与小麦叶片叶绿素含量和粒重相关的基因、其Indel标记及应用

摘要

本发明涉及与小麦叶片叶绿素含量和粒重相关的基因TaBAS1-2B及其Indel标记。本发明首次从小麦中分离克隆到与小麦叶片叶绿素含量和粒重相关的基因TaBAS1-2B，并根据所克隆的TaBAS1-2B基因序列，在‘京411’和‘红芒春21’两个品种间开发出具有多态性的Indel标记，并在194份小麦自然品种中分析其对表型的作用，最终开发出与基因TaBAS1-2B共分离的，且与小麦叶片叶绿素含量和粒重紧密相关的功能标记。该Indel标记能够分别解释小麦花后旗叶叶绿素含量及千粒重表型变异的8.2％和4.4％，其中，分子量大小为494bp(Seq？ID？No.3)的条带对粒重的增加具有增效作用，分子量大小为493bp(Seq？ID？No.4)的条带对粒重的降低具有增效作用。该分子标记的开发为高产小麦分子辅助育种提供了一条可行的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及与小麦叶片叶绿素含量和粒重相关的基因、其Indel标记及应用。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，随着人口的增长，耕地面积的减少以及粮食生产成本的不断提高，高产、超高产育种成为我国小麦育种中亟待解决的问题。小麦生长过程是不断通过光合作用进行物质生产的过程，而绿色叶片是物质生产的主要来源。在适宜的条件下，小麦灌浆期间籽粒产量的大约70-90％来源于花后旗叶制造的光合产物(Austin等,1997；Bidinger等,1997)。因而，延长小麦旗叶功能期，促进叶片制造更多的光合产物，从而提高产量是小麦高产的基础。

在高等植物中，叶绿素是叶绿体中重要的光合色素，在吸收和光能的使用中起着重要的作用。有研究表明，灌浆期叶片叶绿素含量的下降显著影响着植物的光合速率，从而直接导致光合效率的下降(Araus等，1997)。Wang等(2008)在其研究中指出，增加叶绿素含量是提高植物生物产量和粒重的一个有效途径。

在受到生物和非生物胁迫后，植物体内的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)含量将会增加，对细胞造成毒害，导致叶绿体损伤，从而造成光合速率的下降，最终影响到粒重和产量。植物在进化过程中形成了较完善的ROS清除酶系统，其中过氧化物还原酶(peroxiredoxin，Prx)在保护叶绿体及其它细胞器免受氧化伤害中起到重要作用。植物过氧化物还原蛋白BAS1是一个由核基因编码的叶绿体蛋白，属于AhpC家族。该蛋白是巯基依赖的过氧化物酶，通过催化的Cys残基还原过氧化氢，依赖NADPH的叶绿体硫氧还蛋白还原酶保持BAS1的还原态。Ruiz等(2006)在水稻中证实了NTRC-BAS1通路是一种高效的用于叶绿体免受氧化损伤的氧化还原系统。

尽管目前在植物中对于过氧化物还原蛋白的结构与功能的研究较多，但其在植物体内的具体作用机制仍不完全清楚。小麦中关于Prx的研究报道较为少见，目前尚未发现小麦BAS1基因的相关研究报道。关于BAS1基因的表达是否会影响叶片叶绿素的含量，以及与粒重是否相关尚不明晰。因而，研究过氧化物还原酶基因BAS1为进一步了解ROS清除酶系统的作用机制提供了依据，同时对于研究其在提高小麦产量和粒重中发挥的作用也具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供与小麦叶片叶绿素含量和粒重相关的基因TaBAS1-2B。

本发明的另一目的是提供与小麦基因TaBAS1-2B共分离的Indel标记及应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的与小麦叶片叶绿素含量和粒重相关的基因TaBAS1-2B是通过电子克隆结合常规PCR方法获得的。根据NCBI上公布的小麦硫氧还蛋白过氧化物酶(Thiol-specificantioxidantprotein)的CDS序列(GenBank：AB000405.1)搜索小麦EST数据库，将筛选到的EST序列(CA484935.1，CK214438.1，CK217637.1)进行电子拼接，以拼接序列为模板，利用PrimerPremier5.0软件设计三对引物B1、B2和B3用于小麦BAS1基因cDNA的获得，另外两对引物G1和G2用于小麦BAS1基因的获得(引物信息见表1)。

