用于检测与糖尿病相关的SNP位点组合的成套引物及其应用

摘要

本发明公开了一种用于检测与糖尿病相关的SNP位点组合的成套引物及其应用。本发明用于检测与糖尿病相关的SNP位点组合的成套引物由引物1)-引物47组成。通过试验证明：用本发明的成套引物可以准确的检测出与糖尿病相关的SNP位点组合的分型结果，并且可以综合评定个体发病风险，比单位点分析结果更为准确，另外本发明所摘录的SNP位点均为东亚人群中验证的2型糖尿病及并发症相关位点，对中国人群2型糖尿病的预测、预防和个体化诊疗效果更好。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测与糖尿病相关的SNP位点组合的成套引物 及其应用，更具体涉及用于检测与东亚人群2型糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、 糖尿病合并冠心病和对药物敏感性相关的SNP位点组合的成套引物及其应用。

背景技术

糖尿病是一组由胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的慢性代 谢性疾病。持续的高血糖与长期代谢紊乱可导致全身多器官，特别是眼、肾脏、心血管及神 经系统的严重损害，最终可导致患者失明、中风、心梗、截肢、肾衰等，产生严重的后果。

中国是糖尿病大国，据2010年统计，我国18岁及以上成人的糖尿病患病率为9.7％，糖 尿病患者人数已高达9700万。国际糖尿病联盟(InternationalDiabetesFederation,IDF)认为， 如果趋势不变，至2035年中国糖尿病患者将高达1.43亿。糖尿病及其并发症不仅严重影响 了患者的生活质量，同时亦导致医疗费用的迅猛上升。1993至2007年，我国糖尿病的医疗 费用从2000亿元上升至2216亿元，糖尿病直接医疗费用在卫生总费用的占比从1.96％上升 至18.2％。糖尿病带来的生命损失和经济负担已不堪重负。

糖尿病的发生是遗传和环境因素相互作用的结果。一方面，生活条件的改善和肥胖发病 率的增加是2型糖尿病发病率增加的重要因素；另一方面，遗传因素同样发挥着不可或缺的 作用。Newman等人在双胞胎中的研究表明2型糖尿病中遗传因素占30％-70％。糖尿病及并 发症的发生是可防可控的，通过预测糖尿病及并发症的易感性，提前进行健康干预是预防糖 尿病发生和控制病情恶化的有效途径。再者，值得注意的是由于遗传背景等方面的差异，不 同糖尿病患者对同种治疗药物的敏感性不同，通过基因检测等方式为患者选择适宜药物是控 制糖尿病病情发展的关键。

SNP是基因组水平上单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，人类基因组中平均每 500-1000个碱基对就有1个SNP位点，是可遗传变异中最常见的一种，也是多基因遗传病研 究的优良分子标志物。近些年，得利于高通量基因组测序的发展，众多糖尿病、糖尿病并发 症易感性及糖尿病治疗药物敏感性相关位点相继被发现。通过对这些位点的检测，可预测个 体患糖尿病及并发症的风险，评估患者对各种糖尿病治疗药物的敏感性，为患者选择耐药性 最佳药物。然而SNP的存在与否及等位基因频率存在人种及地域差异，西方国家或白种人群 的糖尿病相关SNP不一定适用于中国人。并且糖尿病是一种复杂的多基因疾病，只检测单一 SNP位点进行判定未免过于片面。因此，要利用SNP预测糖尿病的易感性及发展趋势等情况， 就必须考虑SNP位点的组合评估和人种及地域的差异。目前，尚缺乏针对东亚人群糖尿病相 关SNP位点组合进行检测的方法或产品。

综上所述，糖尿病是中国正在并将长期面对的重大医疗难题。预测个体糖尿病及并发症 患病风险，通过“治未病”预防疾病发生；针对患者个体化差异为其选择适宜的治疗方案是应 对糖尿病难题的有效途径。因而，本领域迫切需要开发检测针对东亚人群2型糖尿病及并发 症易感性、药物敏感性相关SNP位点组合的方法和产品。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测如下SNP位点：rs10229583、rs10811661、 rs10886471、rs1111875、rs12742393、rs12779790、rs13266634、rs1535500、rs16856187、 rs16861329、rs1801282、rs2237892、rs340874、rs3786897、rs4430796、rs5219、rs6017317、 rs6467136、rs6815464、rs7041847、rs7172432、rs7612463、rs7651090、rs7756992、rs780094、 rs7903146、rs8050136、rs831571、rs9470794、rs2268388、rs9565164、rs4668142、rs2380261、 rs39059、rs17756941、rs245955、rs245962、rs266729、rs3811951、rs156019、rs6234、rs3856806、 rs10494366、rs11977021、rs2230806、rs11212617和rs622342的成套引物。

