一种在发酵过程中使用改性小麦秸秆制备透明质酸的方法

摘要

本发明涉及了一种在发酵过程中使用改性小麦秸秆制备透明质酸的方法，属于透明质酸领域。针对目前单一用生物提取法或微生物发酵法生产出透明质纯度不高，分子量低，产率低而且生产费用高的弊端，提供了一种在发酵过程中使用改性小麦秸秆制备透明质酸的方法，该方法先用鸡冠、苹果酸钠、过氧化氢酶、牛肉羹制得发酵营养液，再把改性的小麦秸秆铺在发酵罐低，向其加入发酵营养液中后接种酿脓链球菌进行发酵，将发酵液与改性小麦秸秆搅拌、过滤，向滤液中加入十六烷基三甲基氯化铵，把沉淀用水清洗后加入氯化钠溶液浸泡、搅拌、过滤，干燥，即可得透明质酸，该方法利用生物提取法和微生物发酵法相结合，使提取出来的透明质酸纯度好，分子量高，产率高，而且成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种在发酵过程中使用改性小麦秸秆制备透明质酸的方法，属于透明质酸领域。

背景技术

透明质酸（Hyaluronicacid）简称HA，是一种酸性粘多糖，广泛存在于动物的组织细胞间质(基质)和某些细菌的荚膜中。动物组织:主要原料是鸡冠和牛眼玻璃体等.用丙酮或乙醇将原料脱脂、脱水，用蒸馏水浸泡、过滤，然后以氯化钠水溶液和氯仿溶液处理，之后加入胰蛋白酶保温后得到混合液，最后用离子交换剂进行处理、纯化得到精制的透明质酸。这种方法提取率极低，仅1%左右，分离过程复杂，致使透明质酸价格昂贵，达5000美元/公斤，限制了在化妆品中大的量使用。

日本主要利用发酵法生产HA，利用现代发酵技术和发酵设备，使HA发酵产率水平从2～4g/L提高到6g/L。日本已有发酵生产的HA上市，价格大大低于从动物组织提取的产品。我国HA研究起步较晚，其发酵产率为4～5g/L，从发酵液到最终产品的纯化收率为60%～70%。利用微生物发酵法生产HA，关键在于菌种的选育、发酵条件的优化及HA的纯化。1937年，Kendall等发现链球菌可产生HA。研究结果表明，链球菌属的多种细菌具有荚膜，这种荚膜的主要成分就是HA。发酵生产HA所用的菌种一般是将产生HA的链球菌进行物理诱变、化学诱变或物理化学诱变相结合处理得到的。物理和化学诱变相结合的方法多采用紫外照射外加NTG反复处理，从而筛选出高产菌株。链球菌属兼性厌氧菌，发酵时通气并不明显影响菌体的生长，但通气能提高HA的相对分子量，通气量控制在0.2～2vvm，发酵温度通常为37℃。从发酵液中提取HA，通常加入杀菌剂或加热灭活菌体后，离心或过滤除菌杀灭和除去发酵液中的菌体。

发明内容

本发明主要解决的技术问题：针对目前单一用生物提取法或微生物发酵法生产出透明质纯度不高，分子量低，产率低而且生产费用高的弊端，提供了一种在发酵过程中使用改性小麦秸秆制备透明质酸的方法，该方法先用用鸡冠、苹果酸钠、过氧化氢酶、牛肉羹制得发酵营养液，再把改性的小麦秸秆铺在发酵罐低，向其加入发酵营养液中后接种酿脓链球菌进行发酵，发酵结束后，将发酵液与改性小麦秸秆搅拌、过滤，向滤液中加入十六烷基三甲基氯化铵，把沉淀用水清洗后加入氯化钠溶液浸泡、搅拌、过滤，最后将过滤液干燥，即可得透明质酸，该方法利用生物提取法和微生物发酵法相结合，使提取出来的透明质酸纯度好，分子量高，产率高，而且成本低。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种在发酵过程中使用改性小麦秸秆制备透明质酸的方法，其特征在于具体制备方法为：

（1）取公鸡冠用水将其洗净，放入绞肉机中绞成肉末状，然后放入容器中，向其中加入质量分数为55％的氢氧化钠溶液淹没公鸡冠肉末6～8cm，搅拌20～40min，温度设定为50～60℃；