表1用于扩增小麦TaBAS1-2B基因及其cDNA序列的引物

PCR反应分别以小麦品种‘京411’的cDNA和基因组DNA为模板，然后将利用引物B1、B2和B3扩增得到的产物依次经过酶切连接，最终得到小麦BAS1基因的cDNA序列，大小为846bp，将利用引物G1和G2扩增得到的产物依次经过酶切连接，最终得到小麦BAS1基因全序列，大小为2856bp。利用小麦‘中国春’缺体四体材料对该基因进行定位，结果该基因被定位于小麦2B染色体上，将该基因命名为TaBAS1-2B。

具体地，本发明提供的与小麦叶片叶绿素含量和粒重相关的基因TaBAS1-2B，其核苷酸序列为：

i)SeqIDNo.1所示的核苷酸序列；或

ii)SeqIDNo.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SeqIDNo.1所示序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

所述基因TaBAS1-2B的cDNA序列如SeqIDNo.2所示。

本发明还提供含有所述基因TaBAS1-2B的载体、工程菌和转基因细胞系。

根据克隆获得的基因TaBAS1-2B序列，在‘京411’和‘红芒春21’两个品种间开发出具有多态性的Indel标记，利用PrimerPremier5.0软件设计了一对用于扩增所述Indel标记的引物，并在194份小麦自然品种中分析其对表型的作用，最终开发出与所述基因TaBAS1-2B共分离的，且与小麦叶片叶绿素含量和粒重紧密相关的功能标记。

用于扩增所述Indel标记的引物对为：

上游引物F：5’-CGCAGTGCCTGTCGTTTC-3’(SeqIDNo.5)

下游引物R：5’-TCACATACTTCTTCCCAAT-3’(SeqIDNo.6)

所述引物对扩增的与小麦叶片较高叶绿素含量和较高粒重相关的Indel标记特征条带为494bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示；所述引物对扩增的与小麦叶片较低叶绿素含量和较低粒重相关的Indel标记特征条带为493bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.4所示。

本发明的基因TaBAS1-2B克隆及其Indel标记开发的具体技术路线如图1所示。

本发明还提供所述Indel标记在筛选叶片具有较高叶绿素含量和较高粒重的小麦种质资源中的应用。包括如下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R(SeqIDNo.5和6)，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出如SeqIDNo.3所示核苷酸序列的特征条带，则待测植株为叶片具有较高叶绿素含量和较高粒重的小麦资源。

其中，PCR反应使用的扩增体系以10μl计为：模板DNA100ng，10μM引物F和R各0.2μl，2.5mMdNTP0.8μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.12μl，含25mMMg²⁺的10×PCR反应缓冲液1.0μl，ddH₂O补足至10μl。

PCR反应的扩增程序为：94℃5分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃3分钟，36个循环；72℃10分钟。

优选地，步骤3)中采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后银染显色。

本发明进一步提供所述Indel标记在小麦分子标记辅助育种中的应用。

本发明首次从小麦中分离克隆到与小麦叶片叶绿素含量和粒重相关的基因TaBAS1-2B，并根据所克隆的TaBAS1-2B基因序列，在‘京411’和‘红芒春21’两个品种间开发出具有多态性的Indel标记，并在194份小麦自然品种中分析其对表型的作用，最终开发出与基因TaBAS1-2B共分离的，且与小麦叶片叶绿素含量和粒重紧密相关的功能标记。该Indel标记能够分别解释小麦花后旗叶叶绿素含量及千粒重表型变异的8.2％和4.4％，其中，分子量大小为494bp(SeqIDNo.3)的条带对粒重的增加具有增效作用，分子量大小为493bp(SeqIDNo.4)的条带对粒重的降低具有增效作用。该分子标记的开发为高产小麦分子辅助育种提供了一条可行的途径。