本发明提供的用于检测如下SNP位点：rs10229583、rs10811661、rs10886471、rs1111875、 rs12742393、rs12779790、rs13266634、rs1535500、rs16856187、rs16861329、rs1801282、 rs2237892、rs340874、rs3786897、rs4430796、rs5219、rs6017317、rs6467136、rs6815464、 rs7041847、rs7172432、rs7612463、rs7651090、rs7756992、rs780094、rs7903146、rs8050136、 rs831571、rs9470794、rs2268388、rs9565164、rs4668142、rs2380261、rs39059、rs17756941、 rs245955、rs245962、rs266729、rs3811951、rs156019、rs6234、rs3856806、rs10494366、rs11977021、 rs2230806、rs11212617和rs622342的成套引物由引物1)-引物47)组成；

所述引物1)包括用于检测rs10229583的扩增引物1)；

所述引物2)包括用于检测rs10811661的扩增引物2)；

所述引物3)包括用于检测rs10886471的扩增引物3)；

所述引物4)包括用于检测rs1111875的扩增引物4)；

所述引物5)包括用于检测rs12742393的扩增引物5)；

所述引物6)包括用于检测rs12779790的扩增引物6)；

所述引物7)包括用于检测rs13266634的扩增引物7)；

所述引物8)包括用于检测rs1535500的扩增引物8)；

所述引物9)包括用于检测rs16856187的扩增引物9)；

所述引物10)包括用于检测rs16861329的扩增引物10)；

所述引物11)包括用于检测rs1801282的扩增引物11)；

所述引物12)包括用于检测rs2237892的扩增引物12)；

所述引物13)包括用于检测rs340874的扩增引物13)；

所述引物14)包括用于检测rs3786897的扩增引物14)；

所述引物15)包括用于检测rs4430796的扩增引物15)；

所述引物16)包括用于检测rs5219的扩增引物16)；

所述引物17)包括用于检测rs6017317的扩增引物17)；

所述引物18)包括用于检测rs6467136的扩增引物18)；

所述引物19)包括用于检测rs6815464的扩增引物19)；

所述引物20)包括用于检测rs7041847的扩增引物20)；

所述引物21)包括用于检测rs7172432的扩增引物21)；

所述引物22)包括用于检测rs7612463的扩增引物22)；

所述引物23)包括用于检测rs7651090的扩增引物23)；

所述引物24)包括用于检测rs7756992的扩增引物24)；

所述引物25)包括用于检测rs780094的扩增引物25)；

所述引物26)包括用于检测rs7903146的扩增引物26)；

所述引物27)包括用于检测rs8050136的扩增引物27)；

所述引物28)包括用于检测rs831571的扩增引物28)；

所述引物29)包括用于检测rs9470794的扩增引物29)；

所述引物30)包括用于检测rs2268388的扩增引物30)；

所述引物31)包括用于检测rs9565164的扩增引物31)；

所述引物32)包括用于检测rs4668142的扩增引物32)；

所述引物33)包括用于检测rs2380261的扩增引物33)；

所述引物34)包括用于检测rs39059的扩增引物34)；

所述引物35)包括用于检测rs17756941的扩增引物35)；

所述引物36)包括用于检测rs245955的扩增引物36)；

所述引物37)包括用于检测rs245962的扩增引物37)；

所述引物38)包括用于检测rs266729的扩增引物38)；

所述引物39)包括用于检测rs3811951的扩增引物39)；

所述引物40)包括用于检测rs156019的扩增引物40)；

所述引物41)包括用于检测rs6234的扩增引物41)；

所述引物42)包括用于检测rs3856806的扩增引物42)；

所述引物43)包括用于检测rs10494366的扩增引物43)；

所述引物44)包括用于检测rs11977021的扩增引物44)；

所述引物45)包括用于检测rs2230806的扩增引物45)；

所述引物46)包括用于检测rs11212617的扩增引物46)；

所述引物47)包括用于检测rs622342的扩增引物47)；

所述用于检测rs10229583的扩增引物1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列 表中序列2所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs10811661的扩增引物2)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列 表中序列4所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs10886471的扩增引物3)由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列 表中序列6所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs1111875的扩增引物4)由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列 表中序列8所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs12742393的扩增引物5)由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列 表中序列10所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs12779790的扩增引物6)由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序 列表中序列12所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs13266634的扩增引物7)由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序 列表中序列14所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs1535500的扩增引物8)由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列 表中序列16所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs16856187的扩增引物9)由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序 列表中序列18所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs16861329的扩增引物10)由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序 列表中序列20所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs1801282的扩增引物11)由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序 列表中序列22所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs2237892的扩增引物12)由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序 列表中序列24所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs340874的扩增引物13)由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列 