一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量的方法及其应用。本发明提供的一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量性状的方法，包括如下步骤：检测待测大豆基因组中基于Map-6064SNP位点的基因型，如果为TT纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有低棕榈酸含量性状的大豆籽粒，如果为CC纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有高棕榈酸含量性状的大豆籽粒；所述高棕榈酸含量指的是棕榈酸含量为12.3％以上；所述低棕榈酸含量指的是棕榈酸含量小于12.3％。实验证明，本发明所提供的一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量性状的方法可以用于鉴定或辅助鉴定待测大豆品种中棕榈酸含量的高低。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量 的方法及其应用。

背景技术

大豆(Glycinemax)是世界上重要的油料粮食作物，其种子油是人类与动物营养 以及食品加工业植物食用油的重要来源。大豆油用量占全世界食用油的31％(Kimand Krishnan，2004)。大豆种子油主要是由甘油和脂肪酸组成的，其中脂肪酸占种子油的 90％以上，主要包括棕榈酸(16:0)与硬脂酸(18:0)两种饱和脂肪酸和油酸(18:1)、 亚油酸(18:2)与亚麻酸(18:3)等三种不饱和脂肪酸。脂肪酸的组成及其种类配比决 定了种子油的品质。棕榈酸是饱和脂肪酸，不易消化吸收，人类过度食用，会造成肥 胖和心血管疾病，降低大豆棕榈酸含量可以增加大豆的营养价值。

由于棕榈酸含量是受多基因控制的数量性状且易受环境影响，利用传统表型鉴定 和育种方法培育低棕榈酸含量的品种不但需要花费很长的时间，而且难于成功，已经 不能够满足当前优质大豆育种的发展。随着分子标记的开发和使用，分子标记辅助选 择(Molecularmarker-assistedselection，MAS)成为可以节约人力、物力和加速育 种进程的有效方法(Creganetal.1999)。分子标记辅助选择的最大优点为在不需要 评估表型特征的情况下，通过确认是否带有目标基因而鉴定出低棕榈酸含量的植株。

大豆种质资源中蕴藏着丰富的基因，从育种的物质基础—种质资源中发掘所需要 的优异资源及基因可有效促进大豆品种改良。作为栽培大豆起源地，我国的大豆种质 资源在世界上最为丰富，现保存在国家种质资源库的就有3万余份，在棕榈酸含量上 变异广泛(刘兴媛等，作物品种资源，1998)。为了有效的研究和利用我国大豆资源， 邱丽娟等(作物学报，2009)构建了可代表我国大豆种质资源多样性的核心种质，为 深入发掘种质资源中蕴藏的优异基因、有效拓宽大豆遗传基础奠定了材料基础。

关联分析，又称关联作图(AssociationMapping)，是一种以LD(Linkage Disequlibrium)分析为基础，直接对基因型变异和表型变异进行分析，从而把那些与 性状有关联的基因鉴定出来(Khushetal.2001)的基因定位方法，已成为发掘与表 型相关分子标记的强有力工具。新型分子标记—SNP因为具有在基因组中数量多、分 布广泛、可高通量检测等优点而在近年广泛用于鉴定多基因控制的复杂性状。随着SNP 标记数量的不断增多，高通量的SNP分型平台相继推出，包括GoladenGate和 BeadArray(Illumina)，GenomeLabSNPstream(Beckman)和MegAllele(Affymetrix) 等，其中Illumina公司的BeadArray芯片鉴定技术具有高效、高通量、成本低、准确 性好等优点，适合位点数从几十到几千的中等通量基因分型研究，实验成功率>99％， 是理想的中高通量基因分型检测的解决方案，目前已被广泛用于人类、拟南芥、水稻 等物种的SNP分型。

发明内容

本发明的目的是鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量性状，和/或，筛选或辅助 筛选具有不同棕榈酸含量的大豆籽粒。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸 含量性状的方法，可包括如下步骤：检测待测大豆基因组中基于Map-6064SNP位点的 基因型，如果为TT纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有低棕榈酸含量性状的大豆 籽粒，如果为CC纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有高棕榈酸含量性状的大豆籽 粒。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种筛选或辅助筛选具有不同棕榈酸含 量的大豆籽粒的方法，可包括如下步骤：检测待测大豆基因组中基于Map-6064SNP位 点的基因型，如果为TT纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有低棕榈酸含量性状的 大豆籽粒，如果为CC纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有高棕榈酸含量性状的大 豆籽粒。

