一种集提取、扩增和检测一体化的基因检测装置

摘要

本发明描述了在一个装置中综合了核酸提取、特异性靶核酸扩增和检测的一种便携式基因检测装置。这种一体化的装置，全程只需在加样时开盖一次，之后密封，避免靶核酸扩增产物外泄而造成污染。此装置以肉眼可视的形式检测并判读结果，操作简单，适用样本范围广，方便携带，可用于，例如，可以在疫情发生的第一现场进行检测，适用于多种病原体包括呼吸道传染病的早期诊断；筛选可能是遗传病或传染病的核酸序列，以及用于监控传染病治疗的效率。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及医学的普通领域，尤其涉及在一便携式装置中提取核酸，扩增特异的靶核酸并检测扩增核酸序列的方法的领域。

背景技术

由于对传染病和新出现疾病、生物威胁试剂、遗传病和致病因子的环境储库的公共健康影响和认识已经增加了，因此，对于更加信息化、灵敏和特异性的使用快速测定的需求已使得对检测样本工具的要求增加。目前，通过传统的核酸提取方法提取核酸，通过PCR的扩增的方法进行的分子检测是非常灵敏的、特异性的和信息化的。不幸的是，目前可用的提取核酸和核酸检测方法不适合在取样现场使用或在取样现场使用的实用性有限，原因在于其需要精巧的、笨重且昂贵的仪器、专业的实验室材料和/或依赖于使用者干预的多个操作。因此，大部分用于分子检测的样品被装运到集中式实验室，这导致获得所需要的信息需要长的周转时间。

尽管目前研究开发了一些涉及检测扩增的靶序列自动化系统，但目前的技术包括三个步骤。

第一步，核酸提取：

1869年，瑞士医师FriedrichMiescher首例成功的进行了核酸提取。起初，他关注于组成白细胞各种蛋白质，并指出蛋白质是细胞质的主要成分。但在随后的测试试验中发现，当加入酸性溶液时溶液中生成一种沉淀物，再加入碱性溶液时沉淀继而溶解消失。Miescher首例提取出粗糙的DNA，Miescher成功从细胞中提取出DNA后，一些研究者纷纷效仿，并在材料、试剂的应用上进行了不断的探索，由此发展了许多核酸的生物分子提取技术。现如今，从硫氰酸胍盐-苯酚-氯仿提取法到柱纯化技术，已被广泛地用于DNA和RNA的提取。提取方法主要包括以下几种：

1.胍盐裂解法

胍盐是蛋白强变性剂，核酸提取一般采用高浓度的胍盐来裂解细胞，促使核蛋白体解离，同时高浓度的胍盐能使细胞内核酸酶失活，使释放出的核酸不被降解。1977年，Ulrich等首次使用异硫氰酸胍从总RNA中分离纯化出mRNA。该方法特点是利用多数真核细胞中mRNA的3'端有polyA尾巴，使用oligo（dT）—纤维素亲和层析法，从总RNA中分离纯化出mRNA，但此方法费时费力。在Ulrich研究的基础上，1979年Chirgwin等[4]发明了一种破裂细胞膜但不破坏核苷酸的方法，即先将组织在异硫氰酸胍和β-巯基乙醇中混合均匀，然后通过乙醇抽提或氯化铯梯度超速离心来分离纯化细胞中的RNA。该技术是首次能特异性分离RNA的方法，但还是存在诸多缺点，比如耗时长、效率低，并且由于采用苯酚等毒性有机溶剂，操作有一定的风险性。到目前为止，虽然在此基础上发展出了很多核酸提取技术，但均没有克服耗时长、危险性大等诸多弊端。

2.CTAB裂解法

1980年，Murray和Thompson发明了一种方法：使用溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）法可快速提取高纯度的大分子量植物DNA。经液氮研磨样品后，用适当体积的CTAB缓冲液重溶样品。CTAB是一种非离子型去垢剂，它能使核酸和酸性的多糖从低离子强度的溶液中沉淀出来。同时，蛋白质和中性多糖等杂质留在溶液中。CTAB裂解法对产生大量多糖的生物体的核酸提纯非常有用的，如植物和某些革兰氏阴性菌，但这种方法的缺点是：实验步骤多，操作较繁琐。

