正调控花色苷合成的MYB转录因子的cDNA序列

摘要

本发明首次从红花香雪兰花瓣中克隆得到两条正调控花色苷合成的MYB转录因子(FhPAP1L1和FhPAP1L2)的cDNA序列，并推测得到了其编码的氨基序列。在拟南芥和烟草中过量表达FhPAP1L1和FhPAP1L2可以明显地增强植物组织的着色，从而确定其参与正调控植物花色苷合成的功能。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物技术领域，具体涉及红花香雪兰花瓣分离得到的两个具有功能的，与花朵花色苷合成相关的MYB转录因子（FhPAP1L1和FhPAP1L2)的cDNA序列及其氨基酸序列。

背景技术

影响植物颜色的主要有三大类色素：花色苷、类胡萝卜素和甜菜素。人们对于花色苷的研究抱有极大的兴趣，这源于其对植物生理和人类健康起着非常重要的作用。花色苷是由一系列酶催化合成，这些酶则由相对应的结构基因控制，研究表明：这些结构基因的表达由一个复杂转录调控网络调控，其中MYB转录因子是MBW(MYB-bHLH-WDR)转录因子复合物的重要成员，它发挥着特异性调节的作用。植物MYB转录因子家族是一个具有不同调控功能的大家族，它们对于激活特定的下游基因的表达发挥重要作用。根据MYB蛋白保守结构域的不同，MYB可以分为R2R3MYB和R3MYB等。

到目前为止，人们已经在很多植物中克隆得到正调控花色苷合成的R2R3MYB，如金鱼草，拟南芥，甘蓝，辣椒，甜橙，淫羊藿，山竹，龙胆，非洲菊，甘薯，牵牛，苹果，苜蓿，杨梅，烟草，矮牵牛，西洋梨，沙梨，碧桃，番茄，马铃薯和葡萄等,但是这些都属于双子叶植物，在单子叶中只有从百合，蝴蝶兰和玉米中克隆得到了花色苷合成相关的MYB转录因子。本发明中涉及到的FhPAP1L1和FhPAP1L2基因是从单子叶植物香雪兰中克隆得到的，编码与植物花色苷合成相关的MYB转录因子，具体说该基因是正调控植物花色形成的转录因子，能促进花色苷的合成，与花色行成密切相关。

发明内容

本发明首次从红花香雪兰花瓣中克隆得到两条正调控花色苷合成的MYB转录因子(FhPAP1L1和FhPAP1L2)的cDNA序列，并推测得到了其编码的氨基序列。在拟南芥和烟草中过量表达FhPAP1L1和FhPAP1L2可以明显地增强植物组织的着色，从而确定其参与正调控植物花色苷合成的功能。

本发明的主要目的是提供已经得到功能验证的编码FhPAP1L1和FhPAP1L1的cDNA序列和由此推断的氨基酸序列。

本发明的技术方案：

为了从首次从香雪兰中克隆得到FhPAP1L1和FhPAP1L2基因，本发明人首先利用拟南芥中PAP1序列作为诱饵，对实验室已建立的红花香雪兰花朵盛开时期转录组文库进行本地Blast，筛选与拟南芥中同源性较高的序列。分离得到了长度为212bp的FhPAP1L1片段，分析该序列显示：此片段与Toreniafournieri的R2R3MYB同源性最高，达到67%，并且该片段包含ATG起始密码子，随后利用RACE法克隆该基因的3'端序列，得到包含TAA终止密码子的长度为717bp的片段，此片段与Elaeisguineensis的MYB75-like同源性最高，达到47%。将上述两条序列拼接，得到全长cDNA序列，接着利用红花香雪兰花瓣总RNA作为模板，设计引物进行RT-PCR，克隆得到929bp的全长FhPAP1L1基因，该基因开放阅读框架长702bp，编码233个氨基酸，蛋白质的分子量推测是27,023Da，等电点为6.23。序列分析表明：此基因与Elaeisguineensis的MYB75-lke同源性最高，达到52%。另外，我们还分离到了长度为755bp的FhPAP1L2片段，序列分析显示：该片段包含ATG起始密码子和TAA终止密码子。提取红花香雪兰花瓣总RNA作为模板，进行RT-PCR，克隆得到755bp的全长FhPAP1L2基因，开放阅读框架长729bp，编码242个氨基酸，蛋白质的分子量推测是28,076Da，等电点为5.09。序列分析表明：此基因也与Elaeisguineensis的MYB75-like同源性最高，达到53%。

利用Gal4-GUS拟南芥原生质体瞬时转染体系检测了FhPAP1L1和FhPAP1L2的转录活性，结果表明：FhPAP1L1和FhPAP1L2均是转录激活子。

在pZP211双元表达载体中插入克隆得到的的FhPAP1L1和FhPAP1L2基因，并且转入到农杆菌GV3101细胞中，转染拟南芥和烟草。

分别运用蘸花法和叶盘法转染拟南芥和烟草，观察转基因植株表型变化。结果显示：转基因植株花色苷的合成显著增强，说明香雪兰中的FhPAP1L1和FhPAP1L2基因促进了花色苷的合成，初步证明我们克隆得到的基因是香雪兰中正向调控花色苷合成的MYB转录因子。