上述方法中，所述Map-6064位点的所在基因为大豆基因组第5条染色体的 Glyma.05g015400基因；所述Glyma.05g015400基因的核苷酸序列为序列表的序列1； 所述Map-6064位点为序列表中序列1的第891位。

上述方法中，所述低棕榈酸含量指的是棕榈酸含量小于12.3％；所述高棕榈酸 含量指的是棕榈酸含量可为12.3％以上。

上述方法中，所述检测待测大豆基因组中基于Map-6064SNP位点的基因型的方法 可包括：(1)提取大豆基因组DNA。(2)加入Map-6064探针组，进行等位基因特异性 延伸和连接酶连接，可以得到一段包含Map-6064SNP位点和地址序列的片段。(3)将 得到的片段进行PCR扩增(扩增体系中具有Cy3标记的dATP、Cy5标记的dGTP、dCTP 和dTTP)后与芯片(美国Illumina公司产品，芯片上具有微珠，微珠表面连接有所 述地址序列的互补序列)进行杂交。(4)芯片扫描，利用软件根据两种荧光颜色判 读并输出分型结果。从而确定待测大豆品种基于Map-6064SNP位点基因型为CC纯合 型或TT纯合型。

本发明还提供了一种产品。

本发明所提供的产品，可为检测大豆基因组中基于Map-6064SNP位点的多态性或 基因型的物质；所述产品的功能为如下(a)、(b)或(c)：

(a)鉴定或辅助鉴定大豆籽粒的棕榈酸含量性状；

(b)鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量性状相关的单核苷酸多态性；

(c)筛选或辅助筛选具有不同棕榈酸含量的大豆籽粒。

上述产品中，所述大豆基因组中基于Map-6064SNP位点的基因型可为TT纯合型 或CC纯合型。

上述产品中，所述Map-6064位点的所在基因为大豆基因组第5条染色体的 Glyma.05g015400基因；所述Glyma.05g015400基因的核苷酸序列为序列表的序列1； 所述Map-6064位点为序列表中序列1的第891位。

上述产品中，所述检测大豆基因组中基于Map-6064SNP位点的多态性或基因型的 物质可包括Map-6064SNP探针组。

上述产品中，所述棕榈酸含量为高棕榈酸含量或低棕榈酸含量；所述高棕榈酸 含量指的是棕榈酸含量可为12.3％以上；所述低棕榈酸含量指的是棕榈酸含量小于 12.3％。

检测大豆基因组中基于Map-6064SNP位点的多态性或基因型的物质在下述(1)- (6)中的任一应用也属于本发明的保护范围：

(1)鉴定或辅助鉴定大豆籽粒的棕榈酸含量性状；

(2)制备鉴定或辅助鉴定大豆籽粒的棕榈酸含量性状的产品；

(3)鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量性状相关的单核苷酸多态性；

(4)制备鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量性状相关的单核苷酸多态性的产 品；

(5)筛选或辅助筛选具有不同棕榈酸含量的大豆籽粒；

(6)制备筛选或辅助筛选具有不同棕榈酸含量的大豆籽粒的产品。

上述应用中，所述(1)和/或所述(2)中，所述大豆籽粒的棕榈酸含量性状可 为高棕榈酸含量性状或低棕榈酸含量性状。所述高棕榈酸含量指的是棕榈酸含量可 为12.3％以上；所述低棕榈酸含量指的是棕榈酸含量小于12.3％。

上述应用中，所述(3)和/或所述(4)中，所述大豆籽粒的棕榈酸含量性状可 为高棕榈酸含量性状或低棕榈酸含量性状。所述高棕榈酸含量指的是棕榈酸含量可 为12.3％以上；所述低棕榈酸含量指的是棕榈酸含量小于12.3％。

上述应用中，所述(5)和/或所述(6)中，所述具有不同棕榈酸含量的大豆 籽粒可为具有高棕榈酸含量性状的大豆籽粒或具有低棕榈酸含量性状的大豆籽粒。 所述高棕榈酸含量指的是棕榈酸含量可为12.3％以上；所述低棕榈酸含量指的是棕 榈酸含量小于12.3％。

