一种治疗视网膜变性的干细胞制剂及其使用方法

摘要

本发明提供了一种治疗视网膜变性的干细胞及制剂，通过将骨髓间充质干细胞优化培养和诱导分化，提高了其分化为视网膜神经前体样细胞效率，其移植效果与视网膜前体细胞具有相似的功效，使移植区视网膜功能有效改善，为干细胞移植治疗视网膜变性疾病提供了一种理想的细胞来源，具有很强的优越性。本发明提供的干细胞制剂的制备方法，经分离、培养、传代和诱导得到的干细胞产品，其制备过程简单、可靠，重现性好。本发明的一种治疗视网膜变性的干细胞制剂的使用方法，是一种操作简单，便于推广、创伤小的细胞替代方法，具有广阔的应用前景，是目前治疗视网膜变性类变性疾病和挽救视力的最佳途径。

说明书

技术领域

本发明涉及再生医学和干细胞生物技术领域，涉及一种治疗视网膜变性的干细胞制剂及其使用方法。

背景技术

人的视网膜约厚0.1～0.5毫米，在组织学上将其分为10层，其中主要有4层细胞组成，由外向内依次是色素上皮细胞层、视细胞层、双极细胞层及神经节细胞层。视网膜色素上皮层与脉络膜紧密相连，由色素上皮细胞(retinalpigmentepitheium，RPE)组成，正常的RPE是具有极性的单层细胞，位于视网膜的最外层。它是代谢高度活跃的细胞层，具有支持和营养光感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复等作用。其主要功能包括转运营养物质，视黄醇回收利用，产生色素以及吞噬视锥、视杆细胞外节。

视网膜变性疾病，包括年龄相关性黄斑变性，视网膜色素变性等，发病率逐渐升高，是主要的致盲性疾病。这些疾病都是以进行性色素上皮细胞、光感受器细胞的功能丧失，凋亡或坏死为特点，造成视力不可逆的损害。

视网膜变性主要表现为Bruch’s膜增厚、RPE色素沉着过度和RPE细胞损耗等。临床上主要分为萎缩型（干性）和新生血管型（湿性或渗出型）两种类型，前者主要有玻璃膜疣、RPE异常和地图样萎缩改变；后者主要以脉络膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)、RPE脱离或盘状纤维化为病理特点。

目前对于视网膜变性，特别是黄斑变性，现代医学没有特效的治疗方法。临床常根据病程的阶段，使用抗氧化剂，维生素类，止血剂，以及视神经营养药或细胞激活制剂，玻璃体内注射抗血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowfactor，VEGF）等治疗方式，但仅能延缓疾病的进展，不能从根本上替换掉病变的视网膜细胞，逆转病程。过去尝试用手术的方式替换黄斑部的RPE，主要有黄斑转位手术和RPE自体移植术，在长期的随访中证实可维持或提高患者的视力。此类手术为移植健康的RPE治疗视网膜变性疾病提供了依据，然而上述手术存在创伤大、操作复杂，并发症多的缺点，另外，对于光感受器严重受损的病例则难以发挥作用。因此寻找一种操作简单，便于推广、创伤性小的细胞替代方法越来越受到重视。

干细胞是一群具有自我更新及多向潜能的细胞群。利用干细胞的可塑性，定向分化为目的细胞进行细胞移植或利用干细胞的分泌细胞因子修复受损的视网膜及RPE，已经成为视网膜变性疾病治疗的研究热点。

干细胞移植治疗视网膜变性疾病的机制：①细胞替代，由健康的干细胞替代丢失的病变细胞；②营养支持，移植的健康干细胞促进周围细胞的存活；③移植区微环境的免疫调控作用，如促进移植区原态细胞的逆分化。理论上，建立有效的新的突触联系和在此基础上的视功能改善，是干细胞移植成功的标准。研究表明，只有将干细胞诱导至发育状态并接近成熟，才能发挥移植功效。理想的供体细胞应当具有一定的可塑性，即处于感光前体细胞向成熟细胞发育的关键期。

