子的分析，并且，在 450nm下通过ELISAleader(340PC384,分子装置,美国)测定吸光度。

5-6.免疫细胞的表达的测定

(1)明胶酶谱

用经蛋白酶抑制剂(11836153001,Roche,德国)处理的组织裂解缓冲液(C3228, Sigma-Aldrich,美国)均质大鼠的肺组织，并且，将均质的肺组织以12000rpm离心10分 钟来分离上清液。蛋白测定试剂(500-0006,Bio-Rad,美国)用来定量。为测定MMP-9的活 性，含有1％明胶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(G9382, Sigma-Aldrich,美国)用于实验。将蛋白以60μg/泳道的剂量进行电泳。用2.5％TritonX-100 (0694,Amresco,美国)洗涤酶谱凝胶，并且，在37℃利用显色缓冲液(具有CaCl₂的1M Tris-HCl,pH7.5,T1503,Sigma-Aldrich,美国)反应16小时。在结束反应之后，利用考马斯 亮蓝(0472,Amresco,美国)染色酶谱凝胶，并且，利用褪色缓冲液{500mL的甲醇(M1447, Samchun,韩国)+1400mL的D.W+160mL的醋酸(9151,J.T.Baker)}洗涤酶谱凝胶。利用 Chemi-doc(170-8070,Bio-Rad,美国)测定MMP-9条带的密度来测定MMP-9的活性。

(2)蛋白质印迹

将由均质获得的蛋白质以30μg/泳道的剂量进行电泳，并且，利用聚偏氟乙烯(PVDF) 膜(IPVH00010,Millipore,美国)转移。将膜(IPVH00010,Millipore,美国)用5％脱脂乳封 闭，然后与抗MMP-9(ab38898,Abcam,英国)、抗p65(sc-372,圣克鲁斯,美国)和抗-p-p65 (sc-33039,圣克鲁斯,美国)抗体反应。在结束反应后，将所述膜用TBST(含有0.05％ Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲的盐溶液,HT2008,Biosesang,韩国)洗涤，并且在室温 下与适合的二次抗体(sc-358914,SantaCruz,美国)反应1小时。将所述膜用TBST再次洗 涤，并且，所述条带通过使用化学发光试剂盒(34095,Thermo,USA)来确定。

5-7.组织病理学检查

移出的肺立即用10％的甲醛溶液(F0161,SAMCHUN,韩国)固定，并且切成薄片。 用流水洗涤薄片8小时，嵌入环氧树脂，用切片机(CUT4050,MicroTec,德国)切成薄片并 且用苏木精(MHS-16,Sigma-Aldrich,美国)和曙红(HT110-1-32,Sigma-Aldrich,USA)染 色。为了观察肺组织的组织病理学改变，用400x光学显微镜(DM1000,Leica,德国)观察 细胞。

5-8.统计学

由各种实验获得的所有结果利用单向方差分析检验测定，并且，为在此之后比较结果 根据杜恩氏多重比较检验证实各组之间的统计学显著性。

5-9.实验结果

(1)对BALF的总免疫细胞数的影响

在COPD诱导的组中观察嗜中性粒细胞的特有增加水平。用Daxas处理的药物对照 组显示出嗜中性粒细胞的减少的水平，但是，与COPD诱导的组相比不显著。不久，与 COPD诱导的组相比，用ATC2和毛蕊花甙处理的组显示出嗜中性粒细胞和总免疫细胞的 显著减少的水平(图17A)。在嗜中性粒细胞和总免疫细胞水平之间的比例上观察那些减 少的。在计数300免疫细胞的情况下，对COPD诱导的组来说，用Daxas处理的阳性对 照组显示出嗜中性粒细胞数对免疫细胞数的相似比例，而用ATC2和毛蕊花甙处理的组显 示出嗜中性粒细胞数显著减低的比例(图17B)。

(2)对BALF的细胞因子释放的影响

在COPD诱导的组中，在BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平急剧增加。与COPD 诱导的组相比，用Daxas处理的药物对照组未显示出细胞因子的水平显著降低。不久，与 COPD诱导的组相比，用ATC2和毛蕊花甙处理的组显示出细胞因子的水平显著降低，与 用Daxas处理的药物对照组相比，其水平急剧降低(图18)。

(3)对肺组织的MMP-9的活性的影响

在COPD诱导的组中，参与发炎和细胞外基质的降解的重要介体MMP-9的活性显著 增加。不久，用ATC2和毛蕊花甙处理的组显示出MMP-9显著减低的活性，其水平与用 Daxas处理的药物对照组相似(图19)。