上述应用中，所述大豆基因组中基于Map-6064SNP位点的基因型可为TT纯合型 或CC纯合型。

上述应用中，所述Map-6064位点的所在基因为大豆基因组第5条染色体的 Glyma.05g015400基因；所述Glyma.05g015400基因的核苷酸序列为序列表的序列1； 所述Map-6064位点为序列表中序列1的第891位。

上述应用中，所述用于检测大豆基因组中基于Map-6064SNP位点的多态性或基因 型的物质可包括Map-6064SNP探针组。

上述任一所述Map-6064SNP探针组可由探针1、探针2和探针3组成：

所述探针1为单链DNA分子，探针1的序列如序列表中序列2中的核苷酸所示。

所述探针2为单链DNA分子，探针2的序列如序列表中序列3中的核苷酸所示。

所述探针3为单链DNA分子，探针3的序列如序列表中序列4中的核苷酸所示。

本发明中，所述低棕榈酸含量指的是棕榈酸含量小于12.3％；所述高棕榈酸含 量指的是棕榈酸含量可为12.3％以上。

实验证明，本发明所提供的一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量性状的方 法可以用于鉴定或辅助鉴定待测大豆品种中大豆籽粒棕榈酸含量的高低。所述高棕 榈酸含量指的是棕榈酸含量为12.3％以上；所述低棕榈酸含量指的是棕榈酸含量小 于12.3％。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述40个南方大豆品种和60个北方大豆品种记载在如下文献中： 王国勋.中国大豆品种资源目录.北京：中国农业出版社，1982；常汝镇，孙建英. 中国大豆品种资源目录：续编一.北京：农业出版社，1991；常汝镇，孙建英，邱 丽娟，陈一舞.中国大豆品种资源目录：续编二.北京：中国农业出版社，1996。

下述实施例中，所述低棕榈酸含量指的是棕榈酸含量小于12.3％；所述高棕榈 酸含量指的是棕榈酸含量可为12.3％以上。

实施例1、Map-6064SNP位点是与大豆籽粒棕榈酸含量相关的单核苷酸多态性

一、Map-6064单核苷酸多态性位点基本信息

Map-6064单核苷酸多态性位点位于Glyma.05G015400基因核苷酸序列(序列1) 第891位，其基本信息见表1。

表1、Map-6064SNP单核苷酸多态性位点基本信息

二、Map-6064SNP基因型与大豆籽粒棕榈酸含量的关联分析

1、Map-6064SNP探针组的制备

根据自主开发的全基因组SNP数据集，筛选Map-6064SNP位点并人工合成 Map-6064SNP探针组：

探针1：ACTTCGTCAGTAACGGACGCTGCATACAATGATTGGTTCATGTCA(序列表中的序列2)；

探针2：GAGTCGAGGTCATATCGTGCTGCATACAATGATTGGTTCATGTCG(序列表中的序列3)；

探针3：

TGTACAATGTATTCTTCACTTCACTAGATCGGTTACTTCTGGTCAGGTGGTCTGCCTATAGTGAGTC(序列表 中的序列4)。

芯片的微珠上连接有地址序列的互补序列。

2、基于Map-6064SNP位点基因分型方法的建立

利用Illumina的SNP检测平台对表2中所示的40个南方大豆品种和表3中所示 的60个北方大豆品种基于Map-6064SNP位点的基因型进行检测。

检测对象为基因组DNA。以基因组DNA为模板，加入步骤1制备的探针1、探针2 和探针3，进行等位基因特异性延伸和连接酶连接，可以得到一段包含Map-6064SNP 位点和地址序列的片段。将得到的片段进行PCR扩增(扩增体系中具有Cy3标记的 dATP、Cy5标记的dGTP、dCTP和dTTP)后与芯片(美国Illumina公司产品，芯片上 具有微珠，微珠表面连接有所述地址序列的互补序列)进行杂交。然后进行芯片扫描， 利用软件根据两种荧光颜色判读并输出分型结果。确定待测大豆品种基于Map-6064 SNP位点基因型。

