miRNA在急性髓系白血病诊断和治疗中的应用

摘要

本发明公开了一种miRNA在急性髓系白血病诊断和治疗中的应用，所述miRNA是miRNA-1277。通过检测miRNA-1277的表达水平可用于诊断病人是否患有急性髓系白血病。经实验证明，miRNA-1277在急性髓系白血病患者中表达水平明显低于健康人。在此基础上，miRNA-1277还可以用于制备治疗急性髓系白血病的药物。本发明大大提高了急性髓系白血病诊断的敏感性和特异性，同时为急性髓系白血病的基因治疗提供了新的靶点。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种miRNA在急性髓系白血病诊断和治疗 的应用，具体地涉及miRNA-1277在急性髓系白血病诊断和治疗的应用。

背景技术

急性白血病是起源于造血干细胞的克隆性恶性疾病，骨髓中白血病细胞异常 增殖致使正常造血受抑，临床表现为贫血、出血、感染等。急性髓系白血病(AML) 是最常见的成人急性白血病，近年来AML发病率呈逐渐上升的趋势，尽管现有 治疗方法伎患者完全缓解率可达50％～70％，但该病病死率仍较高，针对不同 患者实施个体化分层治疗成为人们关注的问题。综合研究基因对AML发生发展 的作用及其预后影响，有助于探寻有效的抗白血病血管生成治疗靶点，从而进一 步指导临床个体化治疗。

microRNAs(miRNAs)是一类含量丰富的非蛋白编码小分子RNA，miRNAs 主要是与靶mRNA的3’-UTR区域结合,能够抑制mRNA的翻译或直接使 mRNA降解,调节多种生物功能。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的 调控。

检测miRNA的表达水平可以为癌症的临床诊断提供参考。而miRNA的异 常表达直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发癌症的发生。已有报 道证明miRNA可以通过调控靶基因mRNA的表达，在急性髓系白血病中起重要 作用。在未来临床治疗中，miRNA不仅可以成为新的急性髓系白血病早期诊断 和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改变miRNA的表达或者其靶基因的 表达治疗急性髓系白血病等疾病。寻找和鉴定与急性髓系白血病发生相关的 miRNA及其靶基因为miRNA的临床治疗提供基础。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供miRNA-1277在急性髓系 白血病诊断和治疗中的应用。相比传统的急性髓系白血病的诊断方法，使用 miRNA来诊断急性髓系白血病具有及时性、灵敏性，从而使患者在疾病早期就 能知晓疾病风险，从而采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了miRNA-1277在制备诊断急性髓系白血病的产品中的应用，所 述miRNA-1277选自以下组中的至少一种：miRNA-1277初始miRNA、 miRNA-1277前体miRNA、成熟miRNA-1277；所述miRNA-1277初始miRNA 能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-1277；所述miRNA-1277前体miRNA 能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-1277。

进一步，所述miRNA-1277是成熟miRNA-1277，核苷酸序列如序列表中的 SEQIDNO.1所示。

应当知道，本发明的miRNA-1277包括组成型核酸分子的功能等同物，即变 体，其显示完整miRNA-1277核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的 缺失、置换或者插入而突变。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者 两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA 的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miRNA-1277功能的条件下，对 miRNA-1277进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的 保护范围之内。

在本发明的一些具体的实施方式中，所述miRNA-1277是成熟miRNA-1277。 所述成熟miRNA-1277包括miRNA-1277-5p、miRNA-1277-3p，它们共同享有共 同的种子序列。

虽然在某些具体实施方式中所使用的是成熟miRNA-1277，但是本领域技术 人员可以预期，初始miRNA(pri-miRNA-1277)、前体miRNA(pre-miRNA-1277) 将可以获得与成熟miRNA-1277同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始 miRNA(pri-miRNA-1277)、前体miRNA(pre-miRNA-1277)加工为成熟 miRNA-1277。

本发明的miRNA-1277核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的 miRNA-1277主要呈单链形式，而miRNA-1277前体是部分自互补的，以形成双 链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