（2）再向上述溶液中加入公鸡冠质量的20～25％的苹果酸钠，以及公鸡冠质量的10～15％的过氧化氢酶，搅拌1～2h，然后过滤，对过滤液进行加热20～35min，温度设定为100～110℃，再冷却至室温，使用质量分数为35％的盐酸溶液调节pH为6.5～7.0；

（3）将上述所得的滤液放入容器中，向其中加入牛肉羹，其加入体积为滤液体积的1.5倍，搅拌均匀，制得发酵营养液；

（4）在发酵罐底部铺设厚3～5cm改性小麦秸秆，向其中加入发酵营养液，加入量为发酵罐内部体积的10～15％，然后接种酿脓链球菌，接种量为10～15％，发酵2～4天，温度设定为30～35℃；

（5）待上述发酵结束后，将发酵液与改性小麦秸秆搅拌30～50min，然后静置过滤；

（6）将上述的过滤物放入容器中，向其中加入乙醇完全淹没过滤物，搅拌3～5h，过滤，向滤液中加入十六烷基三甲基氯化铵，直至无沉淀物产生，把所得沉淀用水清洗，沉淀加入到质量分数为45％的氯化钠溶液完全浸泡，搅拌30～40min，然后过滤，再将过滤液进行喷雾干燥，即可得透明质酸。

所述的改性小麦秸秆的制备方法为：

（1）取小麦秸秆放入切割机中，切割成3～5cm小麦秸秆，将其放入干燥炉中干燥30～40min，温度设定为95～110℃，然后放入挤压机中挤压成块状；

（2）将上述挤压成块状的小麦秸秆放入炭化炉中，以5℃/min的升温速度升温至280～300℃，保持温度1～2h，然后将炭化后的小麦秸秆取出，冷却至28～35℃，放入粉碎机中粉碎成70～90目颗粒；

（3）将上述的颗粒物放入容器中，向其中加入质量分数为45％的氯化铝溶液，淹没颗粒物，再向其中加入氨水，氯化铝与氨水的摩尔比为1:3，搅拌20～35min，温度设定为40～50℃，然后过滤，将过滤放入烘箱中1～2h，温度设定为120～150℃，再将其取出，冷却至室温，即可。

本发明的应用方法：将本发明制成透明质酸用分光光度法进行含量测定为92～96%，用特细黏度法测得分子量为1×10⁶～2×10⁶，将其应用在化妆品的柔肤水中，可以紧致肌肤，保湿时间10～12h。

本发明的有益效果是：

（1）方法利用生物提取法和微生物发酵法相结合，使提取出来的透明质酸纯度高，分子量大，产率高；

（2）该方法制作工艺简单，原料丰富，成本低。

具体实施方式

首先取公鸡冠用水将其洗净，放入绞肉机中绞成肉末状，然后放入容器中，向其中加入质量分数为55％的氢氧化钠溶液淹没公鸡冠肉末6～8cm，搅拌20～40min，温度设定为50～60℃；再向溶液中加入公鸡冠质量的20～25％的苹果酸钠，以及公鸡冠质量的10～15％的过氧化氢酶，搅拌1～2h，然后过滤，对过滤液进行加热20～35min，温度设定为100～110℃，再冷却至室温，使用质量分数为35％的盐酸溶液调节pH为6.5～7.0；将所得的滤液放入容器中，向其中加入牛肉羹，其加入体积为滤液体积的1.5倍，搅拌均匀，制得发酵营养液；在发酵罐底部铺设厚3～5cm改性小麦秸秆，向其中加入发酵营养液，加入量为发酵罐内部体积的10～15％，然后接种酿脓链球菌，接种量为10～15％，发酵2～4天，温度设定为30～35℃；待发酵结束后，将发酵液与改性小麦秸秆搅拌30～50min，然后静置过滤；将上述的过滤物放入容器中，向其中加入乙醇完全淹没过滤物，搅拌3～5h，过滤，向滤液中加入十六烷基三甲基氯化铵，直至无沉淀物产生，把所得沉淀用水清洗，沉淀加入到质量分数为45％的氯化钠溶液完全浸泡，搅拌30～40min，然后过滤，再将过滤液进行喷雾干燥，即可得透明质酸。