结果表明，待测大豆品种基于Map-6064SNP位点基因型为CC纯合型或TT纯合型。

3、Map-6064SNP基因型与大豆籽粒棕榈酸含量的关联分析

(1)检测大豆品种中大豆籽粒的棕榈酸含量

于2010、2011和2012年分别将表2中的40个南方大豆品种和表3中的60个北 方大豆品种在中国农业科学院作物科学研究所海南三亚基地种植。在田间采用完全随 机区组试验设计方案，重复三次。田间种植行宽0.4米，行长1.5米，株间距0.1米。 种子收获后，将同一年份、同一品种的三次重复种子混合，检测大豆籽粒棕榈酸的含 量，然后取同一品种三年检测结果的平均值，得到该品种的棕榈酸含量，结果如表2 和表3所示。检测棕榈酸含量利用HP6890气相色谱仪(GC)(AgilentTechnologies, PaloAlto,CA,USA)进行，具体检测方法参考Yangetal.TheorApplGenet(2010) 120:665–678。

(2)按照步骤2建立的基于Map-6064SNP位点进行基因分型方法，检测表2和 表3中的大豆品种基于Map-6064SNP位点的基因型，结果表2和表3所示。表2为40 个南方大豆品种基于Map-6064SNP位点的基因型，表3为60个北方大豆品种基于 Map-6064SNP位点的基因型。

表2.40个南方大豆品种基于Map-6064SNP位点的基因型

统一编号 品种名称 基于Map-6064SNP位点的基因型 棕榈酸含量(％) ZDD11951 扇子白黄豆 TT 12.4 ZDD12023 迟黄豆1 TT 12.4 ZDD16282 杂豆-6 TT 12.2 ZDD13341 七月黄 TT 12.1 ZDD12400 十月黄 TT 12.1 ZDD12389 乌眼窝 TT 11.8 ZDD05494 洪湖六月爆 TT 11.8 ZDD24189 赣豆5号 TT 11.7 ZDD14782 长沙泥豆 TT 11.7 ZDD14783 矮生泥豆① TT 11.4 ZDD14505 宜章六月黄 TT 10.7 ZDD17457 羊眼豆 CC 13.4 ZDD12845 剑阁化林鸡窝豆 CC 13.4 ZDD12635 资中六月早 CC 13.1 ZDD14190 白秋1号 CC 13.0 ZDD04430 泰兴矮脚红 CC 12.9 ZDD06094 八月白 CC 12.9 ZDD21208 浙春3号 CC 12.9 ZDD11703 曙光黄豆 CC 12.9 ZDD20532 小颗黄豆 CC 12.8 ZDD06528 黄毛豆 CC 12.8 ZDD12655 眉山六月爆 CC 12.8 ZDD22145 大黄豆-2 CC 12.8 ZDD12331 小白毛 CC 12.8 ZDD14252 丰城早乌豆 CC 12.8 ZDD12527 郫县小黄豆 CC 12.8 ZDD06454 横峰乌豆 CC 12.7 ZDD21030 彭山黄壳子-3 CC 12.7 ZDD12386 大华豆 CC 12.7 ZDD20652 8307-8-1 CC 12.6 ZDD20671 贡豆7号 CC 12.6 ZDD16743 廉江坡黄豆 CC 12.6 ZDD20676 六月黄 CC 12.6 ZDD14240 都昌乌豆 CC 12.6

ZDD16838 保亭大黑豆 CC 12.6 ZDD14125 莆豆451 CC 12.5 ZDD06515 湘豆4号 CC 12.5 ZDD06361 达浦豆 CC 12.5 ZDD05979 五月白 CC 12.5 ZDD11575 花色豆 CC 12.5

