红木中交趾黄檀DNA鉴定的方法及专用引物和探针

摘要

本发明公开了一种红木中交趾黄檀DNA鉴定的方法及专用引物和探针。本发明公开了交趾黄檀DNA鉴定的专用引物、探针和方法，所述引物和探针具有交趾黄檀的专属特异性，所述方法为荧光定量PCR。本发明一方面检测样本量少，不会破坏木材及其木材成品本身的结构形态。另一发面以木材特有的DNA信息为依据，能快速、准确、客观地获得交趾黄檀的种属鉴定结果，避免了传统鉴定方法必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构基础上的缺陷，因此具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体地说涉及对交趾黄檀的DNA鉴定方法及其专用的引物和探针。

背景技术

《红木国家标准》自2000年颁布实施，《红木国家标准》中把“红木”范围的树种列为“五属八类”。这“五属八类”中共包括了33种木材。5属：即紫檀属、黄檀属、柿属、豆属及铁刀木属。8类：则是以木材的商品名来命名的，即紫檀木类、花梨木类、香枝木类、黑酸枝类、红酸枝木类、乌木类、条纹乌木类和鸡翅木类。

交趾黄檀（Dalbergiacochinchinensis），俗称“大红酸枝”，属于红木国标中豆科家族的黄檀属、黑酸枝类。产于东南亚地区，包括柬埔寨各地，老挝中部和南部，泰国东北部、东部和中部，越南广平省以南地区。红木行业通常指的大红酸枝一般即指老挝大红酸枝即交趾黄檀，是公认的最好酸枝木，俗称老红木。

传统的红木鉴定识别方法是利用人工经验进行识别，主要通过对木材截面进行人工观察的方式完成。对交趾黄檀的鉴定目前采用的也是传统的红木鉴定方法。所谓的传统鉴定方法主要依赖宏观识别，而微观识别则需要使用光学显微镜观察其内部的解剖结构特征，也就是观察构成木材的各类细胞与组织的形态及排列特征，该方法涉及的识别特征较多，鉴定相对准确，但对于鉴定工作者的要求很高，要对此做出准确的鉴定，必须具有丰富的实践经验。近年来研究工作者开发了基于数字图像处理的木材图像识别技术，大大提高了木材识别的准确性,推动了木材识别技术的发展。但是，无论是基于识别者经验的传统识别技术还是基于计算机图像检索的识别技术，都没有脱离木材本身的形态结构及特征，鉴定识别工作都必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构的基础上，这就为木材识别工作带来了一定的局限性，同时，相近种属木材易出现材质结构的相似，为木材识别的准确性带来困难。

若能建立起以红木木材基因多样性的分子鉴定技术，一方面可以杜绝红木制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范红木市场；另一方面，为检验检疫、农林、工商的快速筛查和鉴定提供技术方法，促进物种资源的保护和利用，提高进出口的检验检疫的准确性。

然而，目前对交趾黄檀的鉴定依然采用传统的木材鉴定手段，即解剖切片观察木材的构造以及形态特征从而得出判定结果。因此建立起交趾黄檀的分子鉴定方法，实现交趾黄檀的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明提供一种交趾黄檀DNA鉴定的专用引物和探针，所述引物和探针序列包括：

JZHTPrimer-F：5'-CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT-3'

JZHTPrimer-R：5'-CGAATCCACCACGAACCC-3'

JZHTPrimerProbe：5'-VIC-CAACCCGTGCGCCT-MGB-3'。

进一步地，所述引物和探针的PCR反应条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。

进一步地，所述引物和探针的使用浓度比为：JZHTPrimer-F:JZHTPrimer-R:JZHTPrimerProbe=1:1:2。

本发明还提供了一种交趾黄檀DNA鉴定的方法，包括如下步骤：

（1）木材样本的预处理；

（2）提取经（1）处理后的木材样本中的DNA；

（3）利用引物JZHTPrimer-F和JZHTPrimer-R，以及探针JZHTPrimerProbe对（2）中提取的DNA进行荧光PCR扩增；

（4）木材种类的确定；

所述引物和探针序列包括：

JZHTPrimer-F：5'-CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT-3'

JZHTPrimer-R：5'-CGAATCCACCACGAACCC-3'

