一种金银花直接体胚发生和植株再生的培养基及方法

摘要

本发明公开了一种金银花直接体胚发生和植株再生的培养基及方法，将金银花无菌叶片接种在直接体胚诱导培养基上，开始暗培养两周，然后置于光下培养，诱导体胚发育至子叶胚阶段，待诱导出一定数量的子叶胚后，转接到生根培养基中继续培养，进一步发育成健壮的再生小植株。本发明是一种操作简单、高效、低成本的金银花体胚繁殖技术，发生频率高，无畸形胚产生，组培苗生长健壮，可广泛应用于金银花组培育苗，成活率达99%以上，生产成本降低40%以上。本发明的推广应用,将极大提高金银花良种种苗的供应能力，经济效益显著。

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，涉及一种金银花直接体胚发生和植株再生的培养基及方法。

背景技术

金银花含绿原酸和木犀草素等60余种化学成分，有清热解毒、消炎退肿、增强机体免疫、延缓衰老的功效，还具有抗癌、抗艾滋病的作用，临床上主要用于预防治疗心脑血管疾病，治疗肝炎等。适应性广，抗逆性强，对土壤要求不严，是优良的园林绿化植物，还是良好的水土保持和植被恢复树种。近年来，金银花存在品种落后、苗木质量退化的问题，虽然也有新品种选育的报道，例如湖南省林科院选育出‘金翠蕾’、‘银翠蕾’、‘舜帝1号’和‘花瑶晚熟’等优良新品种，但目前这些品种繁殖多采用嫁接或扦插方式，繁殖系数小，育苗周期长，且易传染病菌，品种退化快。为了加速这些优良新品种的推广应用，也采用组织培养方法，主要是以腋芽做外植体，利用芽培养快繁苗木，但这种芽培养繁殖系数仍旧较低，导致生产成本过高，难以在生产中被大面积推广应用。通过“器官发生”方式，繁殖系数较芽培养高，但操作过程繁琐,生产成本也居高不下，且培育出的苗木变异几率增加。体细胞胚胎发生是指在离体条件下植物体细胞通过与合子胚发生相似的途径发育成新个体的过程。体细胞胚发生，特别是直接体胚发生，是公认的最佳繁殖方法，具有操作简单、繁殖系数高、变异株少、幼苗成活率高、植株完全无病等优点，且繁殖速度快、不受地区、季节和灾害性气候等自然条件的限制，一旦获得优良材料就可以比常规繁殖快数十倍甚至上百倍的速度繁殖，大大降低了生产成本，是未来金银花苗木繁育首选方法。

金银花组培育苗研究较多。杨培君以金银花‘蒙花’品系的茎段为外植体，于MS和B₅附加不同激素配比的培养基上，探讨愈伤组织形成和丛生芽诱导及生根培养的条件，获得较好的增殖和生根培养基；王晓明以‘金翠蕾’无菌叶片为材料，通过先诱导出不定芽，再诱导出不定根的方式，成功诱导出完整小苗，但上述方法只局限于一般“芽培养”及“器官发生”方式繁殖苗木，繁殖系数仍旧不理想，尚无利用金银花叶片作为外植体建立直接体胚发生体系的研究报道。

公开号CN102577969A号“灰毡毛忍冬渝蕾1号组培种苗的繁育方法”的发明特征是以当年抽出的叶片为外植体，先诱导愈伤组织，进一步接种至分化培养基上诱导不定芽和不定根。公开号CN102577970A号“灰毡毛忍冬渝蕾1号种苗的组织培养基”专利，申请人的发明特征在于种苗繁育的组织培养基，包括愈伤组织诱导培养基、不定芽分化培养基、不定芽继代培养基及生根培养基。公开号CN103548687A号“灰毡毛忍冬渝蕾1号组培苗生根培养基及生根培养方法”专利，申请人的发明特征在于探索出一个最适合组培苗生根的培养基配方及生根培养方法，显著提高生根率。公开号CN103548690A号“灰毡毛忍冬渝蕾1号的增殖培养基及其增殖方法”专利，申请人的发明特征在于调整基本增殖培养基，并提出增殖时最佳的切割工艺。以上专利都局限在金银花器官发生、芽繁或者生根，其培养基组成因器官发生、芽繁或者生根各有差异,基本培养基为B₅、改良B₅或1/2MB，添加6-BA、NAA、KT、IAA、IBA、活性炭等，但它们均未涉及到体胚发生和通过体胚发生得到再生的金银花植物。

