单克隆抗体NJ001-1在制备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用

摘要

本发明公开了单克隆抗体NJ001-1在制备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。单克隆抗体NJ001-1在制备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。所述的单克隆抗体NJ001-1由保藏号为CCTCC？NO：C201172的杂交瘤细胞株NM001-1分泌。单克隆抗体NJ001-1能有效抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭，并能显著增加TIMP-3mRNA和蛋白表达。单抗NJ001-1作用下，肺腺癌细胞核内单抗NJ001-1特异性抗原能与转录因子FOXP1结合，抑制其对TIMP-3基因启动子区的转录抑制作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物药物领域，涉及单克隆抗体NJ001-1在制备抑制NSCLC侵袭及转移中的应用。

背景技术

肺癌的侵袭与转移是其恶性标志和特征，也是影响肺癌患者治疗效果和导致患者死亡的最主要原因。肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(Non-small-cellLungCancer,NSCLC)，其中NSCLC约占85％，NSCLC中又以肺腺癌最为常见。NSCLC起病隐匿，发展迅速，预后差，不治疗者的中位生存期仅为4～5个月，1年生存率为10％左右，5年生存率不足5％。多数NSCLC患者在临床初诊时已出现远处转移(Ⅳ期)，化疗药物治疗效果很不理想。目前，非小细胞肺癌细胞发生转移的分子机制尚未完全阐明，而临床上也缺乏特异性高、针对性强的抑制肺癌细胞转移的治疗药物。因此，探索肺癌侵袭转移的分子机制，寻找并开发治疗肺癌侵袭转移的有效药物与治疗途径，是肺癌分子生物学研究的关键所在。

肿瘤的侵袭转移是一个多步骤、多阶段、多途径、涉及多基因变化的复杂过程。有研究表明，在癌细胞侵袭和转移过程中多个信号通路可以被激活，如RAS/MAPK通路，Akt/PI3K通路和ERK通路等，从而使细胞产生肿瘤细胞的生物特征和行为。通常情况下，肿瘤侵袭和转移是一个主动的过程，需肿瘤细胞与肿瘤机制成分共同参与，常包括三个步骤：肿瘤细胞与细胞外基质的黏附；肿瘤细胞释放或诱导释放多种蛋白水解酶，降解细胞外基质；降解区域的肿瘤细胞在趋化因子的引导下转移，在此基础上肿瘤细胞于靶标组织中诱导血管形成，对抗宿主抗肿瘤免疫，最终在远处形成转移灶。

金属蛋白酶组织抑制因子-3(TIMP-3)是一种结合细胞外基质(ECM)的非可溶性蛋白。TIMP-3参与正常组织的发育和重建过程，也参与了许多疾病的发生。TIMP-3一方面可以刺激成纤维细胞增殖，另一方面却诱导恶性肿瘤细胞的凋亡。由于TIMP-3能以1∶1分子比例与基质金属蛋白酶(MMPs)非共价结合，抑制MMPs的活性，因此TIMP-3有抑制肿瘤生长、侵袭和转移的作用，肿瘤组织中TIMP-3表达水平的下调或丢失将促进肿瘤的进程。由此可见，基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂(TIMP)是调控非小细胞肺癌侵袭转移能力的关键因子。

恶性肿瘤细胞从原发部位经淋巴、血液、体腔等途径播散到其他部位的过程为肿瘤的转移。恶性肿瘤细胞的转移是其区别于正常细胞的特征之一，是其本身的生物学特征。肿瘤的转移是其危及宿主生命及影响治疗效果的主要原因。恶性肿瘤细胞能够转移，其原因在于它与正常细胞具有诸多方面的不同，如：生长调控机制的丧失、质膜流动性改变、细胞运动能力的改变、细胞异型性增加、粘附性改变、细胞极性改变等。在不同的肿瘤，其细胞特性不完全相同，因此其转移能力也不相同，即使在同一瘤体内，也可能存在具有不同转移潜能的细胞亚群。目前抗转移药物的研究主要针对肿瘤转移的机理以及转移过程中肿瘤细胞、机体组织的各种变化进行了多方面的研究，但由于肿瘤转移本身的多变性、复杂性，影响因素的多样性，以及研究手段的限制，到目前为止，尚未发现确切的可以控制恶性肿瘤转移动药物。

