一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度羟基酪醇的方法

摘要

本发明公开了一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度羟基酪醇的方法。将油橄榄叶提取物酶解，经乙酸乙酯萃取并浓缩为羟基酪醇软膏，其中羟基酪醇含量5％～20％。以石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水等溶剂按比例混合作为高速逆流溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，取羟基酪醇软膏溶于下相中作为供试品，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定在500～1800r/min转速下，以1～5mL/min的流速注入流动相，在波长210～280nm的紫外检测器检测，整个离心过程采用正相离心旋转，时间为30～300min。待流动相开始流出色谱柱时，收集馏出液，经HPLC检测，制备纯度为60～90％的羟基酪醇。本发明方法操作简单，污染小，分离的羟基酪醇纯度高。

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种应用高速逆流色谱法联用高效液相色谱从植物叶子酶解分离羟基酪醇的方法，属于 天然药物分离和医药保健品应用领域。

二、背景技术

目前国际上对于天然产物的分离技术大多采用超临界萃取技术、大孔树脂柱层析技术、分子蒸馏技术、 膜分离技术等，但对于含量很低且生物活性高的天然产物，面对社会的进步和人类对高科技含量精制产品 的要求，极其缺乏既能实现高纯度物质的分离纯化，又能实现相当量级制备能力的新技术。如果没有这样 的新技术，就很难实现新一代产物的研发与生产，就不能实现高纯度标准物质的制备和高精度质量检定与 控制方法的建立。因此，面对分离技术这一技术瓶颈，高速逆流色谱技术(HSCCC)的出现，为天然药物 活性成分的分离纯化与制备带来了更优的解决方案。

高速逆流色谱技术(HSCCC)，是一种以液液分配为基本原理，不采用任何固态的支撑体(如柱填料、 吸附剂、亲和剂、板床、筛膜，等)，因此，对于天然产物复杂混合物中某些特定成分的高纯度单体的分 离纯化与制备中有如下优势特点：1.高分离效率：分离在旋转运动中进行，两相溶剂都被剧烈振动的离心 力场甩成微小的颗粒，样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并能在这些颗粒振荡与对流的环境中 有效地传递。实现成千上万次地、高效连续溶剂萃取过程，达到高分辨度的分离与纯化。能将样品中有效 成分一步分离提纯至98％以上。2.低使用成本：分离过程不是吸附与淋洗的过程，而是对流穿透的过程， 节省昂贵的填料的费用，节约溶剂的消耗；配制溶剂中大部分为水相，有机溶剂消耗少；大规模生产中可 实现溶剂回收再利用。运行使用中的后续投入很低。3.易工艺放大：工艺重复性100％。从小型仪器上工艺 摸索到大型仪器放大生产容易实现。4.高回收率：免除了支撑体在柱内所占空体积，无不可逆吸附、污染、 变性、失活等影响，样品理论回收率100％。5.洁净环保：整个实验生产过程封闭进行，避免溶剂挥发造成 环境污染及对操作人员造成身体伤害。

橄榄油作为地中海饮食中必不可少的食用油，能大大降低心血管和肺癌的发病率，其营养价值和经 济价值已被大家认可。研究发现这主要由于橄榄油中包含大量的多酚类化合物，如橄榄苦苷、羟基酪醇和 酪醇等。尤其是羟基酪醇(3，4-二羟基苯乙醇，简称HT)，清除自由基的能力强，表现出独特的生物活 性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心脏的冠脉血流、抑制胶原诱导的血小板凝聚、有效地保护香烟有毒成 分丙烯醛造成的视网膜色素上皮细胞的氧化损伤和线粒体功能失调，保护软骨和抗骨质疏松等。羟基酪醇 还能抑制人类早幼细胞白血病细胞HL60、腺癌细胞HT29及HT29克隆体19A、女性乳腺癌MCF-7细胞等扩 散，透过阻滞肿瘤细胞的循环及诱发其凋亡，具有很好的抗癌活性。尽管羟基酪醇有诸多生物活性，但国 际市场上还没有任何公司批量生产天然羟基酪醇产品。天然羟基酪醇以橄榄苦苷酯化物的形式存在，主要 从橄榄果渣和橄榄油加工废水中富集，成本高，目前没有实现羟基酪醇批量制备。Sigma、Aldrich、Fluka、 Merck、Across等公司仅提供少量试剂级橄榄苦苷和羟基酪醇，同时国外有羟基酪醇的不同剂型医药保健 品问世。