为将各种来源干细胞精确诱导至感光前体细胞，必须了解人胚胎感光前体细胞的发育。人胚胎视网膜发育受严格的程序控制，在胚胎7～8周，神经节细胞即开始出现，随后，视锥细胞、水平细胞、无长突细胞逐渐定向分化；胚胎12周左右，视网膜的大体层次开始形成，而双极细胞、视杆细胞、原态细胞发育稍晚。高度合作的核转录因子精确调控感光细胞的分化，这些基因按照时间、空间顺序启动或关闭，对胚胎细胞的生长和分化进行调节。具有移植功效的感光前体细胞的特征：①处于有丝分裂末期，已经定向分化，不再继续增殖；②表达Otx2、PAX6、CRX、Nrl等核转录因子；③尚未发育为成熟的感光细胞，细胞内逐渐形成各种视蛋白，即具有可塑性。

骨髓间充质干细胞（bonemesenchymalstemcells，BMSCs）是一类多功能干细胞，其来源相对广泛，取材方便安全，不存在伦理方面的限制；具有强大的旁分泌作用，其分泌的神经营养因子和生长因子能促进损伤组织的修复；具有主动向损伤组织区域迁移的作用；移植后无肿瘤形成的倾向；免疫原性低，可进行自体或同种异体移植，发生排斥反应的机率较低。BMSCs同样具有多向分化潜能，除了可分化为中胚层起源的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，在一定条件下BMSCs还可以跨胚层分化为神经细胞、心肌细胞、胶质细胞等。基于以上这些特性，使得BMSCs在组织修复和基因治疗方面的临床应用潜能受到越来越多的关注，在移植视网膜变性疾病治疗研究中也备受推崇。

目前细胞移植途径主要有静脉注射，玻璃体腔注射和视网膜下注射。（1）静脉注射：是将细胞悬液注射到静脉中，细胞通过体循环到达眼部，并迁移至视网膜下或视网膜内。该方法操作简单，便于反复注射，不受注射容积的限制，但是存在诱导血栓形成及过敏的风险，并且存在细胞经过全身循环后能否到达视网膜附近的争议。（2）经玻璃体腔注射：是将细胞悬液注射到玻璃体腔中，通过玻璃体腔迁移到视网膜内。由于内界膜的阻碍，只有不到1%的细胞能到达视网膜内，并且球内易感染。（3）视网膜下注射：直接把细胞注射移植到靶部位即RPE层与感光细胞层之间。尽管受到体积限制，单次注射的细胞数量偏少，但是所注射的细胞都能进入视网膜下，只要有足够的活细胞数量并在局部微环境的状态下能向RPE及视网膜光感受器细胞分化，便有可能发挥细胞替代作用，因此应是最理想的移植方法。

尽管近年来干细胞移植治疗视网膜变性疾病的研究取得了突飞猛进的进展，但仍然面临着许多障碍。突出的问题是移植细胞在视网膜下间隙的存活率仅约0.01%。因此，提高移植细胞的存活和迁移能力是提高移植效果的关键。目前，将细胞悬液直接注入视网膜下腔的移植方法虽然简便易行，但干细胞同时失去了维系其生存的微环境。随着科技的发展和进步，人们在不断地寻找治疗视网膜变性相关的新的药物和一种操作简单，便于推广、创伤小的细胞替代方法逐渐成为近些年来的关注热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗视网膜变性的干细胞及制剂，通过将骨髓间充质干细胞优化培养和诱导分化，提高了其分化为视网膜神经前体样细胞效率，其移植效果与视网膜前体细胞具有相似的功效，使移植区视网膜功能有效改善，为干细胞移植治疗视网膜变性疾病提供了一种理想的细胞来源，具有很强的优越性。本发明的另一目的在于提供上述干细胞制剂的制备方法，该方法经分离、培养、传代和诱导得到的干细胞产品，制备过程简单、可靠，重现性好。

本发明的再一目的是提供一种治疗视网膜变性的干细胞制剂的使用方法，是一种操作简单，便于推广、创伤小的细胞替代方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种治疗视网膜变性的干细胞制剂，是通过以下步骤制备的：