本发明提供了miRNA-1277在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能 获知待检测样本中miRNA-1277的表达水平，将待测样本的结果同健康人的样本 相比，容易判断待测样本是否患有急性髓系白血病以及患急性髓系白血病的风 险。因此，通过高通量测序获得miRNA-1277表达水平与急性髓系白血病相关性 的应用同样包含在本发明的保护范围之内。

本发明提供了一种诊断急性髓系白血病的产品，所述产品能够通过检测 miRNA-1277的表达水平来诊断急性髓系白血病。

进一步，上面所述的产品包括芯片或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体； 以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对 应于上面所述的miRNA-1277的部分或全部序列。所述试剂盒包括用于检测上面 所述的miRNA-1277的表达水平的试剂。

进一步，所述检测miRNA-1277表达水平的试剂包括针对miRNA-1277的引 物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断急性髓系白血病 miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂 盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断急性髓系白血病的情况也包含在本发明 的保护范围之内。

进一步，上面所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用 于诊断急性髓系白血病的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针 放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断急性髓系白血病的情况也 包含在本发明的保护范围之内。

进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材 料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、 未修饰的玻片、塑料片等。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法， 例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚 dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅 片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的 miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的 《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring themetabolicandgeneticcontrolofgeneexpressiononagenomicscale.Science， 1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社， 2000，1-130。

本发明的miRNA-1277可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达 miRNA-1277的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核 表达载体。

病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载 体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒) 载体、甲病毒载体。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达 载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表 达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改 造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

可以表达miRNA-1277的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数 据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miRNA-1277在基因组上 的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-1277初始miRNA的位置， 在miRNA-1277初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物， 扩增引物中间的序列即可获得表达miRNA-1277的DNA片段。

本发明提供了上面所述的miRNA-1277在制备治疗急性髓系白血病药物中 的应用。

进一步，所述药物包含促进所述miRNA-1277表达或增强miRNA-1277功能 的试剂。所述促进miRNA-1277表达或增强miRNA-1277功能的试剂的靶标不限 于miRNA-1277本身，还包括miRNA-1277的上下游，例如：编码miRNA-1277 的基因组序列，miRNA-1277靶基因、调控miRNA-1277的蛋白或者基因。

进一步，促进miRNA-1277表达或增强miRNA-1277功能的试剂包括蛋白、 寡核苷酸、小分子化合物。

优选地，所述的试剂是miRNA-1277的模拟物、miRNA-1277的激动剂、前 体miRNA-1277、携带miRNA-1277的载体。

根据miRNA-1277序列设计出它的模拟物或激动剂，miRNA-1277的模拟物 是化学合成的小RNA，miRNA-1277的激动剂是经过特殊标记和化学修饰的双链 小RNA，将miRNA-1277模拟物或者激动剂转移到人体内后，它们能够明显上 调miRNA-1277的表达。

本发明提供了一种治疗急性髓系白血病的药物，所述药物包括上面所述的促 进miRNA-1277表达或增强miRNA-1277功能的试剂。

本发明的治疗急性髓系白血病的药物还包含药物学上可以接受的载体，所述 载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、 填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活 性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片 剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法 制备。

所述药物可以单独施用或者与其他能够抑制急性髓系白血病的药物进行组 合施用。

所述药物可以离体施用：将miRNA-1277模拟物、miRNA-1277的激动剂、 前体miRNA-1277或者miRNA-1277的表达载体在体外导入或转染人体自身或异 体细胞(或异种细胞)，经体外细胞扩增后，输回人体。

所述药物可以体内施用：将miRNA-1277模拟物、miRNA-1277的激动剂、 前体miRNA-1277或者miRNA-1277的表达载体直接导入体内。这种载体可以是 病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA或RNA。

所述的受试者可以是人类或者其他哺乳动物。更具体地，受试者是器官、组 织、细胞。

本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了miRNA-1277表达水平与急性髓系白血病的发生发展相 关，通过检测受试者miRNA-1277的表达水平，可以判断受试者是否患有急性髓 系白血病或者判断受试者是否存在患有急性髓系白血病的风险，从而指导临床医 师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