表中序列26所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs3786897的扩增引物14)由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序 列表中序列28所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs4430796的扩增引物15)由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序 列表中序列30所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs5219的扩增引物16)由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表 中序列32所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs6017317的扩增引物17)由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序 列表中序列34所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs6467136的扩增引物18)由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序 列表中序列36所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs6815464的扩增引物19)由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序 列表中序列38所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs7041847的扩增引物20)由序列表中序列39所示的单链DNA分子和序 列表中序列40所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs7172432的扩增引物21)由序列表中序列41所示的单链DNA分子和序 列表中序列42所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs7612463的扩增引物22)由序列表中序列43所示的单链DNA分子和序 列表中序列44所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs7651090的扩增引物23)由序列表中序列45所示的单链DNA分子和序 列表中序列46所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs7756992的扩增引物24)由序列表中序列47所示的单链DNA分子和序 列表中序列48所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs780094的扩增引物25)由序列表中序列49所示的单链DNA分子和序列 表中序列50所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs7903146的扩增引物26)由序列表中序列51所示的单链DNA分子和序 列表中序列52所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs8050136的扩增引物27)由序列表中序列53所示的单链DNA分子和序 列表中序列54所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs831571的扩增引物28)由序列表中序列55所示的单链DNA分子和序列 表中序列56所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs9470794的扩增引物29)由序列表中序列57所示的单链DNA分子和序 列表中序列58所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs2268388的扩增引物30)由序列表中序列59所示的单链DNA分子和序 列表中序列60所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs9565164的扩增引物31)由序列表中序列61所示的单链DNA分子和序 列表中序列62所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs4668142的扩增引物32)由序列表中序列63所示的单链DNA分子和序 列表中序列64所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs2380261的扩增引物33)由序列表中序列65所示的单链DNA分子和序 列表中序列66所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs39059的扩增引物34)由序列表中序列67所示的单链DNA分子和序列 表中序列68所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs17756941的扩增引物35)由序列表中序列69所示的单链DNA分子和序 列表中序列70所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs245955的扩增引物36)由序列表中序列71所示的单链DNA分子和序列 表中序列72所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs245962的扩增引物37)由序列表中序列73所示的单链DNA分子和序列 表中序列74所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs266729的扩增引物38)由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列 表中序列76所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs3811951的扩增引物39)由序列表中序列77所示的单链DNA分子和序 列表中序列78所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs156019的扩增引物40)由序列表中序列79所示的单链DNA分子和序列 表中序列80所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs6234的扩增引物41)由序列表中序列81所示的单链DNA分子和序列表 中序列82所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs3856806的扩增引物42)由序列表中序列83所示的单链DNA分子和序 列表中序列84所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs10494366的扩增引物43)由序列表中序列85所示的单链DNA分子和序 列表中序列86所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs11977021的扩增引物44)由序列表中序列87所示的单链DNA分子和序 列表中序列88所示的单链DNA分子组成。

所述用于检测rs2230806的扩增引物45)由序列表中序列89所示的单链DNA分子和序 列表中序列90所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs11212617的扩增引物46)由序列表中序列91所示的单链DNA分子和序 列表中序列92所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测rs622342的扩增引物47)由序列表中序列93所示的单链DNA分子和序列 表中序列94所示的单链DNA分子组成。