天然羟基酪醇是存在于橄榄油中的小分子酚类化合物，含量很低，大多数以酯化物(橄榄苦苷)的形 式存在于油橄榄的各个部位。研究表明，不同品种、不同部位的油橄榄叶中橄榄苦苷和羟基酪醇含量存在 明显差异，而游离的羟基酪醇含量仅有0.01％～0.8％。

目前羟基酪醇主要是从橄榄果、叶，以及在制备橄榄油或餐用橄榄果过程中产生的残渣和废水中分离 的，而废水中橄榄苦苷、女贞苷、毛蕊花苷等糖苷、黄酮苷及多酚类物质成分复杂，分离效率低。而纯化 羟基酪醇主要还是采用柱色谱分离的方法，例如：离子交换树脂、大孔吸附树脂、硅胶层析色谱等。目前 的技术还不能大量地将羟基酪醇从成分复杂的废水中分离出来。

HSCCC分离效率高、操作简单，样品不需要严格的预处理；可从极复杂的粗制样品中一步分离得到 高纯度的组分，可以分离黄酮、生物碱、醌类、类脂等小分子化合物，也可以分离多肽、多糖、蛋白质等 高分子化合物，重现性良好。目前还没有报道采用高速逆流色谱法分离制备羟基酪醇，国际市场上没有批 量高纯度羟基酪醇产品。

三、发明内容

油橄榄果和叶富含橄榄苦苷，可降解生成羟基酪醇。为了实现羟基酪醇高效制备，本发明通过半纤维 素酶水解，首先制备含量5～20％羟基酪醇软膏，再采用高速逆流色谱技术，制备60％～90％羟基酪醇， 为高纯度羟基酪醇批量制备和医药品的开发提供技术。

本专利发明了一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度羟基酪醇的方法，由以下步骤组成：

第一步，羟基酪醇软膏制备

将油橄榄叶提取物酶解，提取物与pH4～7的磷酸盐缓冲溶液固液比为1g∶10～100mL，提取物与生 物酶按质量比为1g∶20～100mg，置于30℃～100℃的恒温水浴摇床中。酶解1h～10h后，过滤，滤液 经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，浓缩物为羟基酪醇软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率1％～20％， 羟基酪醇含量5％～20％；

第二步，高速逆流色谱分离

1)按体积比选择石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水为3～6∶4～8∶3～6∶4～8溶液作为高速逆流萃取溶 剂体系，使羟基酪醇的分配系数在0.5～2，四种溶剂混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相， 下相为流动相，超声脱气；

2)取羟基酪醇浸膏溶于下相中作为供试样品，所述羟基酪醇浸膏与下相的质量体积比(g/mL)为1∶20～ 80；

3)将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，高速逆流色谱仪分离条件在500～1800r/min转 速下，以1～5mL/min的流速注入流动相，在波长210～280nm的紫外检测器检测，当固定相保留率为30％～ 80％时，开始供试样品溶液进样，整个离心过程采用正相离心旋转，时间为30～300min，用自动馏分收集 器收集馏出液；