香雪兰FhPAP1L1和FhPAP1L2基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列信息如下：

其中1：FhPAP1L1基因的全长核苷酸序列（SEQIDNO.1）

ATCCAATATTCCTCCCCCTAATGTCTTATCTTGCATGATTCACAATTATGAAACATCAGTACTGCTCCGAGCTCCGACCTTCGGGCGTTCAGAATCGGAAAGGGGCATGGAACAAAGATGAAGATGAGCTGCTGAGGAAGTGCATTGAAAAGTATGGAATAGGGAAGTGGAGTACAGTTCCCATGAGGGCAGGACTAAGAAGGTGTCGCAAGAGCTGTCGTCTTCGCTGGCTGAACTATCTATCCCCTGACATCAACCGAGGAACCTTTAACGACGACGAAGACGACCTCATCCTTCGGCTTCACAAGCTCTTGGGCAATAGGTGGTCCCTAATTGCAGGCAGAATCCCCGGCAGGACGGCGAACGACATCAAGAACTACTGGAACTCTCACTTGGGCAAGAAAGCAGACACCGAGAGAAGGGTACCAGAGAAGACTGACAAGGCTGAGATTGTAAGGCCACAACCTCAAAGACCGACTTCGACGTGGATTTGGCCGAAGATTAATATTAATCCTCATCAAGAAACTGATCAATTAGGAACATCTGCCGTGGAGCCAAAACTGCCAACAGTCTTAGAGGAGGAAGAAGCATGGCTGAATGCTTTGATCACCGATGATTACAATGAGAATGTGGATGCCGCCTTTTCGGACTTCCATGGCTACGAGATAGGGGGAGGAATATTGGATGACACGCCTTTTTTCGAAGGAGTTACAGGATGGGAGGAACTATACCAGAGAACTGAAAATTAAGTTTAATTTTTCATTGTTCTAACAATACTGATATCTATATATATATTTTTTTTTTCCTTCGAAGATCAAAGATAGAAAGAAATGAGACCAGTTCCCCATTGTTGAAAAATAAAGGAATAAGGTTTATGTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC

其中2：由FhPAP1L1基因核苷酸序列推测得到的蛋白质序列（SEQIDNO.2）

MKHQYCSELRPSGVQNRKGAWNKDEDELLRKCIEKYGIGKWSTVPMRAGLRRCRKSCRLRWLNYLSPDINRGTFNDDEDDLILRLHKLLGNRWSLIAGRIPGRTANDIKNYWNSHLGKKADTERRVPEKTDKAEIVRPQPQRPTSTWIWPKININPHQETDQLGTSAVEPKLPTVLEEEEAWLNALITDDYNENVDAAFSDFHGYEIGGGILDDTPFFEGVTGWEELYQRTEN.

其中3：FhPAP1L2基因的全长核苷酸序列（SEQIDNO.3）

AATGGATCTCAAAGCTTCAGCCCTTCGAAAAGGCGCATGGAGCAAAGAGGAAGACGACCTGCTAAGGAATTGTATCGATAAGTATGGAGAAGGGAAGTGGAGTTCCGTACCCGAACGTGCAGGGCTTAAAAGGTGTCGAAAGAGCTGTCGACTTAGATGGCTGAACTATCTTTCGCCGAAGATCAACCGAGGCAAGTTTTCGGATGACGAGATCGACCTCCTTATCAGGCTTCACAAGCTTCTAGGGAACAGGTGGTCGCTGATCGCGGGCAGAATCCCCGGTAGGACAGCGAACGACATCAAGAATTATTGGAACTCTCACCTGAGCAAGAGAGTGGAAGCAACAAAATGTAGGAGCAAAACTATAGATGCTCAAGTCGCGAGGCCAAATCCTGAGAGAGATTCCGCCAACTGGAGTTGGCCAACAAATATAGGAACAAATTATGGGAACAACTTGGAAGCAGAAGAAACCGAAATGCCGAAACTACGAACAAGTCAAGAGAATCAGGGAGAACGGTCAAATGATTTGATCATGGAGAATGGTTGGGAAGAGTTGATGCTGCATACTTCTGACGTGAGCTTACAGAATTTTCAGATAGACTTCAAGACACCGGAAATGGAGGAACTAACTGAGATGGAGGAACTAACTGAGGAACCAATCTCTCTGGGAGATGAAGGGAATGATTGGACTGCCATGGAAAACTATTTTTTTGATGAGCTCATTAGTTAAGAAAAAAATATATACTAAAATGCGG

其中4：由FhPAP1L2基因核苷酸序列推测得到的蛋白质序列（SEQIDNO.4）

MDLKASALRKGAWSKEEDDLLRNCIDKYGEGKWSSVPERAGLKRCRKSCRLRWLNYLSPKINRGKFSDDEIDLLIRLHKLLGNRWSLIAGRIPGRTANDIKNYWNSHLSKRVEATKCRSKTIDAQVARPNPERDSANWSWPTNIGTNYGNNLEAEETEMPKLRTSQENQGERSNDLIMENGWEELMLHTSDVSLQNFQIDFKTPEMEELTEMEELTEEPISLGDEGNDWTAMENYFFDELIS.