目前，应用于临床的抗肿瘤药物虽然能在一定程度上抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡，然而对肿瘤细胞的侵袭和转移并无显著的抑制作用。肿瘤细胞的凋亡和侵袭转移是分子机制不同的两个病理生理过程。调控细胞凋亡的途径主要包括线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径。然而，肿瘤细胞侵袭转移大多与基质金属蛋白酶及其抑制物的基因表达、上皮间质化等相关。以临床应用的铂类抗肿瘤药物-顺铂、卡铂等为例，虽然铂类药物能显著抑制肿瘤增殖，抗癌谱较广，但其无法抑制肿瘤的侵袭和转移。因此，能够促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长的药物或抗体并不一定能够用于抑制肿瘤侵袭与转移。开发针对恶性肿瘤转移的药物将成为延长肿瘤患者生存时间、提高肿瘤治疗效果的重要途径。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供单克隆抗体NJ001-1在制备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

单克隆抗体NJ001-1在制备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。所述的单克隆抗体NJ001-1由保藏号为CCTCCNO：C201172的杂交瘤细胞株NM001-1分泌。

单克隆抗体NJ001-1在抑制NSCLC侵袭及转移中所作用的关键基因作为靶点在制备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。

所述的单克隆抗体NJ001-1在抑制NSCLC侵袭及转移中所作用的关键基因优选编码转录因子FOXP1。

本发明所述的单克隆抗体NM001-1的制备方法见CN102391992B。

有益效果：

单克隆抗体NJ001-1能够特异性识别位于NSCLC细胞浆与细胞膜上的SP70抗原，具有诱导NSCLC细胞凋亡的作用，且对肿瘤细胞的侵袭和转移也存在潜在性影响。单克隆抗体NJ001-1能有效抑制肺腺癌细胞的迁移(图1)和侵袭(图2)，并能显著增加TIMP-3mRNA和蛋白表达(图3)。单抗NJ001-1作用下，肺腺癌细胞核内NJ001-1特异性抗原能与转录因子FOXP1结合，抑制其对TIMP-3基因启动子区的转录抑制作用。

附图说明

图1细胞划痕实验检测肺腺癌细胞迁移能力

A：单抗NJ001-1处理SPC-A1细胞0h和48h“划痕”图；

B：单抗组与对照组SPC-A1细胞迁移距离比较；

*单抗组和相应对照组间比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图2Transwell实验检测肺腺癌细胞侵袭能力

图3单抗NJ001-1诱导TIMP-3表达

图4单抗NJ001-1特异性抗原(50kDa)与FOXP1相互作用

生物材料样品的保藏信息

杂交瘤细胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCCNO：C201172。

具体实施方式

实施例1

1、细胞迁移检测

收集处于对数生长期的肺腺癌细胞SPC-A-1制成单细胞悬液，以2×10⁵细胞/孔加入6孔细胞培养板中，过夜培养，吸弃培养上清，并用Hank’s液500μl/孔洗一遍。抗体组(50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL三组)：每孔加入单抗NJ001-1溶液，终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL每孔；对照组(0μg/mL)：每孔加入20ml培养液。干预后培养24h和48h，用于细胞迁移检测。每组设3个平行孔，实验重复3次。

2、细胞迁移能力(划痕实验)检测

原理：当细胞长到融合成单层状态是，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”(Wound)。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合(Healing)。基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。

操作过程：

(1)将2×10⁵细胞/孔加入6孔细胞培养板中，过夜培养，待细胞长到融合状态。数量以贴壁后铺满板底为宜；

(2)用消毒后的10μl进口枪头在洗净的细胞表面划出四道相互垂直的“井”字划痕；

(3)吸去细胞培养液，使用PBS缓冲液洗涤细胞3次，洗去划痕产生的细胞碎片；

(4)选择划痕视野，进行标记，并于显微镜下进行观察拍照；

(5)将6孔细胞培养板放入细胞培养箱培养，分别于24h和48h后取出拍照；

(6)划痕愈合情况以细胞伤口愈合间距与细胞划痕的间距比例进行计算。

结果：

50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL浓度的单抗NJ001-1作用于肺腺癌SPC-A-1细胞48h后，“划痕”愈合能力降低，即与对照组(未经单抗NJ001-1处理)相比，单抗组划痕空白处的距离较宽。通过测量单抗组和对照组0h和48h的“划痕”宽度，计算SPC-A-1细胞迁移距离，比较各组SPC-A-1细胞迁移能力的差异。结果显示，单抗组SPC-A-1细胞迁移能力受到不同程度的抑制，其中100μg/mL和150μg/mL单抗NJ001-1作用于SPC-A1后细胞迁移能力降低，与对照组相比具有统计学差异(P值均小于0.05)；50μg/mL单抗NJ001-1作用于SPC-A1后细胞迁移距离变小，但与对照组相比无统计学差异。上述结果表明，单抗NJ001-1能抑制肺腺癌细胞迁移。低剂量单抗NJ001-1对肺腺癌细胞迁移能力的抑制作用并不明显，但随着单抗NJ001-1浓度的增加，肺腺癌细胞的迁移能力逐渐降低，提示单抗NJ001-1能剂量依赖性的对肺腺癌细胞迁移发挥抑制作用。