第三步，高效液相色谱检测

将第二步自动馏分收集器收集馏出液，用高效液相色谱进行检测羟基酪醇部位集分，回收有机溶剂， 浓缩物为黄色羟基酪醇油状物，其含量60％～90％。

本专利采用油橄榄叶提取物，包括30％～95％橄榄苦苷的油橄榄叶提取物。橄榄苦苷传统水解方法采 用酸水解或者碱水解，水解率一般3～8％，本专利首次采用酶活高的生物酶作为催化剂，如公开的纤维素 酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶等任一种，同时采用各种酶各自的最适温度和pH，尽可能地实 现生物酶的水解活性，也明显提高了橄榄苦苷的降解率和羟基酪醇收率。本专利公开油橄榄叶橄榄苦苷提 取物与4～7的磷酸盐缓冲溶液固液比为1g∶10～100mL，提取物与生物酶按质量比为1g∶20～100mg， 置于30℃～100℃的恒温水浴摇床中酶解。酶解1h～10h后，过滤，滤液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层 浓缩干燥，浓缩物为羟基酪醇软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率1～20％，羟基酪醇含量5～20％。与传 统方法相对，水解效果明显提高。

传统分离方法通过大孔吸附树脂、多次硅胶柱层析羟基酪醇粗提物纯度提高到90％以上，不但时间长， 而且溶剂和硅胶多，尤其硅胶不能再生利用，成本高。相比传统分离方法，本专利首次采用高速逆流色谱 从橄榄叶提取物酶解物中制备高纯度羟基酪醇，整个过程时间为30～300min，能批量制备，每次羟基酪 醇软膏的进样量为10～500mg。本专利一步法，步骤少，简单可行，制备的羟基酪醇纯度明显提高，能满 足新药的开发需求。

本专利选用石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的溶剂体积，配制不同比例使羟基酪醇在上、下相的分配系 数(K)为0.5～2。

本专利首次采用高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度羟基酪醇的方法，高效液相色谱检测参 数ODSC18column(×L，4.6mm×250mm)，填料的粒度2.5～10μm，柱温20～40℃，流动相甲醇和水 比例为1∶1～10，流速：0.6～1.2mL/min^-1，检测波长：230nm。高速逆流色谱制备的黄色羟基酪醇油状物， 经高效液相色谱分析，羟基酪醇含量60％～90％。

本发明的有益效果表现为：

1.针对传统化学合成方法，首次采用半纤维素酶法从油橄榄叶橄榄苦苷提取物制备羟基酪醇粗品，不仅 产率明显提高，而且合成所需试剂更安全，更简单。

2.首次采用高速逆流色谱从油橄榄叶橄榄苦苷提取物的酶解物制备高纯度羟基酪醇。

3.首次采用高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度羟基酪醇，其含量60％～90％。

附图说明

图1橄榄苦苷及其降解产物

图2标准品的高速逆流色谱图

图3标准品经高速逆流色谱分离后HPLC图谱

图4羟基酪醇的高速逆流色谱图

图5羟基酪醇经高速逆流色谱分离后的HPLC图谱

五、具体实施方式

以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。

实施例1高速逆流色谱标准样品分离

1.实验仪器：

FastChrome分析型高速逆流色谱仪(江阴逆流科技有限公司)；分离柱体积：25ml；值范围：0.56～ 0.91；OptiChromeA半制备型高速逆流色谱仪(江阴逆流科技有限公司)；螺旋管分离柱(公转半径：80cm； 值范围：0.50～0.80；螺旋管内径：1.59mm)，单柱体积180ml，双柱体积360ml。

2.实验材料：

分析纯同分异构体酚类样品邻苯二酚，间苯二酚，对苯二酚；正己烷、乙酸乙酯、甲醇、蒸馏水

3.配制溶剂与样品：

配制酚类样品的甲醇混合溶液，混合样品浓度：邻苯二酚20mg/ml+间苯二酚20mg/ml+对苯二酚 10mg/ml；以80％甲醇溶液为溶剂，分别配制200mg/ml邻苯二酚溶液、200mg/ml间苯二酚溶液、和100mg/ml 对苯二酚溶液，充分溶解后，各取1ml，加入9ml的80％甲醇溶剂，混匀，制成待分离的混合样品。

