一种基于单链DNA核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱的制备方法

摘要

本发明公开了一种基于单链DNA核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱的制备方法，按以下步骤依次进行：(1)对空心石英毛细管内表面进行活化处理；(2)称CTAB于离心管中，分别加入TEOS、APTES、无水乙醇等经过多步处理得到有机/无机杂化整体柱；(3)先后用甲醇和纯净水冲洗；(4)活化，室温反应一段时间，采用PBS缓冲液反复冲洗；(5)将所述赭曲霉素A适配体溶液注入有机/无机杂化整体柱，室温下循环反应低温保存，既得。该产品用于复杂生物样品及食品中痕量、超痕量的赭曲霉素、黄曲霉素等物质的高选择性分离与富集。

说明书

技术领域

本发明属于化学分析测试仪器领域，涉及到基于核酸适配体修饰的有机/无机杂化毛细管整体柱，及一种新型管内固相微萃取整体柱制备方法，该整体柱适用于复杂食品和生物样品中痕量、超痕量赭曲霉毒素等组分的快速、高效、高选择性分离富集。

背景技术

由于待测组分受其共存组分的干扰或者由于测定方法本身灵敏度的限制以及对待测组分状态的要求，绝大多数化学检测和分析方法要求事先对试样进行有效的、合理的处理，即在进行分析测定前应对试样进行物理或者化学的处理，将待测组分从样品中提取出来，排除其它组分对待测组分的干扰。简单、快速、高效、绿色、高选择性、自动化的样品前处理技术是分析复杂样品如血浆、尿液、医药、环境样品和食品中痕量或超痕量待测组分的重要步骤。传统样品前处理技术包括液-液萃取、沉淀分离、离子交换萃取、柱色谱等，相对于仪器分析技术的发展，样品前处理技术的进展较为缓慢，普遍存在耗时、低效、有机溶剂用量大、操作较繁琐、选择性差等问题，导致样品前处理成为整个分析过程中最费时费力的环节，同时在样品分析过程中至少导致了三分之一的误差产生。

固相微萃取(Solid-phasemicroextraction,SPME)技术由Belardi与Pawliszyn在1989年提出，由于集采样、萃取、浓缩及进样于一体，具有耗时少、操作简单、效率高、无溶剂或少溶剂、易与色谱仪器联用等优点，提高了分析速度及灵敏度，已在环境、生物、工业、食品、临床医学等领域的各个方面得到广泛的应用。然而，传统的固相微萃取头存在易折断、萃取量不足等缺点，不利于与高效液相色谱的在线联用。管内固相微萃取(In-tubeSolid-phasemicroextraction,In-tubeSPME)能较好地克服以上问题，易与其它仪器实现在线联用。为此，国内外众多研究小组开发了各种形式的管内固相微萃取，主要有以下三种形式：开管柱、颗粒/纤维填充柱、整体柱。近年来，具有选择性高、稳定性好、制备简单等整体柱成为管内固相微萃取的研究热点。毛细管整体柱克服了开管柱存在的不足，同时也避免了颗粒填充柱操作繁琐的特点，具有制备简单、渗透性好、传质效率高等特点。整体柱材料中，分子印迹聚合物(Molecularlyimprintedpolymer,MIP)由于其类似于“钥匙-锁”相互作用的识别原理，成为选择性整体柱材料研究的主要研究对象。但由于分子印迹技术自身的特点，尚存在合成时材料消耗大、极性溶剂干扰、刚性识别“空穴”易被破坏或变形等不足，以及MIP合成过程中不可避免地产生非特异性结合位点，导致其选择性与抗体-抗原、酶-底物等专一特异性生物识别体系相比存在较大差距，上述问题限制了其在生物样品分析中的应用前景。因此，对于复杂生物样品中痕量、超痕量组分分析而言，寻找水溶液样品适用性好、选择性更强的管内固相微萃取材料是解决问题的关键，而生物识别体系无疑是较好的选择。