附图说明]

图1FhPAP1L1和FhPAP1L2保守结构域分析；

图2FhPAP1L1和FhPAP1L2系统进化分析；

图3FhPAP1L1和FhPAP1L2的转录激活活性分析；

图4FhPAP1L1转基因拟南芥表型变化；

图5FhPAP1L1转基因烟草表型变化；

图6FhPAP1L2转基因拟南芥表型变化；

图7FhPAP1L2转基因烟草表型变化。

具体实施方式

在下面的具体实施例子中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。

实施例1FhPAP1L1基因全长的克隆

[实施例1-1]目的片段的获得：根据拟南芥PAP1序列，进行本地Blast。筛选与拟南芥PAP1同源性较高的序列，并进行生物信息学分析，获得长度为212bp的片段，并包含起始密码子ATG。

[实施例1-2]FhPAP1L1基因3'序列的获得：根据转录组测序序列，设计特异性上游引物，即5'-GGCAGGACTAAGAAGGTGTCG-3'；根据mRNA保守的polyA结构设计特异的下游引物：5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC-3'。用Trizol试剂盒提取红花香雪兰花朵盛开时期的总RNA，反转录生成cDNA的第一条链，以此作为模板进行RACE，得到的717bp的PCR产物。

[实施例1-3]FhPAP1L1基因全长序列的获得：根据上述测序得到的结果，设计特异的上游引物，即5'-CCTCCCCCTAATGTCTTATCTTG-3'和5'-ATATATAGATATCAGTATTGTTA-3'的下游引物。用Trizol试剂盒提取红花香雪兰花瓣的总RNA，反转录生成cDNA的第一条链，以此作为模板进行RT-PCR，得到FhPAP1L1基因全长序列。

实施例2FhPAP1L2基因全长的克隆

[实施例2-1]目的片段的获得：根据拟南芥PAP1序列，进行本地Blast。筛选与拟南芥PAP1同源性较高的序列，并进行生物信息学分析，获得755bp的FhPAP1L2片段，序列分析显示该片段包含ATG起始密码子和TAA终止密码子。

[实施例2-2]FhPAP1L2基因全长序列的获得：根据转录组测序序列，设计特异性上游引物，即5'-AATGGATCTCAAAGCTTCAG-3'和5'-CCGCATTTTAGTATATATTTTTTT-3'的下游引物。用Trizol试剂盒提取红花香雪兰花朵盛开时期的总RNA，反转录生成cDNA的第一条链，以此作为模板进行RT-PCR，得到的FhPAP1L2的基因全长序列。

实施例3FhPAP1L1和FhPAP1L2的转录活性检测

为了验证FhPAP1L1和FhPAP1L2的转录活性，利用Gal4-GUS为报告基因进行拟南芥原生质体瞬时转染，以GD-VP为阳性对照。分别将FhPAP1L1和FhPAP1L2的开放阅读框与GD（Gal4DNA结合区）融合，35S启动子驱动，克隆到pUC19载体上，构建成带有GD标签的蛋白序列。利用除内毒素质粒大提试剂盒提取质粒DNA，生长约四周的拟南芥叶游离出原生质体，效应基因GD-FhPAP1L1或者GD-FhPAP1L2分别和报告基因Gal4-GUS共转染拟南芥原生质体，室温黑暗孵育20-22h，检测GUS活性。结果表明：FhPAP1L1和FhPAP1L2均是转录激活子。

实施例4FhPAP1L1和FhPAP1L2基因在拟南芥和烟草中的表达

为了验证FhPAP1L1和FhPAP1L2蛋白功能，利用克隆得到的全长FhPAP1L1和FhPAP1L2基因作为模板，分别利用带有NdeI和ClaI酶切位点的引物进行PCR扩增。然后利用NdeI和ClaI两种限制性内切酶消化上述扩增得到的DNA片段，并将其克隆进到改良过的质粒pUC19上，再经EcoRⅠ单酶切后构建到质粒pZP211上。这样构建的重组质粒分别命名为pZP211-FhPAP1L1和pZP211-FhPAP1L2，并导入农杆菌GV3101细胞中。

培养所述的转化体，分别用蘸花法和叶盘法转化拟南芥Col和烟草K326。经Kan筛选转基因植株，并观察表型变化。

SEQUENCELISTING

<110>东北师范大学

东北师范大学,高翔

<120>两种正调控香雪兰花朵花色苷合成的MYB转录因子的cDNA序列

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<140>-

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SEQUENCELISTING

<110>东北师范大学

东北师范大学,高翔

<120>两种正调控香雪兰花朵花色苷合成的MYB转录因子的cDNA序列

<130>-

<140>-

<141>2015-04-29

<160>2

<170>PatentInversion3.3

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<213>Freesiaalba

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<221>5'UTR

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<221>3'UTR

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