法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-11-24
授权
授权
2015-12-30
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20150826
实质审查的生效
2015-12-02
公开
公开
技术领域
本发明涉及大白菜SSR标记，具体地说是基于大白菜全基因组序列开发的SSR核心引 物组及应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
大白菜是十字花科二年生草本植物，在我国北方的冬季，大白菜更是餐桌上必不可少的， 故有“冬日白菜美如笋”之说。大白菜具有较高的营养价值，有“百菜不如白菜”的说法。 大白菜中含有大量的粗纤维，可促进肠壁蠕动，帮助消化，大白菜味美清爽，开胃健脾，含 有蛋白质、脂肪、多种维生素及钙、磷、铁等矿物质，常食有助于增强机体免疫功能，对减 肥健美也有帮助。大白菜中的有效成分能降低人体胆固醇水平、增加血管弹性，常食可预防 动脉粥样硬化和某些心血管疾病。因此，可以开发、加工成一系列食用方便的食品。
大白菜是我国原产蔬菜，有悠久的栽培历史，在中国的种植面积约占蔬菜播种面积的 9％～15％，并且先后传入日本、韩国、朝鲜等国家。由于大白菜在中国及东亚国家的蔬菜生 产和消费中占有举足轻重的地位，因此大白菜新品种培育具有重要的意义。近年来，我国大 白菜新品种培育呈现良好的发展势头，培育出大量新品种。准确、快速进行农作物品种的鉴 定，对于农作物品种审定、品种保护、真假品种辨别、品种的产权纠纷等方面均有重要作用。 传统的品种鉴定方法是田间种植鉴定，是将鉴定品种种植在相同的生长条件下，在幼苗、开 花期、成熟期等各个阶段对多个质量性状、数量性状及抗病性等做出观察记载，并进行品种 比较，鉴定品种的异同。传统品种鉴定方法存在鉴定周期长、易受环境影响、测试性状多、 工作量大等问题，无法适应大量品种的鉴定需求。
分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直 接反映。分子标记检测技术具有测试周期短、不受环境影响和季节限制、没有组织特异性、 供选择的标记数量多、可以进行高通量测试分析等优势，已逐步用于品种鉴定、种子纯度及 品种真实性检测中。利用RAPD、AFLP、RFLP标记，可以将不同生态类型的大白菜品种区 别开。但是，RAPD重复性较差；AFLP操作较复杂，稳定性较差；RFLP操作过程繁琐，效 率低，成本高。SSR(SimpleSequenceRepeats)是以1～6个核苷酸为单位、呈串联重复的DNA 序列，广泛分布于真核生物基因组中。与其他分子标记相比，SSR标记具有共显性、多态性 高、重复性好、操作简单等优点，已经作为重要的DNA标记广泛应用于植物遗传多样性研 究、品种鉴定、遗传图谱的构建、QTL定位、标记辅助选择及比较基因组研究等领域。与水 稻、小麦等作物相比，现有的大白菜SSR标记数量少，不能满足大白菜研究的需要，大量开 发覆盖全基因组的SSR标记仍是目前大白菜研究的重要工作之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一套基于大白菜全基因组序列开发的SSR核心引物组，这些引物 具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富的优点，可有效用于大白菜遗传多样性分析、品 种鉴定、DNA指纹图谱构建等研究。
本发明的技术方案是：基于大白菜全基因组序列开发的SSR核心引物组，其特征是，它 包括17对引物，分别为：CRIB1-3、CRIB2-4、CRIB2-23、CRIB3-22、CRIB3-28、CRIB4-10、 CRIB4-15、CRIB5-8、CRIB5-11、CRIB5-26、CRIB6-3、CRIB6-23、CRIB7-19、CRIB8-5、 CRIB8-12、CRIB9-3和CRIB9-8，其核苷酸序列依次如序列表SEQIDNo.1～34所示。
上述的SSR核心引物组在大白菜遗传多样性分析、品种鉴定、DNA指纹图谱构建方面 的应用。
本发明的有益效果：本发明筛选出的17对SSR核心引物(即SSR标记)在大白菜基因 组中分布均匀、带型清晰容易判读，同时适合普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测平台和毛细 管荧光检测平台检测；多态性高；扩增重复性好，可用于大白菜遗传多样性分析、品种鉴定、 DNA指纹图谱构建等领域，有利于保护育种者、生产者和消费者的合法权益，促进大白菜遗 传育种水平的提高和大白菜产业的发展。
附图说明
图1为SSRHunter1.3软件搜索结果示意图；
图2为引物在大白菜中检测的多态性；其中A、B、C图分别为引物CRIB6-23、CRIB5-26 和CRIB9-8在大白菜中检测的多态性，从图中可以看出：引物的多态性最丰富且带型清晰；
图3为17对引物对37个品种的聚类图。
具体实施方式
1.大白菜基因组DNA的提取
(1)材料37份大白菜品种(表1)
表137份大白菜品种
(2)CTAB法提取基因组DNA
采用CTAB法提取供试品种的DNA：取幼嫩组织混合样0.2g，放入1.5mL离心管中， 在液氮中研碎。或将种子研碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65℃，每管加 入400μL，混匀样品。将离心管置于65℃金属浴或水浴锅中，保温23min后取下，保温过 程中震荡离心管，使样品与提取液充分混合。向离心管中加入400μL24:1氯仿-异戊醇(V/V)， 振荡混匀。10000g离心10min。将上清液200μL转入另一只1.5mL离心管，加入400μL-20 ℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1min，弃上清液，加入500μL乙醇-乙酸铵溶液 (称取154.6mg乙酸铵，加入140ml无水乙醇，用去离子水定容至200mL)，6000g离心5 min收集沉淀。室温晾干，加入100μLTE(pH8.0)溶液溶解DNA，检测DNA浓度。-20 ℃保存。