核酸适配体是经体外筛选技术-指数富集的配基系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX)从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合目标配体的单链寡核苷酸序列(DNA或RNA)，具有高度专一性，一般是由几十个核苷酸组成，目前已发展成为一种广受关注的新型识别分子。核酸适配体作为一种人工合成的核酸，具有稳定的二级结构和高特异性、高亲和力、便于化学修饰与功能化的特点。基于核酸适配体的各种结构特点，无机离子、有机分子、生物大分子蛋白质、酶等乃至细胞、微生物均可能存在与其对应的高特异性适配体，适配体－靶目标复合物的解离常数通常在μmol到nmol范围内，有的甚至达到pmol。目前适配体的应用主要包括在化学研究检测系统中作为分子识别元件，在生物样品分离富集过程中作为能够与靶目标发生特异性结合的配基以及在医学上用于临床诊断和治疗。例如，ChrisLe等将适配体固定在毛细管色谱整体柱中，用于蛋白质混合物中细胞色素C的分离与检测。Jiang等成功利用SELEX技术筛选获得葡萄球菌肠毒素B(SEB)高亲和力的ssDNA适配体，并发现SEB与葡萄球菌A蛋白和牛血清清蛋白无非特异性的结合，为其诊断与治疗奠定了基础。2008年，Shamah等研究了复合靶(即靶分子的混合物)SELEX技术筛选。Jenison等从RNA库中分离得到茶碱适配体，与茶碱的亲和力比咖啡因高10000倍以上。

近年来，国内外研究者已将焦点移至核酸适配体在分析化学领域的应用。适配体易修饰的特性能使其作为配基可固定在各种材料表面，如硅胶、金属、磁性微球、量子点等，应用于各类分离技术，包括液相色谱、亲和色谱、毛细管电泳、毛细管电色谱、生物传感器及原子力显微镜等。例如，Oznur等通过固载后的核酸适配体6H7和6H5实现了His－tagged蛋白质的分离纯化；Wu等通过将氨基修饰的核酸适配体化学键合到羧基化的磁性微球上，用于分离、富集小麦中生物毒素；zhao等将凝血酶适配体修饰在聚合物整体柱上，对人体血液及尿液中实现了凝血酶的分离、检测。

发明内容

本发明针对前文所述的SPME易折断、萃取量不足、选择性不高及生物样品兼容性较差等问题，将核酸适配体亲合力高、特异性强、生物样品相容性好等特性与In-tubeSPME技术效率高、易与仪器联用、操作简单等优点结合在一起，制备有机/无机杂化毛细管整体柱，通过链霉亲和素与生物素之间高亲和力将核酸适配体固定毛细管整体柱内，研制一种基于核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱新型管内SPME萃取柱，用于复杂生物样品及食品中痕量、超痕量的赭曲霉素、黄曲霉素等物质的高选择性分离与富集。

本发明通过以下技术方案实现：一种基于单链DNA核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱的制备方法，按以下步骤依次进行：

(1)采用食人鱼碱溶液，循环流动方式，对空心石英毛细管内表面进行活化处理；该食人魚碱溶液的配制为30％H₂O₂-70％H₂SO₄(1:4，v:v)，取足量的食人鱼碱溶液，循环流经石英毛细管，置于60℃反应3h，用无水乙醇和水冲洗；

(2)称CTAB于离心管中，分别加入TEOS、APTES、无水乙醇及水，于旋涡混合器上高速涡旋，得CTAB的混匀液，采用注射泵将所述混匀液注入所述步骤(1)处理后的空心石英毛细管中，硅胶片封端，水浴锅恒温反应，取出所述空心石英毛细管，置于烘箱中干燥老化，制备得到有机/无机杂化整体柱；

(3)采用高压液相泵，先后用甲醇和纯净水冲洗所述步骤(2)所得的有机/无机杂化整体柱，分别冲洗一定时间，除去剩余的CTAB；

(4)Na₂CO₃缓冲液(pH＝9.0)配制1mg/LSA溶液为，取SA溶液于试剂瓶中，加入EDC与NHS的混合液及PBS缓冲液，混匀后静置活化，注射泵注入步骤(3)处理后的整体柱，室温反应一段时间，采用PBS缓冲液反复冲洗；

(5)采用Tris-HCl缓冲液配制赭曲霉素A适配体溶液，将所述赭曲霉素A适配体溶液通过注射泵注入所述步骤(4)处理后的有机/无机杂化整体柱，室温下循环反应，用Tris-HCl缓冲液反复冲洗，除去剩余的赭曲霉素A适配体溶液，将被所述Tris-HCl缓冲液冲洗后的有机/无机杂化整体柱于低温保存，既得。