溶剂体系∶正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶5∶1∶5。将300ml正己烷、500ml乙酸乙酯、100ml甲醇、与500ml 蒸馏水充分混合后，分液漏斗分相。

4.实验参数：

邻苯二酚、间苯二酚、和对苯二酚的混合物进行分离，分离条件为∶正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶5∶1∶5) 的溶剂体系；固定相：上相；流动相：下相。

分析型仪器分离条件：柱体积：34ml；流速：1ml/min；室温：22℃；转速：1800rpm；检测波长：254nm。 进样体积：1ml；进样浓度：邻苯二酚2mg/ml+间苯二酚2mg/ml+对苯二酚1mg/ml(混合样品1∶10溶于流 动相中)

制备型仪器分离条件：双柱分离，柱体积360ml；流速：5ml/min；室温：22℃；转速：1200rpm；检 测波长：254nm，进样体积：20ml；样品浓度：邻苯二酚2mg/ml+间苯二酚2mg/ml+对苯二酚1mg/ml(混 合样品1∶10溶于流动相中)。

5.实验步骤：

5.1.固定相注入：开启恒流泵，以最大流速将固定相通过入口注入分离柱中，充满分离柱管路，至出口 端流出后，继续泵1分钟之后停泵。确定有足够的固定相用于注满分离柱(分析柱应准备多于50ml， 制备柱应多于400ml)，此过程中小心不要进空气或者流动相。

5.2.接通外电源，合上仪器后背板左下角的电源开关，设置离心旋转参数；设置恒流泵分离流速(分析 型1ml/min，制备型5ml/min)

5.3.系统平衡：确认离心参数正确，且分离柱中已经注满液体(固定相)。将恒流泵进口的滤器头插入 流动相。按照预设流速启动恒流泵，同时按下离心控制面板上面绿色的“Run”按键，启动离心。

5.4.溶剂系统平衡，即出口的流出溶液全部为清澈的流动相，或者在线检测仪信号平稳后，记录固定相 的排出体积，以计算固定相保留率；

Sf＝(管路总体积-排出的固定相体积)/分离柱体积*100％

本实验以50ml/min速度泵满固定相，以5ml/min速度泵入流动相，启动OptiChrome^TMA-300正向 离心，观察UV3000输出达到系统平衡，计算固定相保留率65％。

5.5.样品配制：取50mg/ml酚类样品混合液(邻苯二酚20mg/ml+间苯二酚20mg/ml+对苯二酚10mg/ml) 以1∶10稀释于溶剂体系的流动相(分析型：0.1ml稀释于0.9ml流动相；制备型：2ml稀释于18ml 流动相)，混匀；

5.6.上样：将相应分离柱的上样阀旋至“loading”位置，将注射器插如连有注射器接头的抽样孔，观察上 样环及进样管，推注射器以排出进样管中的空气，使进样管内充满从上样环中流出的流动相。然后 将进样管插入配制好的样品试管(注意插到底部避免进气泡)，抽吸注射器将样品吸入上样环。可 以将样品注满上样环，也可以部分充满上样环，但是注意不能有空气进入上样环。然后将上样阀旋回 竖直零位置，样品将随泵入的流动相进入分离柱。

5.7.点击色谱工作站中的“数据采集”，记录混合样品的分离曲线。

5.8.分离结束时，按离心控制面板上的“停止”按键停止离心，并将恒流泵停止。点击色谱工作站中的“停 止采集”键，并保存图谱。

5.9.可以选择用氮气或者压缩空气吹出分离柱中所剩的溶液和保留的组分；或者选择用固定相将柱内溶 液以及保留的组分高速推出。

5.10.管路清洗：用恒流泵泵入约1/3柱体积的甲醇，然后用氮气吹出；重复三次。最后一次清洗并吹出 甲醇清洗液后，继续吹气的同时，按下离心控制面板上的“转向”键，显示屏“运转”项将显示“反向离 心停止”，然后将转速设为400rpm，启动离心，有利于管路中残存溶剂的清空。