(4)对肺组织的促炎性蛋白的表达的影响

在COPD诱导的组中，促炎性蛋白(如MMP-9和NF-κB)的活性显著增加。但是， 在COPD诱导的组中促炎性蛋白的这样增加的表达在用ATC2和毛蕊花甙处理的组中显 著降低，与用Daxas处理的药物对照组相似(图20)。

(5)对肺组织的炎症的影响

在COPD诱导的组中，这里显示支气管、血管周组织和间质组织等中许多细胞的渗 透。但是，在COPD诱导的组中这样增加的炎症在用ATC2和毛蕊花甙处理的组和用Daxas 处理的药物对照组中显著降低，对用ATC2和毛蕊花甙处理的组的炎症的抑制作用比用 Daxas处理的药物对照组的炎症的抑制作用更有效力(图21)。

在结果中，已经确定的是，ATC2和从此分离的化合物(毛蕊花甙等)通过抑制成为 COPD的主要起因的IL-1β、IL-6或TNF-α的释放、NF-κB的活化和MMP-9的表达，对 COPD具有有效力的治疗作用。本发明的提取物或化合物的这些治疗活性被确定与常规可 用的COPD治疗剂(Daxas)相似或比常规可用的COPD治疗剂(Daxas)更有效力。

实验实施例6.大鼠的口服施用的急性毒性试验

急性毒性试验通过向6周龄的SPFSprague-Dawley大鼠施用本发明的提取物和化合 物来进行。

向含有2个大鼠的各组口服施用250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、5000mg/kg的 本发明的提取物和化合物，并且观察大鼠的症状14天。施用所述提取物或化合物之后， 观察所有临床变化，即，死亡率、临床征兆、体重改变，并且进行血液试验，如血液学的 试验和血液学生物化学试验。在尸体解剖后观察腹部器官和胸部器官的异常变化。

就任何组或任何性别而言，没有显示出死亡率的变化、临床征兆、体重改变和总发现。 此外，显示出用5000mg/kg的本发明的提取物或化合物处理的试验组的任何毒性。

因此，已经确定的是，本发明制备的发明提取物和化合物在口服施用中是显示LD₅₀(5000mg/kg以上)的有效力且安全的物质。

具体实施方式

以下，将描述与配制方法和赋形剂的种类，但是，本发明不局限于它们。如下描述典 型的制备实施例。

注射剂的制备

注射剂制品是利用常规注射剂制备法通过溶解活性成分，控制pH至大约7.5，然后 在2ml安瓿瓶(ample)中填充全部成分并灭菌来制备。

散剂的制备

散剂制品通过混合上述成分并填充密封的包装来制备。

片剂的制备

片剂制品通过混合上述成分并压片来制备。

胶囊的制备

片剂制品通过混合上述成分并通过常规明胶制备法填充明胶胶囊来制备。

液体的制备

液体制品利用常规液体制备法通过溶解活性成分，然后在1000ml安瓿瓶中填充全部 成分并灭菌来制备。

健康食品的制备

以上提及的维生素和矿物质混合物可以在许多方面改变。这些变化不应被视为背离本 发明的精神和范围。

健康饮料的制备

健康饮料制品利用常规健康饮料制备法通过溶解活性成分，混合，在85℃下搅拌1 小时，过滤，然后在1000ml安瓿瓶中填充全部成分并灭菌来制备。

尽管如此描述本发明，但很明显的是可以在许多方面进行改变。这些变化不应被视为 背离本发明的精神和范围，并且对于本领域技术人员来讲将是显而易见的所有这样的修改 都旨在包括在以下权利要求的范围之内。

工业实用性

如本发明所述，通过利用BALB/c雄性小鼠进行的各种体内试验(例如，由COPD 发生导致的招募至肺的炎性免疫细胞和嗜中性粒细胞的增殖和活性的抑制试验；参与肺细 胞的损坏的趋化因子(如，MIP-2/CXCL-2、TNF-α、KC/CXCL-1(趋化因子Gro-α)和CXCL-8 等)的再生的抑制试验；在利用SPF(无特定病原体)Sprague-Dawley大鼠的动物试验中通 过降低NF-κB活性减少对IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9表达的释放的影响)以及在分 子表达谱变化试验中诱导对Th2细胞的IL-4-表达的影响的体外试验(例如，对MUC5AC (低聚粘液/凝胶形成)的表达的抑制试验)，来自东北婆婆纳的提取物的含有大量活性物质 (如梓醇衍生物)的发明的纯化提取物或选自藜芦酸、毛蕊花甙、梓苷、胡黄连苷II、异 香草酰梓醇和6-O-藜芦酰梓醇的至少一种化合物显示出有效力的抗COPD活性而无β-2- 受体对抗应答。因此，其可以用作用于治疗和预防慢性阻塞性肺病(COPD)的治疗或功 能性健康食品。