3.酚抽提法

苯酚作为蛋白变性剂，能使蛋白质快速变性，因此，可用来提取基因组DNA：先用EDTA和SDS为主的裂解缓冲液裂解细胞，再经蛋白酶K处理后，然后用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需的核酸DNA。此法的优点是提取的DNA保持天然状态，且纯度高，可满足临床各种检测所需；缺点是操作繁琐，比较费时，而且使用毒性有机溶剂苯酚对试验人员有一定的危害。

由上所述，现有技术提取核酸存在实验步骤多、操作较繁琐、危险性大等缺点。

第二步，靶核酸扩增：

核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术，1983年美国科学家KaryMullis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶，孕育出了PCR的雏形。经过两年的努力，在实验上证实了PCR的构想，并于1985年申请了有关PCR的第一个专利，在science杂志上发表了第一篇PCR学术论文。从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。KaryMullis也因此获得了诺贝尔化学奖。

PCR技术本身非常简单，且能最大限度地满足生物学家操作DNA的不同要求。PCR技术又以惊人的速度发展，并渗透到各生物学分支科学和临床各科的速度也令其它生物技术望而生叹。PCR在分子生物学、医学研究、生命科学、生物工程、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学等许多科学领域中都具有重要的实际应用价值，并对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展起到巨大的推动作用。PCR能提供基因物质的十分可信的精确分析，比任何现有技术敏感1万到100万倍。有人预测，21世纪为生物世纪，那么PCR便是生物世纪最重要的技术。

在DNA扩增方面,PCR一直是应用最广泛的方法。实时荧光定量PCR检测有较高的灵敏度与特异性，并且易于操作。如TaqMan就是采用这种技术，两端分别标记有荧光与淬灭基团的寡核苷酸探针结合到PCR产物上后，其淬灭基团被具有5′-3′外切酶活性的TaqDNA聚合酶切掉，从而产生荧光，通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进生定性和定量。其缺点是，需要昂贵的检测荧光的仪器，对操作人员的要求较高。

第三步，靶核酸检测：

PCR产物一般为1013拷贝/ml，取0.1ml即为109拷贝，而1mg人基因组DNA才含1.4×106拷贝的单拷贝基因片段，因此使得PCR扩增反应具有强大的扩增能力，提高了检测的敏感性。PCR反应具有强大的扩增效率，也正是其易污染的原因，极微量的污染便可导致假阳性结果。因此，PCR检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题，对临床实验室尤应如此。所以如何消除PCR假阳性结果则成了科研工作者们要解决的一大难题。

在临床上检测扩增的核酸非常大的依赖于扩增产物的杂交和应用各种酶和发光试剂标记的探针的检测。这些技术要求多种试剂，若干洗涤步骤及检测靶核酸的特殊装置。另外，这些技术劳动强度大并要求具有分子生物学专门知识的技术人员。

核酸检测自动化方案不需要专门训练的人员，但设备非常昂贵且由于许多样本将由同一个设备加工因而仍可能存在污染。综上所述，由于现有技术的检测方法需要大型仪器以及扩增产物容易造成污染的缺陷，使得提取核酸进行扩增的诊断受到了很大的限制。

因此，如何克服上述缺陷成为本领域需要解决的问题。

发明内容

本发明目的是克服现有技术不方便携带仪器，且需对样品依次分步的进行提取、扩增、检测，步骤繁琐且不能直接观察检测结果的缺陷，提供一种对靶核酸进行快速提取、扩增及检测一体化的便携式装置。

本发明是一种便携式装置，其在一个装置内综合了核酸提取，特异的靶核酸扩增及检测，使得核酸检测能迅速而准确的进行。本装置可用于所有核酸及其衍生物。本发明可用于鉴别相应于某些疾病的特异性核酸序列，并检测传染性疾病的治疗疗效，但不限于这些用途。