附图说明

图1为本发明的基因TaBAS1-2B克隆及其Indel标记开发的具体技术路线图。

图2为本发明实施例3中Indel标记在不同小麦品种中的等位类型分析；其中，泳道1为河农972，泳道2为周麦16，泳道3为宝麦8，泳道4为涡麦8号，泳道5为安农9267，泳道6为鲁麦23，泳道7为晋麦31，泳道8为周麦18，泳道9为安农1014，泳道10为矮抗58，泳道11为川麦42，泳道12为济麦20，泳道13为泛麦5号，M为DNAMarker。

图3为本发明实施例3中利用小麦‘中国春’缺体四体材料对基因TaBAS1-2B进行定位的结果；其中，泳道1为小麦‘中国春’(CS)，泳道2-7分别为CSN2AT2B、CSN2AT2D、CSN2BT2A、CSN2BT2D、CSN2DT2A、CSN2DT2B。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中测序由生工生物工程上海(股份)有限公司完成。

实施例1小麦TaBAS1-2B基因的获得

与小麦叶片叶绿素含量和粒重相关的基因TaBAS1-2B是通过电子克隆结合常规PCR方法获得的。根据NCBI上公布的小麦硫氧还蛋白过氧化物酶(Thiol-specificantioxidantprotein)的CDS序列(GenBank：AB000405.1)搜索小麦EST数据库，将筛选到的EST序列(CA484935.1，CK214438.1，CK217637.1)进行电子拼接，以拼接序列为模板，利用PrimerPremier5.0软件设计三对引物B1、B2和B3用于小麦BAS1基因cDNA的获得，另外两对引物G1和G2用于小麦BAS1基因的获得，引物信息见表1。

表1用于扩增小麦TaBAS1-2B基因及其cDNA序列的引物

PCR反应分别以小麦品种‘京411’的cDNA和基因组DNA为模板，在BIO-RADMyCycler1.0PCR仪上进行。PCR扩增结束后，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外灯下切胶回收扩增产物，进行TA克隆测序，然后将引物B1、B2和B3的扩增产物进行拼接，最终得到小麦BAS1基因的cDNA序列(SeqIDNo.2)，大小为846bp，将引物G1和G2扩增的产物进行拼接，最终得到小麦BAS1基因全序列(SeqIDNo.1)，大小为2856bp。

其中，PCR反应使用的扩增体系以10μl计为：模板DNA100ng，10μM引物F和R各0.2μl，2.5mMdNTP0.8μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.12μl，含25mMMg²⁺的10×PCR反应缓冲液1.0μl，ddH₂O补足至10μl。

PCR反应的扩增程序为：94℃5分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃3分钟，36个循环；72℃10分钟。于4℃保存。

本实施例中采用SDS-Tris饱和酚法抽提小麦叶片基因组DNA，具体方法如下：

(1)取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后置于2ml灭菌离心管中。

(2)加入1.2mlDNA提取缓冲液(200mMTris-Cl,pH8.0,250mMNaCl,25mMEDTA,pH8.0,0.5％SDS,2％β-ME混合均匀，β-ME临用前新鲜加入)。

(3)55℃水浴45min，期间间歇振荡以充分提取。

(4)室温下12000rpm离心10min。

(5)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，加入预冷的等体积Tris饱和酚/氯仿异/戊醇(体积比为25:24:1)，于冰上颠倒混匀15min，期间间歇振荡。

(6)室温下12000rpm离心10min。

(7)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，重复步骤(5)、(6)，以充分除去蛋白。

(8)转移上清液至新的1.5ml灭菌离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇(300μl)和0.1倍体积的pH为5.2的5MNaAC溶液50μl，充分混合混匀后冰上静置17min。

(9)出现白色絮状DNA沉淀，4℃，10000rpm离心10min。

(10)弃上清，加入预冷的70％乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温晾干，加入100μl含2μl10mg/mlRNase酶的1×TE缓冲液(或双蒸水)过夜溶解，10倍稀释备用。