JZHTPrimerProbe：5'-VIC-CAACCCGTGCGCCT-MGB-3'。

进一步地，所述的荧光PCR扩增条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：本发明通过一对特异性扩增引物及MGB探针对目的基因进行扩增，条件依赖少，一般的PCR实验室设备即可满足，对结果的分析非常直观，不用比对复杂的测序图谱，直接根据扩增曲线即可做出分析该位点基因型。实时荧光定量PCR技术(realtimequantitativePCR，RQ-PCR)具有较高的灵敏度和特异性，而且能对扩增产物进行实时检测。该法综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，易于统一标准。

本发明在对交趾黄檀大量基因信息进行分析比较的基础上，通过采用荧光定量PCR技术实现对交趾黄檀分子水平上的条形码鉴定。并根据序列位点多态性，设计交趾黄檀种属特异引物和探针，建立了交趾黄檀特异性的荧光定量PCR鉴定检测方法。本发明并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过木材特有的DNA信息做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在木材有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本发明很好地满足各相关部门对交趾黄檀快速筛查和鉴定的要求，能有效杜绝交趾黄檀制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范市场，促进物种资源的保护和利用具有重要的意义。

附图说明

图1是红木中交趾黄檀和15个对照组树种DNA提取效果。

图2是本发明方法特异性实验结果。

图3是本发明方法灵敏度实验结果。

图4是取自针对经不同处理方式得到的木材样本的检测结果。

图5是取自木材不同部位的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。

实施例1检测交趾黄檀的引物、探针和检测试剂盒

利用NCBI等资源信息，找出交趾黄檀与其他木材的基因差异位点，筛选出一对特异性扩增引物对（JZHTPrimer-F和JZHTPrimer-R），并在该引物对的扩增区域设定了一条特异性的探针（JZHTPrimerProbe）。所述扩增引物对和探针序列分别是：

JZHTPrimer-F：5'-CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT-3'

JZHTPrimer-R：5'-CGAATCCACCACGAACCC-3'

JZHTPrimerProbe：5'-VIC-CAACCCGTGCGCCT-MGB-3'。

一种检测交趾黄檀的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。

其中所述qPCR扩增反应体系为：20μl的体系包括：

SYBRPrmixTaqⅡ（2×）10μl

ROXReferanceDyeⅡ（50×）0.4μl

JZHTPrimerProbe0.4μl

JZHTPrimer-F（20μM）0.2μl

JZHTPrimer-R（20μM）0.2μl

DNA样品模板8.8μl

其中所述引物和探针序列分别为：

JZHTPrimer-F：5'-CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT-3'

JZHTPrimer-R：5'-CGAATCCACCACGAACCC-3'

JZHTPrimerProbe：5'-VIC-CAACCCGTGCGCCT-MGB-3'。

阳性对照品：含有本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。

阴性对照品：不含本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。

空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质的ddH₂O。

实施例2：实时荧光PCR的鉴定方法

（1）木材样本的预处理：

用75%的乙醇对木材表面进行彻底的消毒，经无菌水冲洗并用擦干木材。切除待测木材表面部分以避免其他职务组织的污染。取一定量的木材样本，在预冷的研钵中加入液氮和石英砂研磨成粉末备用。当不立即使用时，样品DNA溶液在-20℃下保存待用。

（2）木材样本DNA提取：

采用植物基因组提取试剂盒（PlantGenomicDNAKit，TIANGEN）提取步骤（1）中预处理的木材总DNA，置于-40℃冰箱中备用。

（3）实时荧光PCR扩增：

将步骤（2）中提取的DNA进行qPCR检测。其中扩增条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。本实施例所述qPCR扩增是在ABI公司的ABI7500RealTimePCRSystem完成。也可以在其他的扩增仪器上完成。

JZHTPrimer-F：5'-CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT-3'

JZHTPrimer-R：5'-CGAATCCACCACGAACCC-3'

JZHTPrimerProbe：5'-VIC-CAACCCGTGCGCCT-MGB-3'。

（4）确定木材种类

根据荧光PCR扩增结果确定木材样品的种类。

实施例3：DNA提取与检测

分别提取交趾黄檀（实验组1）、对照组：刀状黑黄檀、黑黄檀、阔叶黄檀、东非黑黄檀、巴西黑黄檀、亚马孙黄檀、伯利兹黄檀、卢氏黑黄檀、巴里黄檀、赛川黄檀、降香黄檀、绒毛黄檀、中美洲黄檀、奥氏黄檀、微凹黄檀，总共15个对照的基因组DNA作为模板，利用植物內源基因tRNALeu及实施例1的反应体系和实施例2所述的检测方法，对提取的DNA进行检测。

tRNALeu的引物和探针序列分别为（标准）：

tRNALeu-F：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'

tRNALeu-R：5'-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'

tRNALeuProbe：5'-FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRA-3'