所述的改性小麦秸秆的制备方法为：

首先取小麦秸秆放入切割机中，切割成3～5cm小麦秸秆，将其放入干燥炉中干燥30～40min，温度设定为95～110℃，然后放入挤压机中挤压成块状；将挤压成块状的小麦秸秆放入炭化炉中，以5℃/min的升温速度升温至280～300℃，保持温度1～2h，然后将炭化后的小麦秸秆取出，冷却至28～35℃，放入粉碎机中粉碎成70～90目颗粒；将颗粒物放入容器中，向其中加入质量分数为45％的氯化铝溶液，淹没颗粒物，再向其中加入氨水，氯化铝与氨水的摩尔比为1:3，搅拌20～35min，温度设定为40～50℃，然后过滤，将过滤放入烘箱中1～2h，温度设定为120～150℃，再将其取出，冷却至室温，即可。

本发明的应用方法：将本发明制成透明质酸用分光光度法进行含量测定为92～96%，用特细黏度法测得分子量为1×10⁶～2×10⁶，将其应用在化妆品的柔肤水中，可以紧致肌肤，保湿时间10～12h。

实例1

首先取1kg的公鸡冠用水将其洗净，放入绞肉机中绞成肉末状，然后放入容器中，向其中加入500mL质量分数为55％的氢氧化钠溶液淹没公鸡冠肉末6cm，搅拌20min，温度设定为50℃；再向溶液中加入200g的苹果酸钠，以及100g的过氧化氢酶，搅拌1h，然后过滤，对过滤液进行加热20min，温度设定为100℃，再冷却至室温，使用质量分数为35％的盐酸溶液调节pH为6.5；将所得的滤液放入容器中，向其中加入牛肉羹，其加入体积为滤液体积的1.5倍，搅拌均匀，制得发酵营养液；在发酵罐底部铺设厚3cm改性小麦秸秆，向其中加入发酵营养液，加入量为发酵罐内部体积的10％，然后接种酿脓链球菌，接种量为10％，发酵2天，温度设定为30℃；待发酵结束后，将发酵液与改性小麦秸秆搅拌30min，然后静置过滤；将上述的过滤物放入容器中，向其中加入乙醇完全淹没过滤物，搅拌3h，过滤，向滤液中加入十六烷基三甲基氯化铵，直至无沉淀物产生，把所得沉淀用水清洗，沉淀加入到质量分数为45％的氯化钠溶液完全浸泡，搅拌30min，然后过滤，再将过滤液进行喷雾干燥，即可得透明质酸。

所述的改性小麦秸秆的制备方法为：

首先取1kg的小麦秸秆放入切割机中，切割成3cm小麦秸秆，将其放入干燥炉中干燥30min，温度设定为95℃，然后放入挤压机中挤压成块状；将挤压成块状的小麦秸秆放入炭化炉中，以5℃/min的升温速度升温至280℃，保持温度1h，然后将炭化后的小麦秸秆取出，冷却至28℃，放入粉碎机中粉碎成70目颗粒；将颗粒物放入容器中，向其中加入质量分数为45％的氯化铝溶液，淹没颗粒物，再向其中加入氨水，氯化铝与氨水的摩尔比为1:3，搅拌20min，温度设定为40℃，然后过滤，将过滤放入烘箱中1h，温度设定为120℃，再将其取出，冷却至室温，即可。

本发明的应用方法：将本发明制成透明质酸用分光光度法进行含量测定为92%，用特细黏度法测得分子量为1×10⁶，将其应用在化妆品的柔肤水中，可以紧致肌肤，保湿时间10～12h。

实例2

首先取1.5kg的公鸡冠用水将其洗净，放入绞肉机中绞成肉末状，然后放入容器中，向其中加入800mL质量分数为55％的氢氧化钠溶液淹没公鸡冠肉末7cm，搅拌30min，温度设定为55℃；再向溶液中加入公鸡冠质量的22％的苹果酸钠，以及公鸡冠质量的13％的过氧化氢酶，搅拌1.5h，然后过滤，对过滤液进行加热27min，温度设定为105℃，再冷却至室温，使用质量分数为35％的盐酸溶液调节pH为6.8；将所得的滤液放入容器中，向其中加入牛肉羹，其加入体积为滤液体积的1.5倍，搅拌均匀，制得发酵营养液；在发酵罐底部铺设厚4cm改性小麦秸秆，向其中加入发酵营养液，加入量为发酵罐内部体积的12％，然后接种酿脓链球菌，接种量为12％，发酵3天，温度设定为32℃；待发酵结束后，将发酵液与改性小麦秸秆搅拌40min，然后静置过滤；将上述的过滤物放入容器中，向其中加入乙醇完全淹没过滤物，搅拌4h，过滤，向滤液中加入十六烷基三甲基氯化铵，直至无沉淀物产生，把所得沉淀用水清洗，沉淀加入到质量分数为45％的氯化钠溶液完全浸泡，搅拌35min，然后过滤，再将过滤液进行喷雾干燥，即可得透明质酸。

