具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮功能的酶及其制备方法

摘要

本发明提供一种具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮功能的酶，选自如下(a)～(c)所述的多肽：(a)由SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能由(a)衍生的多肽；(c)与(a)中的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的多肽。建立了一种新的1,3-二羟基丙酮合成方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的 酶及其制备和应用。

背景技术

1,3-二羟基丙酮(1,3-dihydroxyacetone)，是自然界存在的最简单的三碳酮糖，用途比 较广泛。1,3-二羟基丙酮本身具有防晒功能，能有效阻止皮肤中的水分过度蒸发到空气中， 对皮肤具有保湿、防晒和防止太阳中紫外线辐射的作用，因此1,3-二羟基丙酮可以用作 制造化妆品的原料。另外，1，3-二羟基丙酮是糖类在体内代谢的中间产物之一，它在体 内糖代谢过程中起着非常重要的作用，它可以降低猪体内脂肪，促进体内脂肪的消耗， 减少蛋白质的消耗，而使蛋白质的含量增加从而提高瘦肉率。1，3-二羟基丙酮还可以和 角质层的角朊作用形成一种色素，这种色素可以使白斑处的皮肤与正常的皮肤颜色相近 从而使白斑得到治疗，因此1，3-二羟基丙酮有色素促进剂的作用。1，3-二羟基丙酮可 以作为一种抗病毒试剂，如二羟基丙酮用于鸡胚胎培养中，能很大程度的抑制鸡瘟病毒 的感染，而且可以杀死51％以上的鸡瘟病毒，同时以1，3-二羟基丙酮为底物合成相应的 1，3-二羟基丙酮的衍生物并由此制成的药，具有抗艾滋病的作用。由于1，3-二羟基丙 酮含有一个羰基和两个羟基，所以它的化学性质活泼，广泛用于多种有机化合物的合成， 所以它是一个重要的化学合成中间体，广泛应用于化妆品制造、食品研制、医药和化学 合成等行业。

1,3-二羟基丙酮的生产方法有化学法和微生物法，化学法有催化氧化法和甲醛缩合法。 目前，商业上生产1,3-二羟基丙酮的方法是利用葡糖杆菌属类微生物发酵甘油制备1,3- 二羟基丙酮的微生物法，该法的优点是条件温和、专一性强、产率高，但是生产能力很 低，提纯工艺复杂，生产装置要求严格，大大增加了生产成本且易造成环境污染。催化 氧化法是利用贵金属制备金属催化剂，选择性地氧化甘油，从而得到1,3-二羟基丙酮， 但此方法采用的催化剂价格较高，副产物多，后续分离纯化难度大。早期研究的甲醛缩 合法主要是局限于采用无机碱作催化剂和以甲醛水溶液作原料合成1,3-二羟基丙酮，但 由于甲醛在反应初期发生醇醛缩合反应生成乙醇醛，还有甲醛水溶液的聚糖反应，产物 中主要是C2～C7的直链糖和支链糖，其组分多达47种，以及糖分子内和糖分子间的羰 基重排可逆反应等，导致副反应很多，无法通过普通方法进行分离提纯，DHA的选择性 低于10％。即使甲醛缩合法发展到现在，以多聚甲醛为原料，有机碱为催化剂，1,3-二羟 基丙酮产量及选择性得到了极大改善，但还不能用于工业化生产。

因此，探索以甲醛为原料，以酶为催化剂合成1,3-二羟基丙酮具有重要的意义。首 先，地球上的碳一资源丰富，2013年全球甲醛产能约6400万吨，全球甲醇产能10324 万吨，天然气可采储量185.7万亿立方米，原煤可采储量8915.31亿吨。同时，酶催化剂 具有活性高，化学选择性高等特点，越来越受到人们的青睐。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有催化甲醛缩合合成1,3- 二羟基丙酮功能的酶，本发明中，将这种具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的 酶命名为BFD，选自如下(a)～(c)所述的多肽：

(a)由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甲 醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能由(a)衍生的多肽；

例如：在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质 的功能。同时，在C末端或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功 能。

(c)与(a)中的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且具有催化甲醛缩合 合成1,3-二羟基丙酮功能的多肽。

另外还包括如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的多肽的基础上的活性片段、或其活性 衍生物、类似物。所述“活性片段”、“活性衍生物”和“活性类似物”是指在基本上保持本发 明BFD多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的另一目的在于提供一种多核苷酸，选自如下(a)～(c)：

(d)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的多核苷酸；优选的，其基因序列为 SEQIDNO.2或SEQIDNO.3中所示序列。

(e)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；

(f)在严格条件下与(d)或(e)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化甲醛缩 合合成1,3-二羟基丙酮功能多肽的多核苷酸；

上述条件(g)中的严格条件是指：(1)在较低的离子强度和较高的温度下的杂交 和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加变性剂，如50％(v/v)甲酰胺， 0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上， 优选为在97％以上时才发生杂交；并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO.1 所示的成熟多肽具有相同的生物学活性和功能。