实施例2

(1)细胞侵袭检测

收集处于对数生长期的SPC-A-1和A549制成单细胞悬液，以8×10⁴细胞/孔加入24孔细胞培养板中。抗体组(50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL三组)：每孔外室加入单抗NJ001-1溶液，终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL每孔；对照组(0μg/mL)：每孔加入500μl培养液。干预后培养24h，用于细胞侵袭检测。每组设3个平行孔，实验重复3次。

(2)细胞侵袭能力(Transwell实验)检测

原理：将transwell小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，上下层培养液以膜相隔。将细胞种在上室内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。选择不同材料的膜和孔径，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

操作过程：

(1)在Transwell24孔细胞培养板的小室中加入60μl基质胶(ECMgel)稀释液，基质胶与无血清RPMI-1640培养液的稀释比例为1:9；

(2)将Transwell24孔细胞培养板放入37℃细胞培养箱，使基质胶自然凝固；

(3)将肺腺癌细胞重悬于无血清RPMI-1640培养液，每小室加入1×10⁵～1×10⁶细胞(具体因细胞穿透能力不同而改变)，上室内无血清RPMI-1640培养液总体积为200μl；

(4)根据细胞分组，在下室内加入500μl含10％FBS的RPMI-1640培养液，其中单抗NJ001-1的浓度分别为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL；

(5)将Transwell24孔细胞培养板放入细胞培养箱培养，于24h后取出；

(6)用棉签将transwell小室内表面的细胞擦去，95％乙醇固定小室外表面细胞20min；

(7)用1％结晶紫染料对小室外表面细胞进行染色，20min；

(8)预冷的PBS缓冲液清洗小室外表面细胞3次，从小室内表面吸去残留液体；

(9)奥林巴斯光学显微镜下观察穿透基质胶的细胞，并拍照计数。

结果：

50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL浓度的单抗NJ001-1作用于肺腺癌细胞(SPC-A1和A549)24h后，发生侵袭的肺腺癌细胞数量明显减少，与对照组(未经单抗NJ001-1处理)相比具有统计学差异(P值均小于0.05)；随着单抗NJ001-1浓度的增加，具有侵袭能力的肺腺癌细胞数量显著减少。上述结果表明，单抗NJ001-1能显著抑制肺腺癌细胞的侵袭能力，并且这种抑制作用具有明显的剂量依赖性。

实施例3TIMP-3表达检测

RT-PCR：

1)样本准备

弃去培养板中培养液，每孔加入700μlTrizol试剂，用Trizol分别反复吹打细胞，进行消化、裂解。待细胞完全溶解后收集溶液于去酶EP管中，-70℃保存。

2)RNA提取

(1)调节台式冷冻高速离心机至4℃；

(2)从-70℃冰箱取出已加Trizol的细胞团；

(3)待细胞团溶解后用枪头轻轻吹打或漩涡震荡混匀，漩涡震荡1min；

(4)室温(15～25℃)放置5min；

(5)加140μl氯仿，轻轻盖紧管盖，剧烈震荡15s；

(6)室温静置2～3min；

(7)4℃12000g×15min，将离心机调至常温；

(8)将上层水相小心吸置一新的EP管(提供)，加1.5倍体积(约525μl)的无水乙醇，用枪头轻轻吹打混匀，立即进行下步操作；

(9)吸700μl至柱内，轻盖管盖，常温(15℃～25℃)，≧10000rpm×15sec弃液，若液体总体积大于700μl则重复步骤(9)；

(10)加700μlBufferRWT至柱子膜上，轻轻盖好盖子，常温(15℃～25℃)，≧10000rpm×15sec弃液；

(11)加500μlBufferRPE至柱子膜上，轻轻盖好盖子，常温(15℃～25℃)，≧10000rpm×15sec弃液；

(12)加500μlBufferRPE至柱子膜上，轻轻盖好盖子，常温(15℃～25℃)，≧10000rpm×2min弃液；

(13)小心移出柱子至新的2mlEP管，高速离心1min；

(14)将柱子移至新的1.5mlEP管，吸取30～50μlddH2O至柱子膜上，轻轻盖好管盖，≧10000rpm×1min；

(15)如果浓度≧30μg，重复步骤(15)。

3)cDNA合成(使用日本TAKAR公司PrimeScript^TMRTMasterMix(PerfectRealTime)反转录试剂盒)