在本发明中，此便携式装置包括两个位于相邻位置的长圆筒，两个圆筒通过可压缩的弹性物质密封相连且能相对上下压缩。样本导入第一个圆筒进行裂解消化，裂解消化后得到的混合物经过过滤系统过滤，过滤后得到的核酸在扩增室进行扩增及标记，最后，经过标记的扩增产物与受体特异性配体结合反应，在试纸条上显色。

本发明采取的扩增方式是恒温扩增方式，具有快速、高效、特异等优点且无需专用设备。

本发明采用的检测方式为核酸试纸条检测，它是对已十分成熟的免疫层析显色法技术加以改进，应用包被上特异性的核酸或蛋白质的纳米级胶体金颗粒（或其它有色颗粒）和特别标记的核酸引物及探针，使扩增后的检测产物和胶体金颗粒结合，在试纸条的检测线（T线）上显色来检测DNA扩增产物；如果无目标DNA，特异性探针则将无法把扩增产物与标记物连接，结果无显色，即读为阴性。密封结构使得靶核酸无泄漏的可能。

本发明设计一种综合提取，特异的靶核酸扩增及检测的便携式装置。本发明根据从样本中提取核酸，扩增特异性靶序列产生双重标记的扩增产物，最后通过配体-受体结合，通过胶体金在试纸条上显色的原理而实施，本发明依赖于核酸杂交。

本发明的方法适用于确定所有的靶核酸序列。本发明完成提取扩增并判读结果，检测后不打开密封的装置，可将其全部废弃于安全处，大大降低了污染的可能，且能迅速而可靠的确定特异性扩增靶核酸的存在与否。

本发明运用气压法代替了离心机等大型仪器，用多重功能性滤膜过滤掉了除核酸以外的所有物质，整个装置成本很低，使用非常方便且不需要笨重的辅助设备。

本发明在加热反应时只需要一个环形的小巧的加热环，使用方便。

本发明可使靶核酸扩增产物的检测在完全密闭状态下完成，大大降低了传统扩增后核酸检测法中因为电泳检测而开盖造成的污染。此方法操作简单，快速，检测成本低，可靠性高，对在生物学领域工作的技术人员来说，有着很大的帮助。

由于核酸扩增检测技术的广泛使用，所以本发明的这项装置可以应用于所有需要使用核酸扩增检测技术法来检测的领域。如临床传染病病原体检测、食品致病菌检测以及农业工业海关牧业等领域在基因水平上的种类鉴定和基因突变检测等方面的应用。

综上所述，本发明的主要优点有：

本发明集提取、扩增和检测一体化，步骤简单且能直接观察结果；

本发明提供的核酸检测装置既方便快捷又经济，操作的简便性使得实验易于进行，且对实验人员的要求也大大降低；

本发明采取的扩增方式是恒温扩增方式，具有快速、高效、特异等优点且无需专用设备；

本发明为密闭性良好的一次性用品，消除了污染的可能性；

本发明为便携式装置，可以应用于所有需要使用核酸扩增检测技术法来检测的领域。

相较于一般的实验室操作，使用本发明的装置对样品进行核酸提取、扩增、检测可降低对操作者的生物危害。附图说明

图1是本发明装置的整体结构；

图2为推杆的平面示意图；

图3是试纸条的平面图；

图4是操作流程图；

图5是加热环的俯视图。

附图标记：

圆筒（1）

螺旋盖（2）

螺旋盖外表面（3）

螺旋盖内表面（4）

孔眼（5）

推杆（6）

橡胶圈（7）

刀片（8）

刀鞘（9）

固定环（10）

固定环（11）

隔层（12）

核酸提取试剂（13）

过滤系统（14）

扩增室（15）

弹性物质（16）

样本垫（17）

有色颗粒结合垫（18）

纤维膜（19）

吸水滤纸垫（20）

检测线（21）

质控线（22）

刀片（23）

吸水纸（24）

圆筒（25）

加热环（26）

电池（27）

具体实施方式：

以下结合附图进一步说明本发明，但并非限制本发明。

本发明提供了一种检测样本中存在的靶核酸序列的方法及装置。样本可包括衍生自农业、细菌和病毒来源和人或其他动物来源的生物学样品，及其其他样品如废水、饮用水，农产品，加工的粮食产品，空气等。本发明还可用于检测表明遗传缺陷或传染性疾病的核酸序列。