上述成套引物中，

所述引物1)还包括用于检测rs10229583的单碱基延伸引物1)；

所述引物2)还包括用于检测rs10811661的单碱基延伸引物2)；

所述引物3)还包括用于检测rs10886471的单碱基延伸引物3)；

所述引物4)还包括用于检测rs1111875的单碱基延伸引物4)；

所述引物5)还包括用于检测rs12742393的单碱基延伸引物5)；

所述引物6)还包括用于检测rs12779790的单碱基延伸引物6)；

所述引物7)还包括用于检测rs13266634的单碱基延伸引物7)；

所述引物8)还包括用于检测rs1535500的单碱基延伸引物8)；

所述引物9)还包括用于检测rs16856187的单碱基延伸引物9)；

所述引物10)还包括用于检测rs16861329的单碱基延伸引物10)；

所述引物11)还包括用于检测rs1801282的单碱基延伸引物11)；

所述引物12)还包括用于检测rs2237892的单碱基延伸引物12)；

所述引物13)还包括用于检测rs340874的单碱基延伸引物13)；

所述引物14)还包括用于检测rs3786897的单碱基延伸引物14)；

所述引物15)还包括用于检测rs4430796的单碱基延伸引物15)；

所述引物16)还包括用于检测rs5219的单碱基延伸引物16)；

所述引物17)还包括用于检测rs6017317的单碱基延伸引物17)；

所述引物18)还包括用于检测rs6467136的单碱基延伸引物18)；

所述引物19)还包括用于检测rs6815464的单碱基延伸引物19)；

所述引物20)还包括用于检测rs7041847的单碱基延伸引物20)；

所述引物21)还包括用于检测rs7172432的单碱基延伸引物21)；

所述引物22)还包括用于检测rs7612463的单碱基延伸引物22)；

所述引物23)还包括用于检测rs7651090的单碱基延伸引物23)；

所述引物24)还包括用于检测rs7756992的单碱基延伸引物24)；

所述引物25)还包括用于检测rs780094的单碱基延伸引物25)；

所述引物26)还包括用于检测rs7903146的单碱基延伸引物26)；

所述引物27)还包括用于检测rs8050136的单碱基延伸引物27)；

所述引物28)还包括用于检测rs831571的单碱基延伸引物28)；

所述引物29)还包括用于检测rs9470794的单碱基延伸引物29)；

所述引物30)还包括用于检测rs2268388的单碱基延伸引物30)；

所述引物31)还包括用于检测rs9565164的单碱基延伸引物31)；

所述引物32)还包括用于检测rs4668142的单碱基延伸引物32)；

所述引物33)还包括用于检测rs2380261的单碱基延伸引物33)；

所述引物34)还包括用于检测rs39059的单碱基延伸引物34)；

所述引物35)还包括用于检测rs17756941的单碱基延伸引物35)；

所述引物36)还包括用于检测rs245955的单碱基延伸引物36)；

所述引物37)还包括用于检测rs245962的单碱基延伸引物37)；

所述引物38)还包括用于检测rs266729的单碱基延伸引物38)；

所述引物39)还包括用于检测rs3811951的单碱基延伸引物39)；

所述引物40)还包括用于检测rs156019的单碱基延伸引物40)；

所述引物41)还包括用于检测rs6234的单碱基延伸引物41)；

所述引物42)还包括用于检测rs3856806的单碱基延伸引物42)；

所述引物43)还包括用于检测rs10494366的单碱基延伸引物43)；

所述引物44)还包括用于检测rs11977021的单碱基延伸引物44)；

所述引物45)还包括用于检测rs2230806的单碱基延伸引物45)；

所述引物46)还包括用于检测rs11212617的单碱基延伸引物46)；

所述引物47)还包括用于检测rs622342的单碱基延伸引物47)；

所述用于检测rs10229583的单碱基延伸引物1)为序列表中序列95所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs10811661的单碱基延伸引物2)为序列表中序列96所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs10886471的单碱基延伸引物3)为序列表中序列97所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs1111875的单碱基延伸引物4)为序列表中序列98所示的单链DNA分子；

所述用于检测rs12742393的单碱基延伸引物5)为序列表中序列99所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs12779790的单碱基延伸引物6)为序列表中序列100所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs13266634的单碱基延伸引物7)为序列表中序列101所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs1535500的单碱基延伸引物8为序列表中序列102所示的单链DNA分子；

所述用于检测rs16856187的单碱基延伸引物9)为序列表中序列103所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs16861329的单碱基延伸引物10)为序列表中序列104所示的单链DNA 分子；

所述用于检测rs1801282的单碱基延伸引物11)为序列表中序列105所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs2237892的单碱基延伸引物12)为序列表中序列106所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs340874的单碱基延伸引物13)为序列表中序列107所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs3786897的单碱基延伸引物14)为序列表中序列108所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs4430796的单碱基延伸引物15)为序列表中序列109所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs5219的单碱基延伸引物16)为序列表中序列110所示的单链DNA分子；

所述用于检测rs6017317的单碱基延伸引物17)为序列表中序列111所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs6467136的单碱基延伸引物18)为序列表中序列112所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs6815464的单碱基延伸引物19)为序列表中序列113所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs7041847的单碱基延伸引物20)为序列表中序列114所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs7172432的单碱基延伸引物21)为序列表中序列115所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs7612463的单碱基延伸引物22)为序列表中序列116所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs7651090的单碱基延伸引物23)为序列表中序列117所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs7756992的单碱基延伸引物24)为序列表中序列118所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs780094的单碱基延伸引物25)为序列表中序列119所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs7903146的单碱基延伸引物26)为序列表中序列120所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs8050136的单碱基延伸引物27)为序列表中序列121所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs831571的单碱基延伸引物28)为序列表中序列122所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs9470794的单碱基延伸引物29)为序列表中序列123所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs2268388的单碱基延伸引物30)为序列表中序列124所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs9565164的单碱基延伸引物31)为序列表中序列125所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs4668142的单碱基延伸引物32)为序列表中序列126所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs2380261的单碱基延伸引物33)为序列表中序列127所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs39059的单碱基延伸引物34)为序列表中序列128所示的单链DNA分子；

所述用于检测rs17756941的单碱基延伸引物35)为序列表中序列129所示的单链DNA 分子；

所述用于检测rs245955的单碱基延伸引物36)为序列表中序列130所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs245962的单碱基延伸引物37)为序列表中序列131所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs266729的单碱基延伸引物38)为序列表中序列132所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs3811951的单碱基延伸引物39)为序列表中序列133所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs156019的单碱基延伸引物40)为序列表中序列134所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs6234的单碱基延伸引物41)为序列表中序列135所示的单链DNA分子；

所述用于检测rs3856806的单碱基延伸引物42)为序列表中序列136所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs10494366的单碱基延伸引物43)为序列表中序列137所示的单链DNA 分子；