通过直接体胚发生繁殖苗木，攻克金银花苗木繁殖系数低的技术难题，建立高效的快繁技术体系，可在最短时间内繁殖出质量好，幼苗成活率高的优良种苗，满足市场对金银花健康种苗的需求。因此，研究金银花直接体胚发生培养基及植株再生方法至关重要。

发明内容

本发明的目的是针对现有研究的不足，提供一种能保持母株优良性状的金银花叶片直接体胚发生培养基及方法。直接体胚发生，由于胚直接源于体细胞，不经过愈伤组织阶段，通过此途径得到的再生植物能保持母株优良性状。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

1000ml所述金银花直接体胚发生和植株再生的直接体胚诱导培养基由如下配比的原料组成：

硝酸铵1000—1400mg，优选1200mg

硝酸钾700—1100mg，优选900mg

硫酸镁175—185mg，优选180.7mg

氯化钙330—335mg，优选332.2mg

磷酸二氢钾165—175mg，优选170mg

七水硫酸亚铁25—30mg，优选27.8mg

乙二胺四乙酸二钠盐35—40mg，优选37.26mg

硼酸5.5—6.5mg，优选6.2mg

七水硫酸锌8—9mg，优选8.6mg

一水硫酸锰15—18mg，优选16.9mg

碘化钾0.8—0.85mg，优选0.83mg

二水钼酸钠0.2—0.3mg，优选0.25mg

六水氯化钴0.02—0.03mg，优选0.025mg

五水硫酸铜0.02—0.03mg，优选0.025mg

硅酸钾150—250mg，优选200mg

六水硫酸镍0.003—0.007mg，优选0.005mg

肌醇90—110mg，优选100mg

甘氨酸1.8—2.2mg，优选2.0mg

烟酸0.3—0.7mg，优选0.5mg

盐酸吡哆醇0.3—0.7mg，优选0.5mg

盐酸硫胺素0.08—0.12mg，优选0.1mg

琼脂5—7g，优选6g

蔗糖28—32g，优选30g

6-BA1.8—2.2mg，优选2.0mg

NAA0.01—0.05mg

95%乙醇5—15ml

其余为水。

1000ml所述金银花直接体胚发生和植株再生的生根培养基由如下配比的原料组成：

硝酸铵500—700mg，优选600mg

硝酸钾400—500mg，优选450mg

硫酸镁85—95mg，优选90.35mg

氯化钙160—170mg，优选166.1mg

磷酸二氢钾80—90mg，优选85.0mg

七水硫酸亚铁25—30mg，优选27.8mg

乙二胺四乙酸二钠盐35—40mg，优选37.26mg

硼酸5.5—6.5mg，优选6.2mg

七水硫酸锌8—9mg，优选8.6mg

一水硫酸锰15—18mg，优选16.9mg

碘化钾0.8—0.9mg，优选0.83mg

二水钼酸钠0.2—0.3mg，优选0.25mg

六水氯化钴0.02—0.03mg，优选0.025mg

五水硫酸铜0.02—0.03mg，优选0.025mg

硅酸钾80—120mg，优选100mg

六水硫酸镍0.003—0.007mg，优选0.005mg

肌醇90—110mg，优选100mg

甘氨酸1.8—2.2mg，优选2.0mg

烟酸0.4—0.6mg，优选0.5mg

盐酸吡哆醇0.4—0.6mg，优选0.5mg

盐酸硫胺素0.08—0.12mg，优选0.1mg

琼脂4—8g，优选6g

蔗糖25—35g，优选30g

IBA3.0—5.0mg，

活性炭0—20g，优选0或20g

95%乙醇5—15ml

其余为水。

所述金银花直接体胚发生和植株再生方法是将金银花无菌叶片接种于上述直接体胚诱导培养基上培养，待直接体胚诱导培养基上长出子叶胚后，将子叶胚转接到上述生根培养基中培养，至子叶胚发育成再生小植株。