所述的改性小麦秸秆的制备方法为：

首先取1.5kg的小麦秸秆放入切割机中，切割成4cm小麦秸秆，将其放入干燥炉中干燥35min，温度设定为102℃，然后放入挤压机中挤压成块状；将挤压成块状的小麦秸秆放入炭化炉中，以5℃/min的升温速度升温至290℃，保持温度1.5h，然后将炭化后的小麦秸秆取出，冷却至30℃，放入粉碎机中粉碎成80目颗粒；将颗粒物放入容器中，向其中加入质量分数为45％的氯化铝溶液，淹没颗粒物，再向其中加入氨水，氯化铝与氨水的摩尔比为1:3，搅拌28min，温度设定为45℃，然后过滤，将过滤放入烘箱中1.5h，温度设定为135℃，再将其取出，冷却至室温，即可。

本发明的应用方法：将本发明制成透明质酸用分光光度法进行含量测定为94%，用特细黏度法测得分子量为1.5×10⁶，将其应用在化妆品的柔肤水中，可以紧致肌肤，保湿时间10～12h。

实例3

首先取2kg的公鸡冠用水将其洗净，放入绞肉机中绞成肉末状，然后放入容器中，向其中加入1000mL质量分数为55％的氢氧化钠溶液淹没公鸡冠肉末8cm，搅拌40min，温度设定为60℃；再向溶液中加入公鸡冠质量的25％的苹果酸钠，以及公鸡冠质量的15％的过氧化氢酶，搅拌2h，然后过滤，对过滤液进行加热35min，温度设定为110℃，再冷却至室温，使用质量分数为35％的盐酸溶液调节pH为7.0；将所得的滤液放入容器中，向其中加入牛肉羹，其加入体积为滤液体积的1.5倍，搅拌均匀，制得发酵营养液；在发酵罐底部铺设厚5cm改性小麦秸秆，向其中加入发酵营养液，加入量为发酵罐内部体积的15％，然后接种酿脓链球菌，接种量为15％，发酵4天，温度设定为35℃；待发酵结束后，将发酵液与改性小麦秸秆搅拌50min，然后静置过滤；将上述的过滤物放入容器中，向其中加入乙醇完全淹没过滤物，搅拌5h，过滤，向滤液中加入十六烷基三甲基氯化铵，直至无沉淀物产生，把所得沉淀用水清洗，沉淀加入到质量分数为45％的氯化钠溶液完全浸泡，搅拌40min，然后过滤，再将过滤液进行喷雾干燥，即可得透明质酸。

所述的改性小麦秸秆的制备方法为：

首先取2kg的小麦秸秆放入切割机中，切割成5cm小麦秸秆，将其放入干燥炉中干燥40min，温度设定为110℃，然后放入挤压机中挤压成块状；将挤压成块状的小麦秸秆放入炭化炉中，以5℃/min的升温速度升温至300℃，保持温度2h，然后将炭化后的小麦秸秆取出，冷却至35℃，放入粉碎机中粉碎成90目颗粒；将颗粒物放入容器中，向其中加入质量分数为45％的氯化铝溶液，淹没颗粒物，再向其中加入氨水，氯化铝与氨水的摩尔比为1:3，搅拌35min，温度设定为50℃，然后过滤，将过滤放入烘箱中2h，温度设定为150℃，再将其取出，冷却至室温，即可。

本发明的应用方法：将本发明制成透明质酸用分光光度法进行含量测定为96%，用特细黏度法测得分子量为2×10⁶，将其应用在化妆品的柔肤水中，可以紧致肌肤，保湿时间10～12h。