所述用于检测rs11977021的单碱基延伸引物44)为序列表中序列138所示的单链DNA 分子；

所述用于检测rs2230806的单碱基延伸引物45)为序列表中序列139所示的单链DNA分 子；

所述用于检测rs11212617的单碱基延伸引物46)为序列表中序列140所示的单链DNA 分子；

所述用于检测rs622342的单碱基延伸引物47)为序列表中序列141所示的单链DNA分 子。

上述成套引物中，每个SNP位点对应一组扩增引物和一条单碱基延伸引物。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测如下SNP位点：rs10229583、rs10811661、 rs10886471、rs1111875、rs12742393、rs12779790、rs13266634、rs1535500、rs16856187、 rs16861329、rs1801282、rs2237892、rs340874、rs3786897、rs4430796、rs5219、rs6017317、 rs6467136、rs6815464、rs7041847、rs7172432、rs7612463、rs7651090、rs7756992、rs780094、 rs7903146、rs8050136、rs831571、rs9470794、rs2268388、rs9565164、rs4668142、rs2380261、 rs39059、rs17756941、rs245955、rs245962、rs266729、rs3811951、rs156019、rs6234、rs3856806、 rs10494366、rs11977021、rs2230806、rs11212617和rs622342的试剂盒。

本发明提供的用于检测如下SNP位点：rs10229583、rs10811661、rs10886471、rs1111875、 rs12742393、rs12779790、rs13266634、rs1535500、rs16856187、rs16861329、rs1801282、 rs2237892、rs340874、rs3786897、rs4430796、rs5219、rs6017317、rs6467136、rs6815464、 rs7041847、rs7172432、rs7612463、rs7651090、rs7756992、rs780094、rs7903146、rs8050136、 rs831571、rs9470794、rs2268388、rs9565164、rs4668142、rs2380261、rs39059、rs17756941、 rs245955、rs245962、rs266729、rs3811951、rs156019、rs6234、rs3856806、rs10494366、rs11977021、 rs2230806、rs11212617和rs622342的试剂盒包括上述成套引物。

上述成套引物或上述试剂盒在检测如下SNP位点：rs10229583、rs10811661、rs10886471、 rs1111875、rs12742393、rs12779790、rs13266634、rs1535500、rs16856187、rs16861329、 rs1801282、rs2237892、rs340874、rs3786897、rs4430796、rs5219、rs6017317、rs6467136、 rs6815464、rs7041847、rs7172432、rs7612463、rs7651090、rs7756992、rs780094、rs7903146、 rs8050136、rs831571、rs9470794、rs2268388、rs9565164、rs4668142、rs2380261、rs39059、 rs17756941、rs245955、rs245962、rs266729、rs3811951、rs156019、rs6234、rs3856806、rs10494366、 rs11977021、rs2230806、rs11212617和rs622342中的应用也属于本发明的保护范围。

上述成套引物或上述试剂盒在制备检测如下SNP位点：rs10229583、rs10811661、 rs10886471、rs1111875、rs12742393、rs12779790、rs13266634、rs1535500、rs16856187、 rs16861329、rs1801282、rs2237892、rs340874、rs3786897、rs4430796、rs5219、rs6017317、 rs6467136、rs6815464、rs7041847、rs7172432、rs7612463、rs7651090、rs7756992、rs780094、 rs7903146、rs8050136、rs831571、rs9470794、rs2268388、rs9565164、rs4668142、rs2380261、 rs39059、rs17756941、rs245955、rs245962、rs266729、rs3811951、rs156019、rs6234、rs3856806、 rs10494366、rs11977021、rs2230806、rs11212617和rs622342的产品中的应用也属于本发明 的保护范围。

上述成套引物或上述试剂盒或上述应用中，所述rs10229583、所述rs10811661、所述 rs10886471、所述rs1111875、所述rs12742393、所述rs12779790、所述rs13266634、所述 rs1535500、所述rs16856187、所述rs16861329、所述rs1801282、所述rs2237892、所述rs340874、 所述rs3786897、所述rs4430796、所述rs5219、所述rs6017317、所述rs6467136、所述rs6815464、 所述rs7041847、所述rs7172432、所述rs7612463、所述rs7651090、所述rs7756992、所述 rs780094、所述rs7903146、所述rs8050136、所述rs831571、所述rs9470794、所述rs2268388、 所述rs9565164、所述rs4668142、所述rs2380261、所述rs39059、所述rs17756941、所述rs245955、 所述rs245962、所述rs266729、所述rs3811951、所述rs156019、所述rs6234、所述rs3856806、 所述rs10494366、所述rs11977021、所述rs2230806、所述rs11212617和所述rs622342均为 人染色体上的二等位多态性的SNP位点，每个SNP位点的具体位置及侧翼序列如表1-表5 所示。

本发明的优点：

1)任意风险等位基因的存在指示个体患病风险高于普通人群，并且风险等位基因的效果 具有叠加效应，携带风险等位基因越多，患病风险越高。本发明的检测SNP位点组合的成套 引物可以综合评定个体发病风险，比单位点分析结果更为准确；