优选地，所述方法是将金银花无菌叶片接种于直接体胚诱导培养基上培养，75—80天将直接体胚诱导培养基上长出的子叶胚转接到生根培养基中培养，75—80天，优选80天后发育成再生小植株；直接体胚诱导培养基培养条件为：暗培养1.5—2.5周，优选2周，然后进行光照培养，每天光照时间为10—14小时，优选12小时，光照强度为3500-3900Lux，优选3850lux，温度为20—25℃，优选25℃；生根培养基培养条件为：光照培养，每天光照时间为10—14小时，优选12小时，光照强度为3500-3900Lux，优选3850lux，温度为20—25℃，优选25℃；将再生小植株炼苗1—1.5周，优选1周后移栽至基质中培养，所述基质由泥炭土和珍珠岩按体积比（1.5—2.5）：1，优选2:1组成。

本发明涉及的培养基包括直接体胚诱导培养基和生根培养基两种，每种基本培养基均是由MS改良而成。在直接体胚诱导培养基中，硝酸铵从MS的1650mg/L下调、以1200mg/L为最佳浓度,硝酸钾从MS的1900mg/L下调、以900mg/L为最佳浓度，另外增添了硅酸钾和硫酸镍。在生根培养基，硝酸铵从MS的1650mg/L下调、选择了600mg/L为最佳浓度,硝酸钾从MS的1900mg/L下调、选择了450mg/L为最佳浓度，另外增添了硅酸钾和硫酸镍。两种培养基均需添加蔗糖、琼脂、植物激素等，所述植物激素包括6-BA、NAA、IBA，直接体胚诱导培养基中添加6-BA2.0mg/L，NAA0.01-0.05mg/L；生根培养基添加IBA3.0-5.0mg/L；

培养基的配制方法是：a）先将上述琼脂加热煮开备用；b）用上述95%的乙醇将6-BA、NAA、IBA助溶；c）将上述其它药剂分别用水溶解；d）将酒精助溶液和水溶液分别倒入到煮好的琼脂溶液中，加水定容至1000ml，搅拌均匀，调pH为5.6，常规高温高压灭菌（在121℃、1.06kg/cm²条件下灭菌15min）。

下面对本发明作进一步说明：

本发明将金银花无菌叶片接种在直接体胚诱导培养基上，开始暗培养两周，然后置于光下培养诱导出体胚子叶，待诱导出一定数量的子叶胚后，转接到生根培养基中继续培养，进一步发育成健壮的再生小植株。

本发明体胚发生方法是将叶片培养在直接体胚诱导培养基中培养，开始暗培养两周，叶片吸收培养基中的激素和营养元素导致直接体胚发生，然后置于光下培养诱导出体胚子叶，待诱导出一定数量的子叶胚后，转接到生根培养基中继续培养，进一步发育成健壮的再生小植株。本发明的基础是植物细胞具有全能型。利用金银花无菌叶片作外植体，在特定的培养基和培养环境（黑暗、光照和温度）条件下，添加外源激素6-BA、NAA或IBA，外植体细胞感知到激素的信号刺激，从而诱发脱分化过程；由于受到激素平衡的影响，组织中体胚细胞的分化指令得以形成,进而为体胚再分化成球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形体胚奠定基础，最终发育成健壮、完整的再生小植株。

体胚发生特别是直接体胚导致的再生、由于再生效率高并保持植物优良性状、是公认的最佳繁殖方法。本发明的成功在于：(1)调整了硝酸铵和硝酸钾浓度。硝酸铵和硝酸钾与MS比，分别降低了27.3%和52.6%；这种调整主要是针对木本植物特别是金银花对不同盐浓度的要求所作出的；（2）补充了硫酸镍：镍是植物必需元素，但现有许多组培培养基不含此元素，我们在长期从事木本组培试验中发现微量的镍有利于木本植物的再生和生长；（3）补充了硅酸：硅是动物的必需元素，但硅没有被列为植物必需元素，至今众多组培培养基也不含硅；最近20年来的研究发现，许多植物对硅的需求量并不亚于磷；我们对金银花的试验表明硅能增强植物抗逆性，降低或避免玻璃化，有助于体胚发生；（4）生根培养基的大量元素减半：我们发现盐浓度降低防治了体胚再生株生理失水，保证了生根正常；（5）暗培养的作用：外植体首先暗培养两周，对诱导体胚有重要的作用。暗培养减少了叶片切割后造成的伤害，其中主要是降低了切割造成的氧化作用，是细胞尽快进入脱分化，从而诱导体胚发生。