6.分离结果：

邻苯二酚、对苯二酚和间苯二酚实现了良好分离，如图2和图3。

实施例2高速逆流色谱和高效液相色谱联用方法

第一步，羟基酪醇软膏制备

将油橄榄叶橄榄苦苷提取物酶解，提取物与4～7的磷酸盐缓冲溶液固液比为1g∶10～100mL，提取 物与生物酶按质量比为1g∶20～100mg，置于30℃～100℃的恒温水浴摇床中。酶解1h～10h后，过滤， 滤液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，浓缩物为羟基酪醇软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率1～ 20％，羟基酪醇含量5～20％；

第二步，高速逆流色谱分离

1)按体积比选择石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水为3～6∶4～8∶3～6∶4～8溶液作为高速逆流萃取溶剂体系， 三种溶剂混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气；

2)取羟基酪醇软膏溶于下相中作为供试样品，所述羟基酪醇软膏与下相的质量体积比为1g∶20mL～80mL；

3)将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，高速逆流色谱仪分离条件在500～1800r/min转速下， 以1～5mL/min的流速注入流动相，在波长210～280nm的紫外检测器检测，当固定相保留率为30％～80％ 时，开始供试样品溶液进样，整个离心过程采用正相离心旋转，时间为30～300min，用自动馏分收集器收 集馏出液；

第三步，高效液相色谱检测

将第二步自动馏分收集器收集馏出液，用高效液相色谱进行检测羟基酪醇部位集分，合并羟基酪醇集分， 回收有机溶剂，浓缩物为黄色羟基酪醇油状物，羟基酪醇含量60％～90％。

实施例3高速逆流色谱分离羟基酪醇软膏实验

1.溶剂准备∶石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝2∶3∶2∶3，按体积比配制2000ml，以上相为固定相，以下 相为流动相。

2.样品准备：取实施例3中羟基酪醇软膏50mg，溶于流动相50ml。

3.系统平衡：以50ml/min速度泵满固定相，以5ml/min速度泵入流动相，启动

4.OptiChrome^TMA-300正向离心，观察UV3000输出达到系统平衡，计算固定相保留率：60％

5.上样：将样品通过上样阀注入OptiChrome^TMA-300中。正向离心：将OptiChrome^TMA-300设定为正向 离心旋转，设定。样品经检测器得到图谱，如附图4。

6.HPLC分析：取图4第一个峰吸收最大处时分离出的液体置于HPLC进行检测，通过与标准的羟基酪醇 样

品的图谱进行对比，得到分离羟基酪醇图谱。如附图5.从图5的HPLC图谱可以清晰的看到， OptiChrome^TMA-300成功的将羟基酪醇分离出来。

实施例4高速逆流色谱制备羟基酪醇软膏

1.羟基酪醇软膏制备，将低纯度橄榄苦苷的橄榄叶提取物加入纤维素酶，提取物与生物酶按质量比为1g∶ 10mg，提取物与pH值5的磷酸盐缓冲溶液固液比为1g∶30mL，在50℃水解4小时，过滤，滤液经乙酸 乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，浓缩物为羟基酪醇软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率4.7％，羟基酪醇 含量8.3％；

2.取100mg采用高速逆流色谱仪进行分离，取体积比为2∶4∶1∶3的石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水作为 高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，取 羟基酪醇软膏溶于下相中作为供试品，所述羟基酪醇软膏与下相的质量体积比为1g∶50mL；将固定相充满 高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在800r/min转速下，以1mL/min的流速注入 流动相，在波长230nm的紫外检测器检测，当固定相保留率为50％，开始取供试品作为样品溶液进样，同 时开始用自动馏分收集器收集馏出液，整个离心过程采用正相离心旋转，时间为180～240min。收集得到 的馏出液采用旋转蒸发去除溶剂，得到样品29.8mg.