2)本发明所摘录的SNP位点均为东亚人群中验证的2型糖尿病及并发症相关位点，适 用于对中国人群2型糖尿病的预测、预防、个体化诊疗；

在本发明首次揭示了适用于东亚人群2型糖尿病及其并发症易感性和降糖药物耐药性相 关SNP位点组合，并根据SNP位点组合设计了检测东亚人群2型糖尿病及其并发症易感性 和降糖药物耐药性的成套引物。通过实验证明：运用本发明的成套引物中的扩增引物和单碱 基延伸引物可准确检测出与东亚人群2型糖尿病及其并发症易感性和降糖药物耐药性相关的 SNP位点的分型结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与东亚人群2型糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病合并冠心 病和糖尿病治疗药物耐药性相关的SNP位点组合及其扩增引物和探针的设计

一、与东亚人群2型糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病合并冠心病和糖 尿病治疗药物耐药性相关的SNP位点组合的筛选

在PubMed、mtSNP、中国期刊网和重庆维普等数据库中分别检索并下载与东亚人群2型 糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病合并冠心病易感性相关SNP位点，及与瑞 格列奈、罗格列酮、二甲双胍和格列齐特耐药性相关SNP位点文献，从所下载的文献中分别 摘录能显著增加2型糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病合并冠心病患病风险 的SNP位点等位基因及与糖尿病治疗药物耐药性相关的SNP位点。

本发明筛选出与东亚人群的2型糖尿病易感SNP位点组合如表1所示、糖尿病肾病易感 SNP位点组合如表2所示、糖尿病视网膜病变易感SNP位点组合如表3所示、糖尿病合并冠 心病易感SNP位点组合如表4所示、糖尿病治疗药物(瑞格列奈、罗格列酮、二甲双胍和格 列齐特)耐药性相关SNP位点组合如表5所示。

表1、2型糖尿病易感SNP位点组合

表2、糖尿病肾病易感SNP位点组合

表3、糖尿病视网膜病变易感SNP位点组合

表4、糖尿病合并冠心病易感SNP位点组合

表5、降糖药物耐药性相关的SNP位点组合

二、针对SNP位点组合的扩增引物和单碱基延伸引物的设计

利用Sequenom官方网站上引物设计软件分别设计扩增包含实施例1中得到的SNP位点的 扩增引物和单碱基延伸引物。引物设计的灵敏度要求：在DNA模板量低至10ng的反应体系中 可以得到目的片段；引物设计的准确性要求：准确度要求大于99.7％。针对实施例1中得到的 SNP位点设计的扩增引物和单碱基延伸引物序列如表6和表7所示：

表6、针对SNP位点设计的扩增引物序列

表7、针对SNP位点设计的单碱基延伸引物序列

rs10229583 TGATTTTTAAATCTGTTGACAA(序列95) rs10811661 ggCACCTCCAGCTTTAGTTTTC(序列96) rs10886471 AAAAGCAGCTGGGCCAAGA(序列97) rs1111875 CCATCAAGTCATTTCCTCT(序列98) rs12742393 CCACCCATACCACAGATTGTAC(序列99) rs12779790 tgAGATATATAAATGGCCAAGAAATA(序列100) rs13266634 TATCAACAGCAGCCAGC(序列101) rs1535500 GCCTCGGCGTCAAGGATGGGG(序列102) rs16856187 cAACCCCATACTAAACTCC(序列103) rs16861329 TCTCTGCTATACCAACAC(序列104) rs1801282 AAACTCTGGGAGATTCTCCTATTGAC(序列105) rs2237892 TCTAGGCCCCTCACCCC(序列106) rs340874 cAAGGTGTGGAAAGGTATA(序列107) rs3786897 TGTCTTCCAGGGAAAAAGGG(序列108) rs4430796 AGGCAGCACAGACTGGA(序列109) rs5219 GGCACGGTACCTGGGCT(序列110) rs6017317 TCTATGTTGTCTTGTTTTGAG(序列111) rs6467136 ggagGGACATTACTTTAAAAGTGCAA(序列112) rs6815464 ctATACCTGTACCCCGGGTTTTG(序列113) rs7041847 CTCATCGCATACATTTTGGGGAGCTA(序列114) rs7172432 ctGGGCCCAGACAGTTTCTTTGGGAA(序列115) rs7612463 GGTTTTAGACTCAGTTTCAGGTA(序列116) rs7651090 GACTGACCCACTGCTTC(序列117) rs7756992 cCCCCCCTGTATTTTAGTTTT(序列118) rs780094 ggTTAGACCATGACTGACACAT(序列119) rs7903146 GAGCTAAGCACTTTTTAGATA(序列120) rs8050136 TGCCAGTTGCCCACTGTGGCAAT(序列121)