（1）获得肝素化骨髓血；

（2）骨髓血的处理和接种：以体积比1：2加入含体积分数为10%FBS的LG-DMEM培养液，混合均匀后，直接接种于培养瓶中；

（3）原代细胞的培养：将上述培养瓶置于5%CO₂、37℃培养箱进行培养，48h首次不清洗直接换液，以后每2～3d换液1次，且换液前用缓冲溶液PBS清洗，均为全量换液；细胞长至80%～90%融合后以0.25%胰酶消化收获原代细胞，记为P0代细胞；

（4）P1传代细胞的培养：将上述P0代细胞以5×10⁴个/ml密度接种于培养瓶中，培养基为含体积分数为10%FBS的LG-DMEM培养液，置于5%CO₂、37℃培养箱进行培养，24h首次不清洗直接换液，以后每2d换液1次，且换液前用缓冲溶液PBS清洗，均为全量换液；细胞长至80%～90%融合后以0.025%胰酶消化收获原代细胞，记为P1代细胞；

（5）P2～P4传代细胞的培养：将上述P1代细胞以5×10⁴个/ml密度接种于培养瓶中，重复上述步骤（4），可获得P2代细胞；依次类推进行传代培养，可以获得P3～P4代细胞；

（6）骨髓间充质干细胞的鉴定：取P4代细胞进行细胞表面抗原鉴定，其中CD29、CD73、CD90和CD105的表达均在99%以上，CD34、CD45和HLA-DR的表达小于3%；

（7）P5传代细胞的诱导培养：将上述经鉴定合格后的P4代细胞以5×10⁴个/ml密度接种于培养瓶中，培养基为无血清的LG-DMEM培养液，其中添加10ng/ml维生素A、10ng/ml转化生长因子β1（TGFβ1）、50μg/L的血小板源性生长因子（PDGF）和1%的二甲基亚砜（DMSO），置于5%CO₂、37℃培养箱进行培养，24h首次不清洗直接换液，以后每2d换液1次，且换液前用缓冲溶液PBS清洗，均为全量换液；细胞长至80%～90%融合后以0.025%胰酶消化收获原代细胞，获得P5代诱导细胞，即视网膜神经样前体细胞；

（8）干细胞制剂的配制：将上述步骤（7）中获得的P5代细胞以生理盐水混匀，并添加10ng/ml维生素A、10ng/ml转化生长因子β1（TGFβ1）、50μg/L的血小板源性生长因子（PDGF）及获得干细胞制剂；

其中，步骤（5）中还包括P4代细胞以（2～5）×10⁶个/ml冻存于低于零下80℃环境下备用；

步骤（5）中还包括P4细胞的复苏，每1ml冻存细胞复苏后接种于9ml培养液中。

进一步的，所述的步骤（8）中干细胞制剂的浓度为（1～10）×10⁹个/ml。

本发明提供的一种治疗视网膜变性的干细胞制剂中干细胞的制备步骤有上述步骤（1）～（7）组成。

一种治疗视网膜变性的干细胞制剂的使用方法采用以下技术方案，具体步骤为：

第一步，干细胞制剂的获得：以上述一种治疗视网膜变性的干细胞制剂的步骤（1）～（8）获得治疗视网膜变性的干细胞制剂；

第二步，干细胞制剂的储存和运输：干细胞制剂储存与2～15℃环境中并运输；

第三步，干细胞制剂的移植：采用经球后视网膜色素上皮下注射，注入3μl上述干细胞制剂。

进一步的，所述的第一步中干细胞制剂的浓度为（1～10）×10⁹个/ml，优选5×10⁹个/ml。

本发明技术方案还具备以下优点：

1.本发明采用优选的方法制备干细胞，接种和培养的骨髓多潜能干细胞生长快，周期短，细胞数量多，并且保存了骨髓微环境中的丰富的生长因子和促粘附物质，减少分离液和长时间的常温操作对细胞的损伤。

2.本发明所制备的干细胞制剂中添加维生素A、转化生长因子β1（TGFβ1）、血小板源性生长因子（PDGF），有益于维护正常视觉功能，促进上皮组织细胞的健康和免疫球蛋白的合成，加快促进骨髓多潜能干细胞向视网膜细胞的分化。