附图说明

图1显示利用QPCR检测miRNA-1277在急性髓系白血病患者血液中的表达情 况；

图2显示利用QPCR检测miRNA-1277在急性髓系白血病细胞系中的表达情况；

图3显示miRNA-1277模拟物对miRNA-1277表达的促进作用。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发 明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1与急性髓系白血病相关的miRNA的筛选

1、样本获取：各收集10例健康人血液样本和急性髓系白血病患者血液样本。 上述所有样本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、样本总RNA的提取

使用U-gene公司的BloodRNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：

1)每体积新鲜血液(最大1ml)加入5倍体积的1×XR-I缓冲液，例如： 每1ml血液中加入5ml的XR-I缓冲液，漩涡振荡混匀；

2)冰浴15分钟，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，溶液变清表明红血细胞已 裂解。如果个别样品的血细胞计容或ECR升高时，延长冰浴时间至20min；

3)4℃下450g离心10min沉淀白细胞，完全弃去含有裂解红细胞的上清液；

4)用2倍体积的XR-I缓冲液洗涤在步骤1中用到的每体积的全血，漩涡 振荡以完全悬浮细胞；

5)4℃下450g离心10min，并再次去掉上清；

6)往成团的白细胞中加入XR-II溶解缓冲液/2－巯基乙醇，漩涡振荡充分 混匀。500μl以下的全血就加入400μlXR-II溶解缓冲液，如果在步骤1中用 到的是0.5～1.0ml的血液，则加650μlXR-II溶解缓冲液。在加入XR-II溶解缓 冲液之后，样品应保存于－70℃的条件下；

7)加入等体积的70％乙醇，漩涡振荡混匀；

8)把所有的样品(包括所有的沉淀)加到一个固定在一个2ml收集试管上 的Mu-PuRNA分离柱上。10,000g离心的15秒，弃去流出液体；

9)重复步骤7、8；

10)用移液枪吸750ulRNA洗涤缓冲液I直接加到自旋柱上洗涤柱子。如 上方法离心并弃去2ml收集管；

11)把柱子装到提供的一干净的新2ml收集试管上，加入500μl用乙醇稀 释的RNA洗涤缓冲液II，离心，弃去流出液，重复使用该收集试管；

12)加入400μlWashsolution，14000g离心2min；

13)再用500μl的RNA洗涤缓冲液II洗涤柱子，离心并弃去流出液。然后 用一个空的收集试管，极速离心空柱子1min以甩干Mu-Pu柱基质；

14)洗脱RNA。把柱子转移到一干凈的1.5ml离心管(试剂盒无提供)并 用50～100μl的DEPC-水(由试剂盒提供)洗脱RNA。确保加入的DEPC-水是 直接加在柱基质上，极速离心1min；

15)加入100μlEnzymeIncubationBuffer和15μlDNaseI，14000g离心1min；

16)将收集管中的溶液重新移入柱，室温放置15min；

17)将收集到的RNA保存在-70^℃冰箱中，待用。

3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求： OD260/OD280为1.8-2.2。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，AgilentTechnologies2100 Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一 般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。

4、miRNA的提取和标记

1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照 相应说明书。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标 记方法大致如下：1.4μgmiRNA和500ng5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶 cy3-3’(Dharmacon，Chicago，USA)及2单位T4RNAligase(NEB，Ipswich，USA)， 于4℃孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。

2)标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇进行沉淀，再用15μl含 3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用 LifterSlipTM(Erie，PAUSA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。

3)将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上(CapitalBioCorp，Beijing，China) 于42℃水浴过夜，用洗液洗两遍。

5、miRNA芯片操作：

miRNA芯片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片(单通道芯片)， 按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。

6、结果：

分析miRNA芯片表达谱的检测结果，可知miRNA-1277在急性髓系白血病 患者血液中和健康人的血液中的表达存在显著差异，与健康人的血液相比，在急 性髓系白血病血液中miRNA-1277的水平显著降低。