本发明涉及在便携式装置的一个圆筒（1）内提取及扩增核酸，随后在另一个圆筒（25）内检测。这些反应腔在功能上是独立的，相继的且紧凑的。所有这些均在一种简单的易于操作的便携式装置内发生。

如图1所示，一种集提取、扩增和检测一体化的基因检测装置由一个中空长圆筒（1）和一个中空长圆筒（25）组成，圆筒（1）密封且顶端具有一个有孔眼（5）的螺旋盖（2），螺旋盖（2）包含其外表面（3）和内表面（4），加样时需拧开螺旋盖（2）。圆形推杆（6）通过孔眼（5）穿过螺旋盖（2），推杆（6）上有两个固定环（10）和（11）。推杆（6）下端包被有一圈厚厚的橡胶圈（7）及一块锋利的刀片（8），刀片（8）外包裹有刀鞘（9），所述橡胶圈（7）的外径与圆筒（1）的内径相同。圆筒（25）通过可压缩的弹性物质（16）与圆筒（1）密封相连且可相对上下压缩。圆筒（25）的特征在于其筒身为全透明的，以便于观察试纸条结果。圆筒（25）内部设有试纸条，所述试纸条分别由样本垫（17）、有色颗粒结合垫（18）、纤维膜（19）和吸水滤纸垫（20）组成，各部分在相邻处部分重叠，纤维膜（19）上还设有检测线（21）和质控线（22）；圆筒（1）的内部空间通过隔层（12）、过滤系统（14）分为三个腔室，过滤系统（14）以下为扩增室（15）。此装置的特征在于，其组成材料不会促进核酸和蛋白质结合以致影响实验结果。而作为进一步的优选方案，此装置选用既耐热耐冷又重量轻的，坚硬且结实的材料。

样本加入该装置后，提取和扩增在圆筒（1）中进行，检测在圆筒（25）中进行。

图2为推杆（6）的平面图，推杆（6）的材料优选为耐热性好，坚固的材料。推杆（6）顶端的直径大于孔眼（5），推杆（6）杆体及底端的直径小于孔眼（5），使其能在孔眼（5）中上下滑动，杆体上刻有一个刻度A，并在此处有一固定环（11）。推杆（6）底端包被有一层厚厚的橡胶圈（7）及一块锋利的刀片（8），刀片（8）外包裹有刀鞘（9），推杆（6）底端包裹的橡胶圈（7）的外径与圆筒（1）的内径相同；推杆（6）在螺旋盖（2）的上端有一固定环（10），使其在未使用前固定在螺旋盖（2）上，不能上下活动，使用时可用剪刀等工具去掉固定环。优选的固定环的材料是能被剪刀或刀轻易去掉的。

图3是试纸条的平面图，试纸条从左到右按顺序有样本垫（17）、有色颗粒结合垫（18）、纤维膜（19）和吸水滤纸垫（20），上述各部分在相邻处全部重叠，纤维膜（19）上还设有检测线（21）和质控线（22）。

图4示出了装置的流程图，样本加入位于圆筒（1）的第一个隔层（12）后，扭紧螺旋盖（2），用加热环（26）温育一段时间后，去除螺旋盖上端的固定环（10），缓缓推动推杆（6）至刻度A，即有第二个固定环（11）的位置，刺破隔层（12），待液体全部流入过滤系统（14）后（大概两分钟），去掉固定环（11），并且将推杆（6）推至最底端；调节加热环（26）的温度并将其放置在第一个圆筒（1）的底端，温育一段时间后，压缩第一个圆筒（1）与第二个圆筒（25），静置一段时间，观察结果。