3.本发明采用经球后视网膜色素上皮下注射的方法，使干细胞直接到达视网膜上皮层，并与脉络膜紧密相连，具有作用部位直接、疗效快、给药准确的优点，是一种操作简单，便于推广、创伤性小的细胞替代方法。

4.本发明采用骨髓源干细胞，相比于其他干细胞，骨髓源干细胞具有以下优点:1)具有向三个胚层的组织细胞分化的能力，如骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经细胞等；2)取材容易，易于扩增，无伦理道德的问题；3)具有强大的旁分泌作用，分泌神经营养因子和生长因子促进损伤组织的修复；4)具有免疫调节及抑制炎症因子释放的作用，有利于同种异体的移植，减少免疫排斥药物的使用；5)主动向损伤组织区域迁移的作用；6)移植后无肿瘤形成的倾向。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1是本发明干细胞制剂、干细胞制备及其使用方法流程图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

参照图1本发明干细胞制剂、干细胞制备及其使用方法流程图所示，本发明具体实施方式如下。

实施例1治疗视网膜变性的干细胞制剂的制备

一种治疗视网膜变性的干细胞制剂，具体包括以下制备步骤：

（1）获得肝素化骨髓血；

（2）骨髓血的处理和接种：以体积比1：2加入含体积分数为10%FBS的LG-DMEM培养液，混合均匀后，直接接种于培养瓶中；

（3）原代细胞的培养：将上述培养瓶置于5%CO₂、37℃培养箱进行培养，48h首次不清洗直接换液，以后每2～3d换液1次，且换液前用缓冲溶液PBS清洗，均为全量换液；细胞长至80%～90%融合后以0.25%胰酶消化收获原代细胞，记为P0代细胞；

（4）P1传代细胞的培养：将上述P0代细胞以5×10⁴个/ml密度接种于培养瓶中，培养基为含体积分数为10%FBS的LG-DMEM培养液，置于5%CO₂、37℃培养箱进行培养，24h首次不清洗直接换液，以后每2d换液1次，且换液前用缓冲溶液PBS清洗，均为全量换液；细胞长至80%～90%融合后以0.025%胰酶消化收获原代细胞，记为P1代细胞；

（5）P2～P4传代细胞的培养：将上述P1代细胞以5×10⁴个/ml密度接种于培养瓶中，重复上述步骤（4），可获得P2代细胞；依次类推，可以获得P3～P4代细胞；

（6）骨髓间充质干细胞的鉴定：取P4代细胞进行细胞表面抗原鉴定，其中CD29、CD73、CD90和CD105的表达均在99%以上，CD34、CD45和HLA-DR的表达小于3%；

（7）P5传代细胞的诱导培养：将上述经鉴定合格后的P4代细胞以5×10⁴个/ml密度接种于培养瓶中，培养基为无血清的LG-DMEM培养液，其中添加10ng/ml维生素A、10ng/ml转化生长因子β1（TGFβ1）、50μg/L的血小板源性生长因子（PDGF）和1%的二甲基亚砜（DMSO），置于5%CO₂、37℃培养箱进行培养，24h首次不清洗直接换液，以后每2d换液1次，且换液前用缓冲溶液PBS清洗，均为全量换液；细胞长至80%～90%融合后以0.025%胰酶消化收获原代细胞，获得P5代诱导细胞，即视网膜神经样前体细胞；

（8）干细胞制剂的配制：将上述步骤（7）中获得的P5代细胞以生理盐水混匀，并添加10ng/ml维生素A、10ng/ml转化生长因子β1（TGFβ1）、50μg/L的血小板源性生长因子（PDGF）及获得干细胞制剂；