如图1表明实施例3中实验组和对照组样本的DNA均已经被成功提取。

其中，各树种的拉丁名称分别为：降香黄檀D.odorifera，刀状黑黄檀D.cultrate，黑黄檀D.fusca，阔叶黄檀D.latifolia，卢氏黑黄檀D.louvelii，东非黑黄檀D.melanoxylon，巴西黑黄檀D.nigra，亚马孙黄檀D.spruceana，伯利兹黄檀D.stevensonii，巴里黄檀D.bariensis，赛州黄檀D.cearensis，绒毛黄檀D.frulescens，中美洲黄檀D.granadillo，奥氏黄檀D.oliveri，微凹黄檀D.Retusa，交趾黄檀D.cochinchinensis。

实施例4：荧光PCR扩增的特异性

以实施例3提取DNA作为模版，实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法，进行交趾黄檀荧光PCR检测的特异性实验。

如图2所示实验结果表明，本发明所述的引物、探针和方法能扩增出交趾黄檀。而同属的刀状黑黄檀、黑黄檀、阔叶黄檀、东非黑黄檀、巴西黑黄檀、亚马孙黄檀、伯利兹黄檀、卢氏黑黄檀、巴里黄檀、赛川黄檀、降香黄檀、绒毛黄檀、中美洲黄檀、奥氏黄檀、微凹黄檀均为阴性，均不能被扩增。因此本发明所述引物、探针和方法能够检测出交趾黄檀，检测特异性好。

另外，将本实施例实验组和对照组的完整木材用传统的鉴定方法作进一步确认实验。结果表明，利用本发明所述分子鉴定方法确认的结果准确。由此可见，本发明具有很好的特异性。

实施例5：荧光PCR扩增的灵敏度

以同一根干燥的交趾黄檀木材为材料，烘干至恒重，然后分别以0.1g、0.5g、1.0g和2.0g取样，利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。

图3所示，随着样品量的增加，对应qPCR的Ct值成比例下降，样品取样量与结果对应性强。实验结果表明，利用本发明所述的引物和探针，可以检测出样品量仅为0.1g的DNA信息。

由于本发明所述分子鉴定方法只需要极少量的木材样本就可完成检测，它并不依赖于木材的形态结构是否完整。因此本发明不仅可以对形态完整的交趾黄檀进行鉴定，还可以对看不出原始形态的交趾黄檀加工成品或半成品等进行鉴定。例如能对以交趾黄檀为原材料的红木家具成品进行客观地鉴定，且对家具本身并没有造成破坏，家具依然保持原先的设计状态。

实施例6：检测经不同处理方式得到的木材样本

选用的木材样本分别来自：利用25℃和65℃三种温度干燥的木材；潮湿木材，即受潮的木材；分别采用挤压、熏蒸或气干处理的木材。利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。如图4所示的实验结果表明本发明所述的引物和探针，可以准确地分析出利用不同方法处理后的交趾黄檀的DNA情况。其中图中的A、B、C、D分别表示A：干燥木材；B：潮湿木材；C：挤压木材；D：熏蒸木材；E：气干木材。

实施例7：木材不同部位的鉴定实验

分别取交趾黄檀的边材与心材，按实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。如图5所示实验结果表明：本发明所述方法可以以不同部位的材质作为检测的样品，且检测结果准确。因此，无论以交趾黄檀的哪个部位作为红木制品的原材料，本发明所述方法都适用。

进一步说明：边材1（Sapwood1）外围部分，边材2（Sapwood2）表示边材内部靠近心材的部分；心材1（Heartwood1）和心材2（Heartwood2）表示心材的最中心部分。边材：树木次生木质部的外围活层，位于树干的外围部分，细胞中水分较心材多，色浅，较软，无心材中常见深色沉积物质。心材：多年生的树木其近中心部分的木材，不含生活细胞，其贮藏物质已不存在或转化为心材物质，色深，材质较硬且致密，含水量少，无输导输液与贮藏营养物质的功能，主要对整株植物起支持作用。商业上心材通常指树心部分有显著材色者。

SEQUENCELISTING

<110>浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>红木中交趾黄檀DNA鉴定的方法及专用引物和探针

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<212>DNA

<213>人工序列

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catcgagtctttgaacgcaagt22

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<212>DNA

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gcaatcctgagccaaatcc19