(1)逆转录反应体系：

(2)在PCR扩增仪进行逆转录反应：16℃30min，42℃30min，85℃5min；反应结束后将其放在冰上待用或-70℃保存。

4)PCR检测

(1)反应体系(10μl)：

引物序列：TIMP-3上游引物：5′-CCTGCTGACAGGTCGCGTCT-3′；下游引物：5′-TCCAGAGACACTCGTTCTTG-3′。MMP-7上游引物：5′-TCGAGACTTACCGCATATTAC-3′；下游引物：5′-TCCAGCGTTCATCCTCAT-3′；β-actin作为内参基因，上游引物：5′-TGGCCCCAGCACAATGAA-3′；下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

(2)在PCR扩增仪进行扩增反应：95℃10min1个循环，95℃15sec，60℃1min，45个循环；反应结束后根据所得CT值应用2^-△△CT法计算miRNA的相对表达量。

WesternBlot方法检测蛋白表达

(1)准备制胶板

用洗衣粉液轻轻擦洗玻璃板，用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，晾干后将厚薄两侧玻璃板底部对齐，压力均衡，安装于制胶架；

(2)按下表配制分离胶和浓缩胶

配胶时，按表顺序加试剂，TEMED加入混匀后立即沿一侧缓慢注入玻璃板夹层。分离胶灌制量为4ml/块，留浓缩胶所需高度(比梳齿长度长1cm)，加蒸馏水压平，静置60min(室温较低时延长时间)聚合。倾倒玻璃板去除蒸馏水，滤纸吸干，不能触及凝胶。按上表配制浓缩胶并灌注，与外层的薄玻璃平齐，从一侧倾斜插入梳子，防止气泡产生，静置30min使其聚合，保鲜膜上加适量ddH₂O包裹凝胶后放4℃冰箱过夜；

将玻璃板移入电泳槽，内槽加满电泳缓冲液，观察是否漏液，并且除去黏附于凝胶底部的气泡，否则影响电流畅通，拔去梳子，避免点样孔撕裂；

(3)样品处理与上样

蛋白样品中加入等量的2×电泳样品缓冲液，混匀后煮沸5min，4℃，12000rpm离心5min，取样品加入点样孔，各孔蛋白量均等。同时加分子量标准蛋白质Marker为对照；

(4)电泳

60V电压下电泳至样品全部离开点样孔至分离胶界面时改电压为80V，继续电泳适当时间后断电停止电泳；

(5)转膜

SDS-PAGE快结束时做好转膜的准备工作(准备冰和冰盒，转膜缓冲液预冷，PVDF膜，将海绵和滤纸放入转膜缓冲液中浸泡)

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轻轻撬开玻璃板，根据Marker判断目的片段的位置，切下胶，浸入转膜缓冲液

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根据胶的大小剪相应大小的PVDF膜，膜略大，不能小并剪角做好标记

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PVDF膜用甲醇活化1min，然后用转膜缓冲液漂洗1min

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按黑胶白膜的顺序装好膜和胶的夹层，按胶负极膜正极的顺序装好电泳转移槽

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电泳转移槽放于冰中，槽内放冰袋加入预冷的转膜缓冲液，恒流状态下100mA转膜，转膜电流和时间可根据分子量大小调节

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转膜结束后小心取下膜，5％脱脂奶粉(TBST配制)室温封闭3h

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加一抗反应(抗体按相应说明稀释)，4℃过夜。

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1×TBST洗膜，15min更换一次洗膜缓冲液，共3次

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加二抗，室温反应1h，期间于摇床上缓慢摇动

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1×TBST洗膜，15min更换一次洗膜缓冲液，共3次

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用滤纸吸干膜缓冲液后，将膜放于封口膜上

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加ECL发光AB混合液体，反应3min，操作过程中注意避光

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放入暗盒中在暗室进行曝光，曝光时间从10s到1h不等

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显影，注意把握显影时间，漂洗，定影至胶片透明

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利用凝胶成像系统采集图像并保存

结果：

50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL浓度的单抗NJ001-1作用于肺腺癌细胞(SPC-A1和A549)24h后，能显著增加TIMP-3mRNA和蛋白表达，与对照组(未经单抗NJ001-1处理)相比具有统计学差异(P值均小于0.05)。

实施例4单抗NJ001-1特异性抗原与核转录因子FOXP1的相互作用

免疫共沉淀：

单抗NJ001-1处理SPC-A1后，用总量1mg的SCP-A1细胞核蛋白和POXP1抗体(3μg)或兔IgG和proteinA-Agarose孵育。FOXP1复合物用SDS缓冲液洗脱，获得蛋白进行WesternBlot检测。

结果：

单抗NJ001-1作用下，肺腺癌细胞核内单抗NJ001-1特异性抗原能与转录因子FOXP1结合，抑制其对TIMP-3基因启动子区的转录抑制作用(图4)。