其中，步骤（5）中还包括P4代细胞以（2～5）×10⁶个/ml冻存于低于零下80℃环境下备用；

步骤（5）中还包括P4细胞的复苏，每1ml冻存细胞复苏后接种于9ml培养液中；

步骤（8）中干细胞制剂的浓度为（1～10）×10⁹个/ml。

实施例2视网膜神经样前体细胞的流式细胞仪鉴定

1.鉴定步骤如下：

a）分别收集上述实施例1中步骤4中诱导分化前的P4代细胞和步骤7中诱导后的P5代细胞，置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液；

b）加入PBS6ml重新悬浮细胞，分装至6支流式管中，1000rpm离心5min，弃上清液；

c）加入4%多聚甲醛室温下固定30min，1000rpm离心5min，弃上清液；

d）加入PBS重新悬浮细胞，充分震荡后，1000rpm离心5min，弃上清液；

e）滴加10%山羊血清封闭液，室温下封闭30min，1000rpm离心5min，弃上清液；

f）滴加抗体稀释液稀释的一抗:鼠抗人Nestin单克隆抗体(1：100)，鼠抗人MAP2单克隆抗体(l:100)，鼠抗人Rhodopsin单克隆抗体(l:100)，鼠抗人NSE单克隆抗体(1:100)，鼠抗人GFAP单克隆抗体(1:100)，设置阴性对照，用PBS代替一抗，放置湿盒中4℃孵育过夜；

g）重复步骤4）两次；

h）加入抗体稀释液稀释的二抗：FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体(1:100)，37℃避光孵育lh；

i）重复步骤4）两次；

j）加入1%多聚甲醛500μl重新悬浮细胞，固定待测；

k）200目筛网过滤，流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞；

l）采用流式细胞仪及其配套软件进行取数和分析。

2.鉴定结果：

a）流式细胞仪鉴定情况：诱导前后巢蛋白(Nestin)、微管相关蛋白2(MAP2)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以及视紫红质蛋白(Rhodopsin)的表达进行了3次检测，以均值±标准差表示。

b）结果显示：诱导后Nestin阳性细胞从29.8%下降至79.3%，而MAP2阳性细胞从16.1%上升至92.5%，Rhodopsin阳性细胞从9.8%上升至98.2%，NSE阳性细胞从18.8%上升至95.1%，GEAP阳性细胞从1.2%上升至21.3%，经统计学分析差异有显著性(P<0.05)。

c）表明经诱导培养后，大部分BMSCs细胞都能表达成熟神经元的标记蛋白MAP2、NSE和光感受器细胞的标记蛋白Rhodopsin(>90%)，神经干/祖细胞的标志物Nestin的基因和蛋白表达在诱导后呈显著增加（>75%）；少部分细胞表达神经胶质细胞的标一记蛋白GFAP(<20%)；表明经不同的诱导培养基诱导后，BMSCs细胞的分化趋势进一步增强，出现某种器官特异性基因的表达显著升高，这就为眼科领域的干细胞移植治疗提供了一个新的、来源更丰富和取材更方便的种子细胞来源。

实施例3动物模型实验

1.建立脉络膜新生血管(CNV)动物模型

应用氪红激光对小鼠实验性视网膜进行光凝，激光的功率、光凝斑直径和曝光时间分别为300mW、50μm及0.060s诱导CNV动物模型。

2.细胞制剂移植试验

1）取实施例1制备好的干细胞制剂，细胞浓度为5×10⁹个/ml，将配制好的干细胞制剂装于EP管中，放在2～15℃冷藏保温盒中待用，实验过程中，细胞静置后会沉淀，注意使用前混匀；

2）取实验大鼠1只，称重；

3）用3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉；

4）0.5%地卡因作为角膜表面麻醉剂滴眼，以复方托品酞胺为散瞳剂滴眼一次散大瞳孔；

5）在手术显微镜下，观察眼底，确认眼底无异常后，准备开始注射；

6）用左手持慑子，轻轻夹住结膜，固定眼睛，右手持锐针头，在手术显微镜直视下，在鼻侧角膜缘后1mm，斜面朝上刺入，不用进针太深，能刺破巩膜，造成一隧道即可；

7）随后手持夹持器，将针头沿着原隧道进入眼内，避开晶体，在手术显微镜直视下，针头从鼻侧到达颞侧视网膜，选取无血管区域，当顿针头顶端触及视网膜时，稍稍手指用力往前推进，可感觉前方轻微的阻力，顶入视网膜色素上皮下，此时让助手推微量注射器，注入3μL细胞悬液到视网膜色素上皮下间隙，保持数秒，为保证3μL细胞完全悬液被推入视网膜色素上皮下后，拔出针头，注射完毕。可见注射位置视网膜隆起，成脱离状态，无视网膜大出血，视为注射成功；