其中，DNA提取液的配方为：分别称取20.0g十六烷基三乙基溴化铵和81.82g氯化钠 放入烧杯中，然后加入40mL乙二胺四乙酸二钠盐溶液(pH8.0)、100mL1mol/L三羟甲基 氨基甲烷盐酸溶液(pH8.0)和10.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入800ml去离子水，65℃ 水浴中加热溶解，冷却后定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。于4℃ 保存。
2.大白菜基因组SSR引物的开发
(1)大白菜基因组序列的获得
大白菜全基因组测序结果从大白菜基因组数据库BrassicaDatabase (http://brassicadb.org/brad/downloadOverview.php)下载，约277Mb，共包含40550条序列。
(2)大白菜全基因组序列中SSR序列的鉴定
以染色体为单位，每条染色体选取约150条序列(约占每条染色体序列的45％)，采用 SSR搜索软件SSRHunter1.3对序列进行SSR位点搜索。搜索条件为：重复次数至少为5、构 成重复基元的核苷酸数最多是6个。统计完全型SSR、不完全型SSR和复合型SSR。 SSRHunter1.3软件搜索结果如图1所示。
(3)大白菜基因组SSR引物的设计
依据步骤(2)获得的SSR位点，选择重复次数在10以上或者重复碱基数在20以上的 SSR位点，利用重复序列两端的保守侧翼序列，用Primer5.0设计引物。引物设计的条件是： PCR产物长度为100～350bp；退火温度(Tm)为50～70℃，保证两引物间Tm值相差不超过 4℃；GC％含量为40～65％；引物长度为18～28bp；引物5’端最好是G/C，3’端避免出现A。 为了保证引物的特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20～23个碱 基。成功设计出240对引物，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
3.大白菜基因组SSR引物的筛选
选择8份大白菜品种，用于检测大白菜基因组SSR标记的扩增情况及多态性。
采用合成的240对引物，以8份材料的基因组DNA进行扩增，根据扩增结果，筛选可 稳定扩增、带型清晰且多态性丰富的引物。
PCR扩增采用25μL的反应体积，含每种dNTP0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4 μmol/L，TaqDNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液(不含Mg2+)，MgCl21.5mmol/L，样品DNA 10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s， 每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环； 72℃延伸10min，4℃保存。
根据筛选结果，从大白菜每条染色体上选取2～4对多态性最丰富且带型清晰的引物(如图 2所示)，共17对(表2)。
表217对引物
3.利用17对SSR引物对37份大白菜品种进行PCR扩增及毛细管电泳
PCR扩增采用25μL的反应体积，含每种dNTP0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4 μmol/L，TaqDNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液(不含Mg2+)，MgCl21.5mmol/L，样品DNA 10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s， 每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环； 72℃延伸10min，4℃保存。
毛细管电泳按照以下步骤进行：将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30 倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液 混合，从混合液中吸取1μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，立 即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上(ABI3730XL)。 除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3～4个参照品种的扩增产物。
分析毛细管电泳结果。根据参照品种的扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大 小。纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位 点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异记录为0/0，多 个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱(表3)。依据17对SSR引物 的检测结果进行判定：品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种， 形成鉴定结果。比较37份品种的指纹数据，发现任两个品种间的差异位点数都大于3，说明 这17对核心引物可以有效的把这些品种鉴别开。
利用PowerMarkerV3.25软件计算引物的等位基因数(Na)、基因多样性指数(He)、多态 性信息量(PIC)。利用NTSYS-pcV2.10e软件计算品种间的遗传相似系数，用UPGMA法进 行聚类分析，绘制树状图(图3)。从图3中可以看出：大多数品种的遗传相似性系数小于0.05， 可以把所有品种区别开。
表337份品种的指纹数据
续表3
机译： 通过使用两个低覆盖度全基因组序列检测多态SSR来开发多态SSR标记以区分物种内部变异的SSR方法
机译： SNP（单核苷酸多态性）牦牛全基因组基因座的应用，引物组检测和试剂盒
机译： Ya牛全基因组SNP（单核苷酸多态性）基因座，引物组在检测和试剂盒中的应用