实施例2QPCR验证差异表达的miRNA-1277

1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-1277进行大样本QPCR验证。按 照实施例1中的样本收集方式选择急性髓系白血病患者血液样本和健康人血液样 本各80例。

2、RNA提取过程同实施例1。

3、逆转录：

1)按照表1配制反应体系

表1反应体系

RNA模板 1μg 10×缓冲液 2μl dATP(10mM) 2μl polyA多聚酶 0.5μl RNase抑制剂 0.5μl ddH₂O 补足到20μl

37℃孵育1h。

2)反应管中加入1μl0.5μg/μlOligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min。

3)立即冰上孵育2min，打断RNA和引物的二级结构。

4)将上述20μl反应混合物与4μl5×缓冲液、1μldNTP(10mM)，0.5μlM-MLV 逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μlpolyA反应混合液和4μl无 核糖核酸酶水(RNasefreewater)混合，42℃孵育1h。

4、QPCR反应：

1)引物设计

扩增miRNA-1277的引物

正向引物：TACGTAGATATATATGTATTTT(SEQIDNO.2)

反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQIDNO.3)

扩增U6snRNA的引物

正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQIDNO.4)

反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQIDNO.5)

2)按照表2配制PCR反应体系：

其中，SYBRGreen聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表2PCR反应体系

体积 SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl 正向引物 1μl 反向引物 1μl cDNA模板 2μl ddH₂O 8.5μl 总体积 25μl

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，56℃60s)×40个循环。以 SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应， 以U6snRNA作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法 进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与健康人的血液相比，急性髓系白血病患者血液中miRNA-1277 的表达水平显著降低，与miRNA芯片结果一致。

实施例3miRNA-1277在急性髓系白血病细胞系中的表达

1、细胞培养

将急性髓系白血病细胞株U937，KG-1，HL-60和从AML患者与健康人中 分离的骨髓单个核细胞的用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养，置于 37℃、5％CO₂培养箱中。

2、QPCR

2.1细胞总RNA提取：利用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总 RNA的提取，按照说明书指示进行。

2.2QPCR：步骤同实施例2。

3、结果

如图2所示，与健康人骨髓单个核细胞相比，急性髓系白血病细胞株U937， KG-1，HL-60及AML患者的骨髓单个核细胞中miRNA-1277的表达明显降低 (P<0.05)。

实施例4研究miRNA-1277对急性髓系白血病细胞增殖能力的影响

1、设计合成针对miRNA-1277的模拟物

根据miRNA-1277的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成 miRNA-1277模拟物和随机对照序列。

2、细胞培养：U937细胞培养方法同实施例3。

3、细胞转染

将U937细胞分为两组，分别为对照组、miRNA-1277模拟物组。将对照组 及模拟物组分别转染随机对照序列和miRNA-1277模拟物，运用转染试剂 LipofectamineTM2000进行转染，转染方法参照说明书。对照组和miRNA-1277 模拟物组的工作浓度均为5μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。

4、QPCR实验

细胞总RNA提取和PCR步骤同实施例3。

结果如图3所示，与对照组相比，miRNA-1277模拟物组的miRNA-1277的 水平显著上升，表明miRNA-1277模拟物能够有效促进miRNA-1277的表达。

5、细胞增殖实验

将转染48h的U937细胞使用0.25％胰酶消化成细胞悬液，以5×10⁴个/ml 接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml，60min后，MTT法测各孔490nm波长 光吸收值。用光吸收值大小代表活细胞的相对数量。

6、结果

miRNA-1277模拟物组相对光密度值为0.212±0.017，对照组相对光密度值 为1.314±0.062。与对照组相比，miRNA-1277模拟物组光吸收值显著下降 (P<0.05)。上述实验结果表明miRNA-1277模拟物能够显著抑制U937细胞增 殖，同时表明miRNA-1277不利于U937细胞增殖。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明 进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。