3.高效液相色谱进行检测，油橄榄羟基酪醇纯度为63％。

实施例5高速逆流色谱制备羟基酪醇软膏

1.羟基酪醇软膏制备，将高纯度橄榄苦苷的橄榄叶提取物加入半纤维素酶，提取物与生物酶按质量比为 1g∶50mg，提取物与pH值5的磷酸盐缓冲溶液固液比为1g∶70mL，在80℃水解5小时，过滤，滤液经 乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，浓缩物为羟基酪醇软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率9.2％，羟基 酪醇含量15.3％；

2.取100mg采用高速逆流色谱仪进行分离，取体积比为1∶4∶1∶3的石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水作为 高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，取 羟基酪醇软膏溶于下相中作为供试品，所述羟基酪醇软膏与下相的质量体积比为1g∶50mL；将固定相充满 高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在1000r/min转速下，以3mL/min的流速注入 流动相，在波长230nm的紫外检测器检测，当固定相保留率为60％，开始取供试品作为样品溶液进样，同 时开始用自动馏分收集器收集馏出液，整个离心过程采用正相离心旋转，时间为180～240min。收集得到 的馏出液采用旋转蒸发去除溶剂，得到样品36.7mg.

3.高效液相色谱进行检测，油橄榄羟基酪醇纯度为85％。

实施例6高速逆流色谱制备羟基酪醇软膏

1.羟基酪醇软膏制备，将低纯度橄榄苦苷的橄榄叶提取物加入β-葡萄糖苷酶，提取物与生物酶按质量比为 1g∶100mg，提取物与pH值7的磷酸盐缓冲溶液固液比为1g∶60mL，在40℃水解8小时，过滤，滤液经 乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，浓缩物为羟基酪醇软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率5.8％，羟基 酪醇含量12.8％；

2.取100mg采用高速逆流色谱仪进行分离，取体积比为2∶3∶1∶4的石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水作为 高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，取 羟基酪醇软膏溶于下相中作为供试品，所述羟基酪醇软膏与下相的质量体积比为1g∶50mL；将固定相充满 高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在1100r/min转速下，以6mL/min的流速注入 流动相，在波长230nm的紫外检测器检测，当固定相保留率为40％，开始取供试品作为样品溶液进样，同 时开始用自动馏分收集器收集馏出液，整个离心过程采用正相离心旋转，时间为180～240min。收集得到 的馏出液采用旋转蒸发去除溶剂，得到样品56.7mg.

3.高效液相色谱进行检测，油橄榄羟基酪醇纯度为73％。

实施例7高速逆流色谱制备羟基酪醇软膏

1.羟基酪醇软膏制备，将高纯度橄榄苦苷的橄榄叶提取物加入木瓜酶，提取物与生物酶按质量比为1g∶ 20mg，提取物与pH值7的磷酸盐缓冲溶液固液比为1g∶40mL，在30℃水解3小时，过滤，滤液经乙酸 乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，浓缩物为羟基酪醇软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率12.5％，羟基酪 醇含量25.3％；

2.取100mg采用高速逆流色谱仪进行分离，取体积比为1∶5∶2∶4的石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水作为 高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，取 羟基酪醇软膏溶于下相中作为供试品，所述羟基酪醇软膏与下相的质量体积比为1g∶50mL；将固定相充满 高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在1150r/min转速下，以5mL/min的流速注入 流动相，在波长230nm的紫外检测器检测，当固定相保留率为70％，开始取供试品作为样品溶液进样，同 时开始用自动馏分收集器收集馏出液，整个离心过程采用正相离心旋转，时间为180～240min。收集得到 的馏出液采用旋转蒸发去除溶剂，得到样品36.1mg.

3.高效液相色谱进行检测，油橄榄羟基酪醇纯度为81％。