具体来说，有机/无机杂化整体柱制备的优选方案如下，所述步骤(2)和步骤(3)具体地为，在室温下将适量CTAB于离心管中，分别加入TEOS、APTES、无水乙醇及水涡旋混匀，注入步骤(1)处理后的石英毛细管内，40℃水浴反应24h，分别用甲醇和水经高压泵冲洗；

进一步来说，针对内径为0.53mm、长度为15cm的空心熔融石英毛细管，其反应试剂具体用量为112μLTEOS，118μLAPTES，8mgCTAB，215μL的无水乙醇和25μL水。

具体来说，生物素标记的赭曲霉素A核酸适配体固载到有机/无机杂化整体柱内，首先将适量SA在弱酸性条件下通过氨基和羧基发生的酰胺反应偶联在整体柱内，然后应用生物素与链霉亲和素之间的高亲和力作用系统，在适配体缓冲液Tris-HCl中，将赭曲霉素A适配体修饰在有机/无机杂化整体柱内。

进一步来说，所采用的SA偶联条件：200μL链霉亲和素溶液，pH为6.5的10mmol/LPBS缓冲液(0.1mol/LNaCl、10mmol/LNa₂HPO₄/NaH₂PO₄、5mmol/LMgCl₂)及EDC/NHS比例为1:4的混合液；适配体固载条件：1400μL赭曲霉素A适配体溶液，50mmol/LTris-HCl缓冲液(50mmol/LTris-HCl、120mmol/LNaCl、20mmol/LMgCl₂、5mmol/LKCl、pH＝7.4)，适配体固载时间为24h，核酸适配体键合缓冲液为50mmol/LTris缓冲液，核酸适配体溶液浓度为0.205μmol/L。

需要说明一下的是，文中所述CTAB为十六烷基三甲基溴化铵的简称；所述TEOS为正硅酸乙酯的简称；所述APTES为3-氨丙基三乙氧基硅烷的简称；所述SA溶液为链霉亲和素溶液的简称；所述EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的简称；所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的简称；所述PBS缓冲液为磷酸缓冲液的简称，所述赭曲霉素A适配体溶液为Tris-HCl缓冲液配制的赭曲霉素A核酸适配体溶液。

本发明采用溶胶凝胶法制备出既含有机基团又含有无机成分的整体柱骨架结构，得到通透性较好，耐压性较高的石英毛细管整体柱，通过化学键合的方式在整体柱内偶联链霉亲和素作为链接剂，利用生物素与亲和素之间的高亲和力，以及整体柱内骨架结构的高比表面积，显著提高核酸适配体在石英毛细管整体柱内的固载量。将核酸适配体固载到整体柱内，制备得到新型的In-tubeSPME整体柱，即核酸适配体修饰的有机/无机杂化毛细管整体柱。

附图说明

图1.基于核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱制备过程示意图。

图2.核酸适配体修饰的有机/无机杂化石英毛细管整体柱的透射电子显微镜照片(300X)。

图3.核酸适配体修饰的有机/无机杂化石英毛细管整体柱的透射电子显微镜照片(1150X)。

图4.赭曲霉素A核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱In-tubeSPME萃取柱(Apt-OICMC)、乱序赭曲霉素A核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱In-tubeSPME萃取柱(ScrApt-OICMC)、有机/无机杂化石英毛细管整体柱In-tubeSPME萃取柱(OICMC)分别萃取10μg/L赭曲霉素A、赭曲霉素B、黄曲霉素B1、黄曲霉素B2、黄曲霉素G1的标准溶液萃取量对比图。

图5.赭曲霉毒素A及其类似物结构式。

具体实施方式

本实施例以生物素标记的赭曲霉素A核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱In-tubeSPME萃取柱制备为例，对本发明进行详细描述，但并不以此限定本发明的保护范围。

如图1所示，赭曲霉素A核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱In-tubeSPME萃取柱的制备步骤如下：

(1)取内径为0.53mm、长度为15cm的空心熔融石英毛细管(下简称为“该毛细管”)，配制食人鱼碱洗液—30％H₂O₂-H₂SO_4(浓)(1:4，v/v)，采用压力差循环流动式，60℃下清洗处理1.5h；冷却至室温，先用无水乙醇清洗3-5次，再用纯净水清洗3-5次，N₂吹干，置于120℃烘箱内活化2h，除去其表面吸附的水分。