(h)与(d)或(e)或(f)或(g)限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有 催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的蛋白质的多核苷酸。其中，与上述(d)或(e) 或(f)限定的多核苷酸序列杂交的核酸片段，长度至少含10个核苷酸，优选地，20个 核苷酸以上，更优选地，50个核苷酸以上，最佳为100个核苷酸以上。

进一步地，上述多核苷酸为DNA或RNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或 人工合成的DNA。DNA可以单链的或者是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编 码链中编码SEQIDNO.1所示多肽的编码区序列可以是与SEQIDNO.2所示的序列相同 或简并的变异体，简并变异体是指编码具有SEQIDNO.1多肽，但与SEQIDNO.2所示 的序列有差别的核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种含有编码BFD多肽多核苷酸的重组载体。

所述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物 细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表 达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载 体等；在哺乳动物细胞中表达的MSXND表达载体等。总之，只要能在宿主细胞内稳定 复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。

优选地，所述重组载体为在pET-28a载体的多克隆位点，插入序列表中SEQIDNO.2 所示DNA片段后，得到的重组质粒(pET-28a-bfd)。可选的，克隆位点为NdeI酶切位 点和XhoI酶切位点。

本发明的另一目的在于提供一种转入了含有编码BFD多肽多核苷酸的重组载体的重 组宿主细胞。

所述重组宿主细胞包含上述重组载体，且指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核 细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选地为大肠杆菌、酵母。

本发明的另一目的在于提供一种具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的酶的 制备方法，其特征在于，包括以下工序：

(1)合成具有编码催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮功能的酶的基因，并将其构建 在载体上；

(2)将重组载体在宿主细胞中表达；

(3)从表达成功的重组宿主细胞中提取纯化具有催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮 功能的酶。

本发明的另一目的在于提供一种产生1,3-二羟基丙酮的方法，其特征在于，选自以下 工艺的任一种：

(1)利用权利要求1中(a)～(c)任一项所述的多肽，以甲醛为底物，体外反应产 生1,3-二羟基丙酮；

(2)利用权利要求6所述的重组细胞，以甲醛为底物，反应产生1,3-二羟基丙酮。

附图说明：

图1为重组质粒pET-28a-bfd的质粒图谱示意图

图2为BFD纯化SDS-PAGE示意图

图3为BFD催化甲醛产物GC-MS分析的色谱图

图4为BFD催化甲醛产物GC-MS分析的质谱图

具体实施方式：

在下面的实施例中进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。部分分子克隆方法 细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照产品说明进行操作，在 实施例中不再详细描述。

实施例1BFD基因获得、载体构建

BFD种属来源为Pseudomonasputida，其基因序列如SEQIDNO.2所示，在不改变 BF氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用) 的密码子，经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列如SEQID NO.3所示。

将该基因序列直接合成在pET-28a载体(Novagen，Kan⁺，见图1)上，位于酶切位 点NdeI和XhoI之间，重组质粒命名为pET-28a-bfd。

实施例2基因的表达

为了体外检测BFD酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。

(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-bfd转入E.coliBL21(DE3)中，获得重 组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan⁺，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)挑单克隆至5mLLB液体培养基中(Kan⁺，100mg/mL)，37℃、220r/min培 养至OD₆₀₀为0.6-0.8。将5mLLB培养基中菌液转接至800mL2YT培养基中(Kan⁺，100 mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5 mM，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r/min离心15min；

(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，5mMMgCl₂，0.5mM TPP，pH7.5)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。

实施例3蛋白纯化

(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、 10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；

(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH₂O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层 析柱1个柱体积；

b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；

c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50mL含50mM咪唑的蛋白 缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；

d：洗脱目的蛋白：分别用20mL含100mM，200mM，300mM咪唑蛋白缓冲液将 目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测，结果如图2所示。

(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mLAmicon超滤管(30kDa，Millipore公 司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加10mL蛋白缓冲液，浓缩至1mL， 重复该过程1次，得到纯化蛋白BFD。

(4)用Nondrop2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，为10mg/mL。即得到 纯化浓缩的BFD蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

实施例4目标产物1,3-二羟基丙酮的检测

(1)BFD可催化甲醛缩合合成1,3-二羟基丙酮。反应方程式如下：

(2)反应条件：

反应体系混匀后，置于37℃反应1h。反应结束后，利用冷冻干燥机将反应体系冻干。

(3)GC-MS检测条件：

进样量：1μL；不分流进样；

进样口温度：250℃

色谱柱：J&WHP-5(30mx250μmx0.25μm)

柱箱温度：80℃保持1min，以20℃/min升至280℃；以10℃/min升至310℃，保持 6min

GC/MS接口温度：280℃

EI离子源温度：230℃

电离能：70eV

溶剂延迟：2.5min

扫描范围：50-500amu

采集速率：5spectra/s

通过GC-MS分析可知，BFD可以催化甲醛生成1,3-二羟基丙酮，结果如图3所示。