(11)用1％琼脂糖检测提取的小麦基因组DNA的质量及浓度。

小麦cDNA的制备方法如下：

1、采用TaKaRa公司试剂盒(CodeNO.9769)进行小麦叶片总RNA的提取，按试剂盒操作说明进行。

2、采用TaKaRa公司的反转录反应试剂盒(CodeNO.6210A)进行cDNA第一链的合成。方法如下：

(1)在Microtube中按表2配制反应混合液。

表2反应混合液

(2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却。

(3)在上述Microtube管中按表3配制反转录反应液。

表3反转录反应液

(4)缓慢混匀。

(5)按下述条件进行反转录反应：30℃10min，42℃～50℃30～60min；95℃5min，然后于冰上冷却，即得小麦cDNA。

*实施例2小麦TaBAS1-2B基因功能标记的开发

根据实施例1中克隆获得的基因TaBAS1-2B序列，在‘京411’和‘红芒春21’两个品种间开发出具有多态性的Indel标记，利用PrimerPremier5.0软件设计了一对用于扩增所述Indel标记的引物，并在194份小麦自然品种中分析其对表型的作用，最终开发出与所述基因TaBAS1-2B共分离的，且与小麦叶片叶绿素含量和粒重紧密相关的功能标记。

用于扩增所述Indel标记的引物对为：

上游引物F：5’-CGCAGTGCCTGTCGTTTC-3’(SeqIDNo.5)

下游引物R：5’-TCACATACTTCTTCCCAAT-3’(SeqIDNo.6)

所述引物对扩增的与小麦叶片较高叶绿素含量和较高粒重相关的Indel标记特征条带为494bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示；所述引物对扩增的与小麦叶片较低叶绿素含量和较低粒重相关的Indel标记特征条带为493bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.4所示。

实施例3小麦TaBAS1-2B基因不同基因型与花后旗叶叶绿素含量及粒重的相关性

1、小麦花后不同时期叶绿素含量及籽粒千粒重的测定

叶绿素测定：对194份小麦自然品种标记开花期，并分别在花后10、15、25、28和31天测定旗叶叶绿素含量。每个品种选取开花时期较为一致的3个主茎旗叶，每个旗叶均匀选取上、中、下3个位点，用SPAD-502叶绿素仪测定叶绿素含量，最后取平均值作为衡量各家系旗叶的叶绿素水平。

千粒重测定：随机取1000粒完整小麦籽粒，两次重复，用千分之一天平称重，两次平均值记为最终的千粒重值。

2、小麦叶片基因组DNA的提取同实施例1。

3、目标产物的扩增。PCR扩增反应的体系及程序同实施例1。

PCR扩增结束后，加变性双指示剂(DNAloadingbuffer)在PCR仪上95℃变性10min，然后立即置于冰上，待降至室温后，在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后银染显色。具有较低千粒重的小麦品种扩增出493bp大小的目标条带，而具有较高千粒重的品种扩增出494bp大小的目标条带(图2)。

4、TaBAS1-2B基因及其Indel标记在染色体上的定位

利用小麦‘中国春’缺体四体材料对该基因TaBAS1-2B进行定位，结果该基因及其Indel标记被定位于小麦2B染色体上(图3)。

5、不同千粒重小麦品种的基因型分析及与花后旗叶叶绿素含量和千粒重的相关性

在194份小麦自然品种中对两种基因型的花后旗叶叶绿素含量及千粒重进行方差分析，同时对TaBAS1-2B基因的等位变异与花后旗叶叶绿素含量及千粒重之间进行相关性分析，结果见表4。

表4不同小麦品种中两种基因型间的花后旗叶叶绿素含量及千粒重差异显著性分析

注：差异显著性水平P值0.05、0.01和0.001，分别由*、**和***标注；A基因型为494bp带型，B基因型为493bp带型。

表4结果表明，A基因型(494bp)的千粒重显著高于B基因型(493bp)的千粒重。该基因的等位类型在194份材料中的千粒重均达到了极显著水平。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。