图5是加热环的俯视图，此加热环有放电池区域（27），还设有螺栓和蝶形螺帽，可调整大小，使其固定在装置上。

所述实施例说明了本发明。所述实施例并非以任何形式限制本发明，在本发明范围内可做各种修改。

实施例1：样本流经优选的便携式装置

便携式装置有两个中长筒，第一个中空长圆筒（1）用以提取并扩增靶核酸序列，第二个中空长圆筒（25）用以检测核酸序列。样本加入位于圆筒（1）的第一个隔层（12），隔层（12）上含有干态裂解试剂用以提取核酸，样本提供了重悬浮裂解剂的液体。盖紧螺旋盖（2），温育一段时间后，去除螺旋盖（2）上端有的固定环（10），缓缓推动推杆（6）至刻度A，即有第二个固定环（11）的位置，这时，液体流入过滤系统（14），两分钟后，去掉固定环（11），并且将推杆（6）推至最底端，这时，过滤后的核酸流入扩增室（15），扩增室（15）含有扩增所需要的所有成分。调节加热环（26）的温度并将其放置在第一个圆筒（1）的底端，温育一段时间后，压缩圆筒（1）与圆筒（25），扩增反应混合物进入第二个圆筒（25），当样本垫（17）吸收足够的液体时，此反应混合物经毛细作用进入有色颗粒结合垫（18）和纤维膜（19），有色颗粒结合垫（18）上的有色颗粒有抗A抗体包被，检测线（21）上有抗B抗体包被，质控线（22）上有抗A抗体，有色颗粒是胶体金颗粒或者乳胶颗粒，纤维膜通常为硝酸纤维素膜或尼龙膜，如果靶序列存在则形成可观测到的线条，由于圆筒（25）由透明材料制成，在不打开整个装置的情况下可直接通过肉眼观测试纸条结果。

实施例2：样本提取系统

一种提取系统的非限制性实例可以包括：

用来浓缩DNA或RNA样本的缓冲组分的裂解液，并且可以包括经特殊处理的多层吸收剂，以及包含但不限于去污剂和碱性缓冲液的提取溶液。

这种裂解液可以破坏细胞壁或细胞膜并将基因样本如DNA或RNA暴露在溶液中。可以设想，可以加入蛋白酶以除去蛋白和细胞壁。可替换地，可以使用分开的溶液型被膜或多层膜。

另外，可以使用各种储存器、活性炭过滤器、离子交换过滤器。此外，过滤器可以是分子截断范围为60,000至300,000D或更高的半透膜以及可以是非粘性涂布的。

该过滤系统可以除去所有潜在的抑制剂、小分子、离子以及蛋白质。

提取的样本可以是全血、痰液、尿液、粪便、组织、器官的一部分或者任何含有靶核酸序列的其他来源。样品取自人、动物或者植物，也可以是天然环境中的。

实施例3：核酸扩增

核酸恒温扩增技术的特点是扩增反应的全过程（除初始的杂交步骤外）均在单一温度，无需在专门的扩增仪器下进行，不像PCR反应那样，需要经历几十个温度变化的循环过程。恒温扩增技术的这一特点，使其支持用于本发明的便携式装置的等温扩增平台，而扩增所需的温度通过加热环实现。

实施例4：核酸试纸条检测

本装置优选的核酸检测方法是核酸试纸条检测技术。

核酸检测试纸条是对已十分成熟的免疫层析显色法技术加以改进，应用包被上特异性的核酸或蛋白质的纳米级胶体金颗粒（或其它有色颗粒）和特别标记的核酸引物及探针，使扩增后的检测产物和胶体金颗粒结合，在试纸条的检测线（T线）上显色来检测DNA扩增产物；如果无目标DNA，特异性探针则将无法把扩增产物与标记物连接，结果无显色，即读为阴性。