8）术后给大鼠涂氧氟沙星眼膏，防止感染。注意在整个过程中，滴加玻璃酸钠，保持角膜湿润，以免角膜干燥、雾独，影响眼底的观察；

9）动物苏醒后送回动物中心继续饲养。

3.移植后的的实验观察及标本处理

于术后3d、1w、21d，10%水合氯酸麻醉大鼠，散瞳后，在手术显微镜下，用平面镜观察眼底情况，然后过量麻醉处死大鼠，沿角膜缘解开筋膜，离断视神经，摘除眼球，修掉去掉周围多余组织，投入30%蔗糖溶液中，4℃保存，随后行冰冻连续切片。在荧光显微下，挑选出有绿色荧光的切片，进行HE染色及免疫荧光染色。

4.光学检查

在细胞移植前和术后21d分别进行了视网膜光学相干断层扫描(OCT)、荧光素眼底血管造影术(FFA)和吲哚青绿血管造影（ICGA）检查。

5.实验结果

1）15只实验大鼠的眼底检查：术后0d，均可见局部视网膜隆起，脱离，无视网膜出血、玻璃体出血等。术后1d，30只眼结膜稍充血，角膜均透明，瞳孔圆，1个左眼出现晶体稍混浊，眼底窥不清，其余晶体均透明，无玻璃体混独、出血及视网膜明显出血，移植处可见局部视网膜脱离、隆起。术后7d，30只眼结膜充血消退，角膜透明，1个左眼晶体明显混浊，眼底窥不清，其余晶体透明，均无玻璃体混浊、出血及视网膜出血，原有视网膜隆起位置平伏。术后21d，30只鼠眼均角膜透明，瞳孔圆，1个左眼晶体明显混独，眼底窥不清，其余晶体透明，眼底正常。

2）移植后干细胞在眼内存活的情况：

a、干细胞注射眼的冰冻切片，术后3d时，能看到裂孔，术后7d，21d眼球连续切片，均未见裂孔，裂孔可自行愈合，视网膜组织结构完整，对视网膜损伤小。各个时间点，均可见EGFP标记的细胞，细胞能存活于是视网膜色素上皮下间隙，细胞形态良好，随着时间的推移细胞，EGFP(+)细胞未发生迁移，主要定植于注射位置，也未观察到整合入神经视网膜层。

b、进一步取具有EGFP(+)细胞的冰冻切片，进行HE染色后，更清晰的所见视网膜的形态，在术后3d时部分切片上，可以看到细胞进入视网膜色素上皮下间隙，针孔的位置，细胞在视网膜色素上皮下间隙存活，术后7d时的切片，观察不到裂孔，说明7d时，裂孔可自行愈合，对视网膜组织损伤小，细胞扔聚集在注射部位，细胞排列更为紧密，术后21d的切片可观察到多数切片上视网膜平伏，细胞存活于视网膜色素上皮下间隙，细胞之间排列紧密，形成层状结构，未见异形细胞及成瘤倾向。

3.OCT检查结果

OCT可观察到由于视网膜组织甚至细胞形态的变化而导致的光学特性的改变，包括视网膜任何层次的炎性渗出、纤维化、硬性渗出、出血及新生血管和膜增生等。本实施例中OCT实验结果显示：治疗后黄斑中心凹视网膜厚度显著降低，黄斑区结构异常得到恢复。

4.FFA和ICGA检查结果

实验结果显示：治疗前眼底血管联合造影可出现黄斑区出血、眼底高荧光及渗出性病变等表现，CNV病灶处于活动期。治疗后，黄斑区荧光渗漏停止，出血吸收，不见高荧光，CNV病灶处于静止期。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。