(2)取一洁净的离心管，准确称量8mgCTAB于1.5mL离心管中，分别加入112μLTEOS，118μLAPTES，215μL无水乙醇及25μL水，置于旋涡混合器上高速涡旋30s，采用针头式注射器，迅速将混合物注入步骤(1)处理好的该毛细管中，硅胶片封端，于40℃恒温水浴锅中反应24h，取出该毛细管将其置于75℃烘箱中干燥老化24h，制得整体柱。最后将所制得的整体柱连接至高压泵，分别用甲醇和纯净水冲洗20-30min，除去未反应完全的CTAB。

(3)取200μL1mg/mLSA溶液(Na₂CO₃缓冲液配制，pH＝9.0)于一洁净的小试剂瓶中，加入800μLPBS缓冲液(PBS缓冲液配制，10mmol/LPBS，pH＝6.0-7.0)及1.2mLEDC/NHS混合液(EDC/NHS为4:1)，超声混匀后，静置10min，活化所述SA溶液上的-COOH，然后采用注射泵以20μL/min的流速注入步骤(2)制备好的整体柱内，室温反应24h，最后用PBS缓冲液对与所述SA溶液反应后的整体柱冲洗3次，除去未参与反应的SA。

(4)采用注射泵冲洗步骤(3)制备好的整体柱，取1400μL0.5μmol/L赭曲霉素A适配体溶液(Tris-HCl缓冲液配制，50mmol/LTris-HCl,pH＝6.5-7.5)于干燥洁净试剂瓶，采用注射泵以10μL/min循环注入上述经冲洗Tris-HCl缓冲液后的整体柱内，室温反应24h后，室温下用Tris-HCl缓冲溶液对与所述赭曲霉素A适配体溶液反应后的整体柱冲洗3次，得到赭曲霉素A核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱SPME萃取柱。

本实施案例制备的赭曲霉素A核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱In-tubeSPME萃取柱具有以下优点：

如图1所示，采用食人鱼碱对石英毛细管内表面化学处理，产生大量硅羟基；采用链霉亲和素作为固载核酸适配体的链接剂，通过亲和素与生物素之间高亲和力的牢固结合，及1个链霉亲和素结合4个生物素修饰的赭曲霉素A适配体分子的高配比关系，增强适配体键合强度及密度，延长石英毛细管长度，使适配体键合量显著增大。实验测试结果表明，赭曲霉素A核酸适配体在整体柱内平均键合率为91.9％，适配体键合量达到7.15μg(整体柱有效长度15cm)，相对标准偏差为1.12％(n＝7)，表明该制备方法重现性高、稳定性好。

如图3所示，本发明制备的赭曲霉素A核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱In-tubeSPME萃取柱，对赭曲霉素A(OTA)具有很高的选择性萃取能力。相对于对OTA的结构类似物，如赭曲霉素B、黄曲霉素B1、黄曲霉素B2、黄曲霉素G1及黄曲霉素G2等具有很好的选择性。赭曲霉素A核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱对OTA的萃取量为50.8ng，而对其结构类似物如赭曲霉素B(OTB)、黄曲霉素B1、黄曲霉素B2、黄曲霉素G1及黄曲霉素G2等萃取量仅分别为20.1、10.0、3.5、5.9及2.7ng赭曲霉素A萃取量为其他结构类似物的2.3-14倍。基于OTB与OTA的结构有较高的相似度，该整体柱对OTB的选择性相对其它类似物较大，由此说明OTA适配体修饰的整体柱对OTA及高度结构类似物OTB具有较高的选择性。相比之下，乱序赭曲霉素A核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱，及未经赭曲霉素A核酸适配体修饰的有机/无机杂化石英毛细管整体柱对OTA及其他5种结构类似物的萃取选择性较差，萃取量分别为3.7、5.2、5.2、2.7、3.9、1.2ng和2.1、2.1、2.6、0.9、3.4、0.7ng。这表明本发明所制备的新型In-tubeSPME萃取柱的选择性识别能力源自于萃取柱内固载的赭曲霉素A核酸适配体，同时表明赭曲霉素A核酸适配体修饰的有机/无机杂化石英毛细管整体柱对特定目标分子OTA有很高的选择性分离富集能力，适用于复杂样品中痕量OTA小分子的快速分离与富集(注：生物素标记赭曲霉素A核酸适配体为5′-biothinGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3′；生物素标记乱序赭曲霉素A核酸适配体5′-biothinGAGGAATGAGGGTGAGGCCTTGCGAGCGTTAGGA-3′)。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型。