采用本发明方法，将金银花无菌叶片于诱导培养基上培养80天后，1平方厘米外植体上可诱导出16.80—21.44个成熟体胚，其中79—86%的体胚可诱导出子叶胚；再在生根培养基中培养80天，体胚生根率77.0—88.0%，根数2.40—2.59条,根长1.79—1.99cm。

将根系发育良好的再生小植株移到有散射光的自然条件下,炼苗一周,取出生根小植株,洗净根部琼脂,然后移栽到装有泥炭土:珍珠岩(体积比2:1)的营养钵或育苗盘中，待生长两周,使其长出新根，再移至阳光下生长,注意保湿，使其健康生长。

本发明是一种操作简单、高效、低成本的金银花体胚繁殖技术，发生频率高，无畸形胚产生，组培苗生长健壮，可广泛应用于金银花组培育苗，成活率达99%以上，生产成本降低40%以上。

总之，本发明方法操作简便，培育出的苗木质量好，可用于金银花组培繁育苗木，缩短育苗时间，提高组培苗繁殖系数，降低变异株比率，提高苗木成活率，降低生产成本。本发明的推广应用,将极大提高金银花良种种苗的供应能力，经济效益显著。

具体实施方式

实施例1

所述金银花直接体胚发生植株再生方法如下：

将金银花品种“金翠蕾”无菌叶片剪取成每块1平方厘米，接种于直接体胚诱导培养基中，80d后统计诱导出的体胚总数及已诱导出子叶的体胚数，将子叶胚转接到生根培养基中，80d后统计生根率、生根数及根长；直接体胚诱导培养基培养条件为：暗培养2周，然后进行光照培养，每天光照时间为12小时，光照强度为3850Lux，温度为25℃；生根培养基培养条件为：光照培养，每天光照时间为12小时，光照强度为3850Lux，温度为25℃；将再生小植株炼苗1周，后移栽至基质中培养，所述基质由泥炭土和珍珠岩按体积比2：1组成，待生长两周,使其长出新根，再移至阳光下生长；

1000ml所述直接体胚诱导培养基由如下配比的原料组成：

硝酸铵1200mg

硝酸钾900mg

硫酸镁180.7mg

氯化钙332.2mg

磷酸二氢钾170mg

七水硫酸亚铁27.8mg

乙二胺四乙酸二钠盐37.26mg

硼酸6.2mg

七水硫酸锌8.6mg

一水硫酸锰16.9mg

碘化钾0.83mg

二水钼酸钠0.25mg

六水氯化钴0.025mg

五水硫酸铜0.025mg

硅酸钾200mg

六水硫酸镍0.005mg

肌醇100mg

甘氨酸2.0mg

烟酸0.5mg

盐酸吡哆醇0.5mg

盐酸硫胺素0.1mg

琼脂6g

蔗糖30g

6-BA2.0mg

NAA0.01mg

95%乙醇10ml

其余为水；

1000ml所述生根培养基由如下配比的原料组成：

硝酸铵600mg

硝酸钾450mg

硫酸镁90.35mg

氯化钙166.1mg

磷酸二氢钾85.0mg

七水硫酸亚铁27.8mg

乙二胺四乙酸二钠盐37.26mg

硼酸6.2mg

七水硫酸锌8.6mg

一水硫酸锰16.9mg

碘化钾0.83mg

二水钼酸钠0.25mg

六水氯化钴0.025mg

五水硫酸铜0.025mg

硅酸钾100mg

六水硫酸镍0.005mg

肌醇100mg

甘氨酸2.0mg

烟酸0.5mg

盐酸吡哆醇0.5mg

盐酸硫胺素0.1mg

琼脂6g

蔗糖30g

IBA3.0mg

95%乙醇5ml

其余为水；

结果是，在体胚诱导培养基上培养‘金翠蕾’80d后，可诱导出成熟体胚21.44个，其中18.32个为子叶胚，体胚没有死亡；转接到生根培养基中培养80d后，子叶胚生根率88.0%，生根数2.59个，根长1.99cm。