rs831571 aCTCTTGACAACAAGATAGGCTTTA(序列122) rs9470794 aTCCTTTCTTCCCACCTGACC(序列123) rs2268388 taTGTTCTCCCAGCAGAGAACACTC(序列124) rs9565164 GGAGTGGGACAAAACTA(序列125) rs4668142 TGCCAGCCAATGTTCTGA(序列126) rs2380261 GCCCAGCCAAGCATGGCTCCAAGG(序列127) rs39059 aaagCAGTCACTTAAGGAAGAAGAG(序列128) rs17756941 gagGGAATGTGACCTACACTATG(序列129) rs245955 TAATAGCTAACATAATACAAAGTTAC(序列130) rs245962 ACATGAGACTTTCATGAATTATA(序列131) rs266729 GGCACGCTCATGTTTTGTTTTTGAAG(序列132) rs3811951 TCATGAGTACTCTCACATTAACAA(序列133) rs156019 ggACACTAGTAAAAAACTACTCAG(序列134) rs6234 GAGTCGCAGCATGGCCT(序列135) rs3856806 gcTCACCTGCAGTAGCTGCAC(序列136) rs10494366 TTATGGGAGGTATGCAG(序列137) rs11977021 CACCAGTGTTTTTTACTGA(序列138) rs2230806 TGCTGCAGCCAGTTTCTCC(序列139) rs11212617 TTTTTTATCCGCTCTGACA(序列140) rs622342 TTGAGATTGTTAGATCTATGTATT(序列141)

上述扩增引物分配方式如下：47个SNP位点对应的扩增引物随机分配到5个不同的反应 孔(w01、w02、w03、w04和w05)中，不同rs号的SNP位点对应的扩增引物所在的反应 孔如下表8所示。当每个反应孔中含有的扩增引物确定之后，Sequenom平台会自动计算出该 反应孔中各条引物的最合适的终浓度，按照Sequenom平台自动计算出终浓度进行操作即可。

表8、不同rs号对应的扩增引物在不同反应孔中的组合

上述扩增引物和单碱基延伸引物也可以作为检测如下SNP位点：rs10229583、rs10811661、 rs10886471、rs1111875、rs12742393、rs12779790、rs13266634、rs1535500、rs16856187、 rs16861329、rs1801282、rs2237892、rs340874、rs3786897、rs4430796、rs5219、rs6017317、 rs6467136、rs6815464、rs7041847、rs7172432、rs7612463、rs7651090、rs7756992、rs780094、 rs7903146、rs8050136、rs831571、rs9470794、rs2268388、rs9565164、rs4668142、rs2380261、 rs39059、rs17756941、rs245955、rs245962、rs266729、rs3811951、rs156019、rs6234、rs3856806、 rs10494366、rs11977021、rs2230806、rs11212617和rs622342的试剂盒组分。

实施例2、扩增引物和单碱基延伸引物在检测与糖尿病相关的SNP位点中的应用

1、血液样本的采集

采集3252例糖尿病患者(以上患者来源于上海市第六人民医院，所有患者样本的DNA 序列均经测序确认并经临床诊断，患者知情)和3359例正常的人的血液。

2、DNA的提取

分别提取步骤1获得的待测血液样本的DNA，具体步骤如下：在加入蛋白酶K的1.5ml 离心管中依次加入250μl血液、225μl缓冲液GH，吹吸或振荡混匀；置于65℃，孵育10min， 期间颠倒混匀3次或振荡混匀；加入20μl磁珠悬浮液G，吹吸或振荡混匀；加入325μl异丙 醇(可以将磁珠与异丙醇按比例混匀后一起加入)，吹吸或振荡混匀15min；置于磁力架上静 置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体，加入700μl漂洗缓冲液I，吹吸或振荡混匀，置 于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体，加入700μl漂洗缓冲液II，吹吸或 振荡混匀；置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体，离心管于磁力架上， 室温晾干10min；将离心管从磁力架上取下，加入65μl洗脱液TB，吹吸或振荡混匀，置于 56℃，孵育10min，期间颠倒混匀3次或振荡混匀(若使用带振荡功能的恒温金属浴也可将 转速调至1500rpm)；将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时将DNA溶液转 移至收集板，并于-20℃条件保存。

3、PCR扩增

将步骤2提取的待测血液样本的DNA进行稀释，并将稀释后的待测血液样本分别加入到 384孔板中，进行多重PCR扩增。具体如下：

将多重PCR扩增的反应体系加入每个反应孔中，多重PCR扩增的反应体系(5ul)：25mM dNTPs0.1ul，10×PCRBuffer0.4ul，25mmol/LMgCl₂0.4ul，模板DNA10ng，引物混合液(表 8所示的每个反应孔中加入的所有SNP位点的扩增引物)0.5uM1ul，HotstarTaq(5U/ul)0.1ul， 补足水到5ul。

反应体系配制好后使用胶片膜将384孔板密封，防止样品蒸发。将密封后的384孔板置于 ABI9700PCR仪上反应：预变性94℃2min；94℃20sec，56℃30sec，72℃1min，45个循环； 72℃3min；Hold4℃，得到PCR扩增产物。将得到的PCR扩增产物2500rpm离心1min。

