降解CSPGs对骨髓间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性的作用

摘要

视网膜变性是一类难治性疾病，其中最常见的有年龄相关性黄斑变性(age relatedmacular degeneration，AMD)，视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)等，全世界有数百万人因此永久致盲，危害性极大。因视网膜属于终末神经组织，神经细胞再生困难，此类疾病的治疗非常棘手。
　　 骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，可分化为视网膜神经元细胞或胶质细胞，可抑制神经细胞的凋亡，可分泌多种具有营养功能的细胞因子。但是BMSCs在视网膜下腔移植后，大部分细胞主要集中在注射区域，难以迁移、整合入视网膜，从而限制了BMSCs在病变视网膜上发挥其修复作用。
　　 有研究证实，胶质细胞和硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)是Müller细胞移植入RCS大鼠视网膜的障碍，用硫酸软骨素酶(chondroitinaseABC，ChABC)降解CSPGs后可促使Müller细胞在视网膜上大量移行。那么，BMSCs在变性视网膜内迁移困难的原因可能也和视网膜上CSPGs形成的屏障有关。本实验拟将ChABC处理的BMSCs移植到视网膜变性大鼠视网膜下腔，观察ChABC降解CSPGs后BMSCs在视网膜上的迁移情况，以及对视网膜细胞凋亡的影响，从而寻找提高BMSCs移植治疗视网膜变性疗效的途径。
　　 研究目的:
　　 建立碘酸钠诱导视网膜色素变性大鼠的动物模型。建立体外分离、培养、鉴定、标记大鼠骨髓间充质干细胞的方法。视网膜下腔注射硫酸软骨素酶处理的BMSCs，探讨降解CSPGs对于BMSCs治疗视网膜色素变性的作用。
　　 研究方法:
　　 1、4周龄的SD大鼠40只行腹腔注射碘酸钠(NaIO3，3％，100mg/kg)，注射后14d、28d、90d、180d后分别处死动物取眼球行视网膜HE染色。体外分离SD大鼠骨髓细胞，密度梯度离心法培养BMSCs，分别行流式细胞仪及成骨、成脂鉴定，BrdU标记BMSCs。
　　 2、造视网膜色素变性模型，分为A组不干预组，B组BMSCs注射组，C组BMSCs+ChABC注射组，D组PBS注射组。28d后将硫酸软骨素酶(chondroitinaseABC，ChABC)处理或未处理的BMSCs注射入大鼠视网膜下腔，14d后处死大鼠并取出眼球，行视网膜细胞凋亡、免疫荧光、免疫组化检测。
　　 实验结果:
　　 1、大鼠腹腔注射NaIO3后RPE细胞变形、萎缩，视杆视锥层结构紊乱，外核层呈波浪状改变，光感受器细胞数目逐渐减少。BMSCs在体外快速增殖、传代，P3代后细胞CD34、CD45阴性，CD44、CD90阳性的百分率始终高于95％，并能进行成脂、成骨分化，用BrdU标记BMSCs的标记率可达90％以上。
　　 2、(1)免疫荧光显示:B组BMSCs注射组BrdU标记发绿色荧光的BMSCs主要分布于视网膜下腔，仅少量BMSCs迁移至外核层以内的视网膜，细胞迁移率为（7.2±3.71）％，C组BMSCs+ ChABC注射组BrdU标记发绿色荧光的BMSCs大部分迁移至视网膜外核层，细胞迁移率为（68.6±6.09）％。B组与C组的BMSCs迁移率相比，统计学有显著性差异(P＜0.01)。(2)视网膜下腔注射BMSCs14d后视网膜感光细胞凋亡率:A组不干预组（41.7±2.75）％，B组BMSCs注射组（34.4±3.44）％，C组BMSCs+ ChABC注射组（32.2±3.08）％，D组PBS注射组(40.9±2.96)％，B组、C组与A组、D组分别进行比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。(3)免疫组化显示，BMSCs在眼内表达抗原GFAP。
　　 结论:
　　 1、腹腔注射碘酸钠可成功建立视网膜变性动物模型，密度梯度离心法培养BMSCs时间短、效率高，BrdU可作为BMSCs的合适标记物。
　　 2、降解CSPGs可以提高BMSCs在视网膜上的迁移能力，BMSCs眼内注射后可降低视网膜变性大鼠光感受器细胞的凋亡率，从而保护光感受器细胞。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一部分 建立视网膜变性动物模型及BMSCs的分离、培养、鉴定、标记

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二部分 降解CSPGs对BMSCs治疗大鼠视网膜变性的作用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

附录

综述

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