实施例2

步骤同实施例1，对象为金银花品种“舜帝1号”；

1000ml所述直接体胚诱导培养基由如下配比的原料组成：

硝酸铵1200mg

硝酸钾900mg

硫酸镁180.7mg

氯化钙332.2mg

磷酸二氢钾170mg

七水硫酸亚铁27.8mg

乙二胺四乙酸二钠盐37.26mg

硼酸6.2mg

七水硫酸锌8.6mg

一水硫酸锰16.9mg

碘化钾0.83mg

二水钼酸钠0.25mg

六水氯化钴0.025mg

五水硫酸铜0.025mg

硅酸钾200mg

六水硫酸镍0.005mg

肌醇100mg

甘氨酸2.0mg

烟酸0.5mg

盐酸吡哆醇0.5mg

盐酸硫胺素0.1mg

琼脂6g

蔗糖30g

6-BA2.0mg

NAA0.05mg

95%乙醇10ml

其余为水；

1000ml所述生根培养基由如下配比的原料组成：

硝酸铵600mg

硝酸钾450mg

硫酸镁90.35mg

氯化钙166.1mg

磷酸二氢钾85.0mg

七水硫酸亚铁27.8mg

乙二胺四乙酸二钠盐37.26mg

硼酸6.2mg

七水硫酸锌8.6mg

一水硫酸锰16.9mg

碘化钾0.83mg

二水钼酸钠0.25mg

六水氯化钴0.025mg

五水硫酸铜0.025mg

硅酸钾100mg

六水硫酸镍0.005mg

肌醇100mg

甘氨酸2.0mg

烟酸0.5mg

盐酸吡哆醇0.5mg

盐酸硫胺素0.1mg

琼脂6g

蔗糖30g

IBA5.0mg

活性炭20g

95%乙醇10ml

其余为水；

结果是，可诱导出成熟体胚16.80个，子叶胚12.90个，体胚死亡率4.0%；生根率77.0%，生根数2.40个，根长1.79cm。

实施例3

步骤同实施例1，对象为金银花品种“花瑶晚熟”；

1000ml所述直接体胚诱导培养基由如下配比的原料组成：

硝酸铵1200mg

硝酸钾900mg

硫酸镁180.7mg

氯化钙332.2mg

磷酸二氢钾170mg

七水硫酸亚铁27.8mg

乙二胺四乙酸二钠盐37.26mg

硼酸6.2mg

七水硫酸锌8.6mg

一水硫酸锰16.9mg

碘化钾0.83mg

二水钼酸钠0.25mg

六水氯化钴0.025mg

五水硫酸铜0.025mg

硅酸钾200mg

六水硫酸镍0.005mg

肌醇100mg

甘氨酸2.0mg

烟酸0.5mg

盐酸吡哆醇0.5mg

盐酸硫胺素0.1mg

琼脂6g

蔗糖30g

6-BA2.0mg

NAA0.03mg

95%乙醇10ml

1000ml所述生根培养基由如下配比的原料组成：

硝酸铵600mg

硝酸钾450mg

硫酸镁90.35mg

氯化钙166.1mg

磷酸二氢钾85.0mg

七水硫酸亚铁27.8mg

乙二胺四乙酸二钠盐37.26mg

硼酸6.2mg

七水硫酸锌8.6mg

一水硫酸锰16.9mg

碘化钾0.83mg

二水钼酸钠0.25mg

六水氯化钴0.025mg

五水硫酸铜0.025mg

硅酸钾100mg

六水硫酸镍0.005mg

肌醇100mg

甘氨酸2.0mg

烟酸0.5mg

盐酸吡哆醇0.5mg

盐酸硫胺素0.1mg

琼脂6g

蔗糖30g

IBA4.0mg

活性炭20g

95%乙醇7ml

结果是，可诱导出成熟体胚18.36个，子叶胚15.89个，体胚死亡率1.0%，生根率82.0%，生根数2.42个，根长1.88cm。