表3.60个北方大豆品种基于Map-6064SNP位点的基因型

统一编号 品种名称 基于Map-6064SNP位点的基因型 棕榈酸含量(％) ZDD18845 晋豆13号 TT 12.1 WDD00528 Amsoy TT 12.0 ZDD07391 盘石豆 TT 12.0 WDD01069 Biaoge du lot et gerome TT 12.0 WDD01307 Flora TT 12.0 ZDD07409 和龙油太 TT 12.0 WDD00167 Harosoy TT 12.0 ZDD01982 天鹅蛋 TT 12.0 ZDD08690 小黄豆 TT 11.9 ZDD07370 怀德白花大粒 TT 11.9 ZDD01169 牛毛黄 TT 11.9 WDD01451 Nova TT 11.9 WDD00001 Clark TT 11.8 ZDD23820 辽豆14 TT 11.8 WDD01174 Salut 216 TT 11.8 ZDD18928 汾豆31号 TT 11.8 ZDD22659 合丰37 TT 11.8 WDD00626 PI196160 TT 11.8 ZDD00698 茶色豆 TT 11.4 ZDD07809 铁荚青 CC 13.1 ZDD08603 小黄豆 CC 13.1 ZDD00332 漠河秣食豆 CC 13.1 ZDD22649 抗线1号 CC 13.0 WDD01252 十胜长叶 CC 13.0 ZDD22643 东农42 CC 13.0 ZDD00076 绥农1号 CC 12.9 ZDD06836 绥农6号 CC 12.9 WDD01381 Dunajka CC 12.9 WDD01165 Amur 41 CC 12.9 ZDD07218 紫花2号 CC 12.8 ZDD22650 抗线2号 CC 12.7 ZDD00932 大黑脐 CC 12.6 ZDD23684 绥农20 CC 12.6 ZDD01060 黄脐 CC 12.6 heinong47 黑农47 CC 12.6 ZDD23818 辽豆11 CC 12.6 ZDD23857 蒙豆11 CC 12.6 ZDD07244 争光1号 CC 12.6

ZDD00854 锦州4-1 CC 12.6 ZDD07667 熊岳小粒黄-3 CC 12.6 ZDD08650 黄豆＜2＞ CC 12.5 ZDD00046 克北1号 CC 12.5 ZDD18847 晋豆15号 CC 12.5 ZDD01138 小黄豆 CC 12.5 ZDD01629 白脐大豌豆 CC 12.5 ZDD06823 合丰25 CC 12.4 dongnong163 东农163 CC 12.4 ZDD22648 绥农14号 CC 12.4 jilin30 吉林30 CC 12.4 WDD00570 Fayette CC 12.4 ZDD08643 小黄豆 CC 12.3 ZDD00041 黑河一号 CC 12.3 ZDD06819 嫩丰11号 CC 12.3 ZDD22642 黑生101 CC 12.3 ZDD22793 吉林35 CC 12.3 ZDD00718 茶秣食豆 CC 12.3 ZDD06851 东农36号 CC 12.3 WDD00718 Essex CC 12.3 ZDD08705 大黄豆<1> CC 12.3 ZDD23958 邯豆4号 CC 12.2

表2结果显示，40个大豆南方品种中11个品种基于Map-6064SNP位点的基因型 为TT纯合型，这11个品种的大豆南方品种中大豆籽粒的棕榈酸的平均含量为 11.8％；40个大豆南方品种中29个品种基于Map-6064SNP位点的基因型为CC纯合型， 这29个品种的大豆南方品种中大豆籽粒的棕榈酸的平均含量为12.8％。显著性检验 P<0.01。表3结果显示，60个大豆北方品种中19个品种基于Map-6064SNP位点的 基因型为TT纯合型，这19个品种的大豆北方品种中大豆籽粒的棕榈酸的平均含量 为11.9％；60个大豆北方品种中41个品种基于Map-6064SNP位点的基因型为CC纯 合型，这41个品种的大豆北方品种中大豆籽粒的棕榈酸的平均含量为12.6％。显著 性检验P<0.01。

统计结果表明，基于Map-6064SNP位点的基因型为TT纯合型的11个大豆南方品种 和19个大豆北方品种中，90％大豆籽粒的棕榈酸含量小于12.3％；基于Map-6064SNP位 点的基因型为CC纯合型的29个大豆南方品种和41个大豆北方品种中，99％大豆籽粒的 棕榈酸含量为12.3％以上。

实验证明，步骤2建立的基于Map-6064SNP位点进行基因分型方法可以用于鉴定待 测大豆品种中大豆籽粒棕榈酸含量的高低：检测待测大豆基于Map-6064SNP位点的基 因型，如果待测大豆基因组中基于Map-6064SNP位点的基因型为TT纯合型、待测大豆 籽粒为候选的具有低棕榈酸含量性状的大豆籽粒，如果待测大豆基因组中基于 Map-6064SNP位点的基因型为CC纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有高棕榈酸含量性 状的大豆籽粒。所述高棕榈酸含量指的是棕榈酸含量为12.3％以上；所述低棕榈酸 含量指的是棕榈酸含量小于12.3％。