下述步骤4-步骤8中的试剂均为Sequenom平台的配套产品，按照Sequenom平台的操作步 骤即可得到待测样本的SNP位点分型结果，具体步骤如下：

4、SAP消化反应

将步骤3得到的PCR扩增产物2000rpm离心1min后进行SAP消化反应。具体如下：

按照实际所需加样量的110％来配制SAP反应Mix(2ul)：SAPBuffer0.17ul，SAPEnzyme 0.3ul，补足水到2ul。

向上述步骤3处理后的384孔板的每孔中加入上述SAP反应Mix2μl/孔，加好后用排枪 吹打5次，用胶片膜将孔封闭，涡旋震荡30s，使反应物充分混匀，2500rpm离心1min。

将384孔板放置在ABI9700PCR仪上，并将反应盖拧紧，设定SAP消化反应程序：37℃ 40min，85℃5min，Hold4℃，得到SAP消化反应产物。将得到的SAP消化反应产物2500rpm 离心1min。

5、单碱基延伸反应

将步骤4得到的SAP消化反应产物进行单碱基延伸反应。具体如下：

按照实际所需加样量的120％来配制延伸Mix：iPLEXBufferplus0.2ul，iPLEXTerminator 0.2ul，iPLEXEnzyme0.041ul，引物Mix(表8中所示的每个反应孔对应的所有SNP位点对 应的单碱基延伸引物)1ul，补足水到2.06ul。

将延伸Mix用排枪加入到上述步骤4处理后的384孔板中，加入量为2.06μl/孔，加入后 使用排枪吹打5次，使反应物充分混匀。用胶片膜将孔封闭，然后2000rpm离心1min。将 384孔板放置在ABI9700PCR仪中，扣紧加热盖，打开PCR仪，设置延伸反应程序，反应程 序如表9所示，得到单碱基延伸反应产物。将得到的单碱基延伸反应产物2500rpm离心1min。

表9、单碱基延伸反应程序

6、树脂纯化

将步骤6得到的单碱基延伸反应产物3000rpm离心2min，每孔加16μlMBG水，然后用胶片 膜将384孔板封闭，3000rpm离心1min；取一张干净的A4纸，将6mg板置于其上，用小勺取适 量resin置于384反应板上，用塑料盖板反复左右推平resin，压实，使每孔resin含量均匀；将离 心后的384孔板倒置在6mg板上，使两块板的孔一一对应。6mg板在上，384反应板在下。均匀 轻轻敲打6mg板背面，使resin落入装有单碱基延伸产物的384孔中；使用胶片膜将装有单碱基 延伸产物和resin的384孔板密封，使用摇床低速垂直旋转30min，使resin与反应物充分接触； 3000rpm离心3min使resin沉入管底，得到树脂纯化后的延伸产物。

7、芯片点样

启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪，将步骤6得到的树脂纯化后的延伸产物 点至384点阵SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，得到点样后的SpectroCHIP芯片。

8、质谱检测

将步骤7得到的点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization–timeoffligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果 使用TYPER4.0软件(Sequenom)分型并输出结果。

9、检测结果

检测结果表明：所有待测样本的47个SNP位点的分型结果均与其DNA测序结果一致，其 中，某一个待测样本(待测样本中的1例糖尿病患者)的SNP位点分型结果如表10所示。说明 本发明的扩增引物和单碱基延伸引物可以有效的用于检测如下SNP位点：rs10229583、 rs10811661、rs10886471、rs1111875、rs12742393、rs12779790、rs13266634、rs1535500、 rs16856187、rs16861329、rs1801282、rs2237892、rs340874、rs3786897、rs4430796、rs5219、 rs6017317、rs6467136、rs6815464、rs7041847、rs7172432、rs7612463、rs7651090、rs7756992、 rs780094、rs7903146、rs8050136、rs831571、rs9470794、rs2268388、rs9565164、rs4668142、 rs2380261、rs39059、rs17756941、rs245955、rs245962、rs266729、rs3811951、rs156019、rs6234、 rs3856806、rs10494366、rs11977021、rs2230806、rs11212617和rs622342。

表10、SNP位点分型结果

位点 分型结果 位点 分型结果 位点 分型结果 rs10229583 G rs1801282 C rs6017317 G rs10494366 GT rs2230806 GA rs622342 A rs10811661 CT rs2237892 TC rs6234 C rs10886471 C rs2268388 C rs6467136 G rs1111875 A rs2380261 T rs6815464 CG rs11212617 C rs245955 CT rs7041847 GA rs11977021 C rs245962 AG rs7172432 A rs12742393 CA rs266729 C rs7612463 CA rs12779790 A rs340874 A rs7651090 A rs13266634 T rs3786897 AG rs7756992 G rs1535500 GT rs3811951 A rs780094 G rs156019 TA rs3856806 C rs7903146 CT rs16856187 CA rs39059 GA rs8050136 C rs16861329 CT rs4430796 A rs831571 CT rs17756941 A rs4668142 GT rs9470794 TC rs5219 CT rs9565164 T