一种撒瓦那柏初代组培方法

摘要

本发明公开了一种撒瓦那柏初代组培方法，包括以下步骤：(1)培养基的配制：选择基础培养基，加入蔗糖和琼脂，再加入6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)或者萘乙酸，调节pH值，灭菌，即得；(2)外植体处理：选择不带芽的外植体，清洗，消毒；(3)接种培养：将步骤(2)所得外植体旧伤口剪去，插入步骤(1)所得培养基中，置于培养室内培养。相对于现有技术，本发明方法不仅具有现有技术中组培繁殖的优势，还通过特定的培养基、激素种类和浓度，与其它处理方法相结合，能够显著降低撒瓦那柏的污染率，提高其成活率，使撒瓦纳柏能顺利形成更多分枝，不会出现玻璃化、褐化等现象。

说明书

技术领域

本发明涉及一种撒瓦那柏初代组培方法，属于苗木繁殖技术领域。

背景技术

撒瓦纳柏是一种四季均为黄色的新引进的彩叶植物，由于枝条流线形，色彩鲜明，日本早己在园林中大量应用，而我国在园林绿化中还没有见到。撒瓦纳一般采用种子播种、扦插方法繁殖，但种子繁殖容易发生变异，扦插繁殖的穗源较少，不能快速大量繁殖，所以用组织培养的方法是撒瓦纳柏快繁新途径。

目前，在撒瓦纳柏的初代组织培养过程中，培养基、激素种类和浓度都很重要，但是现有技术中的选择都不够合理，导致形成分枝过少，易出现玻璃花、褐化等现象。

发明内容

发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供一种撒瓦那柏初代组培方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明公开了一种撒瓦那柏初代组培方法，包括以下步骤：

(1)培养基的配制：选择基础培养基，加入蔗糖和琼脂，再加入6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)或者萘乙酸，调节pH值，灭菌，即得；

(2)外植体处理：选择不带芽的外植体，清洗，消毒；

(3)接种培养：将步骤(2)所得外植体旧伤口剪去，插入步骤(1)所得培养基中，置于培养室内培养。

作为优选，所述步骤(1)中基础培养基为MS、1/2MS(1/2MS培养基中大量元素为MS培养基的一半)、B5或者WPM培养基。

作为另一种优选，所述步骤(1)中蔗糖和琼脂的浓度分别为30g/L和7g/L。

作为另一种优选，所述步骤(1)中6-苄氨基腺嘌呤或者萘乙酸的浓度均为0.05-1mg/L。

作为另一种优选，所述步骤(1)中pH值为5.8～6.0，灭菌条件为：121℃高压下灭菌25min。

作为另一种优选，所述步骤(2)中清洗方法为：先用洗衣粉浸泡干净后，再用纯水冲洗2小时。

作为另一种优选，所述步骤(2)中消毒方法为：先用75％酒精处理30秒，再用0.1％的升汞浸泡5-8min，最后用无菌水冲洗5次，残留的水分用无菌滤纸吸取。

作为另一种优选，所述步骤(3)中培养室的培养条件为：光照16h/d，光照度为2000lx，温度控制在(25±2)℃。

技术效果：相对于现有技术，本发明方法不仅具有现有技术中组培繁殖的优势，还通过特定的培养基、激素种类和浓度，与其它处理方法相结合，能够显著降低撒瓦那柏的污染率，提高其成活率，使撒瓦纳柏能顺利形成更多分枝，不会出现玻璃化、褐化等现象。

附图说明

图1为不同的培养基对初代培养效果的影响；

图2为不同浓度的6-BA对初代培养效果的影响(横坐标中1、2、3、4分别为0mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、1mg/L)；

图3为不同浓度的NAA对初代培养效果的影响(横坐标中1、2、3、4分别为0mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、1mg/L)；

具体实施方式

实施例1

(1)培养基的配制：选择MS培养基作为基础培养基，加入蔗糖和琼脂，浓度分别为30g/L和7g/L，再加入6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，其浓度为0.05mg/L，调节pH值为5.8～6.0，121℃高压下灭菌25min，即得；

(2)外植体处理：选择不带芽的外植体，先用洗衣粉浸泡干净后，再用纯水冲洗2小时，然后用75％酒精处理30秒，再用0.1％的升汞浸泡5min，最后用无菌水冲洗5次，残留的水分用无菌滤纸吸取；

(3)接种培养：将步骤(2)所得外植体旧伤口剪去，插入步骤(1)所得培养基中，置于培养室内培养，培养条件为：光照16h/d，光照度为2000lx，温度控制在(25±2)℃。

实施例2：

(1)培养基的配制：选择B5培养基作为基础培养基，加入蔗糖和琼脂，浓度分别为30g/L和7g/L，再加入6-苄氨基腺嘌呤，其浓度为1mg/L，调节pH值为5.8～6.0，121℃高压下灭菌25min，即得；

(2)外植体处理：选择不带芽的外植体，先用洗衣粉浸泡干净后，再用纯水冲洗2小时，然后用75％酒精处理30秒，再用0.1％的升汞浸泡8min，最后用无菌水冲洗5次，残留的水分用无菌滤纸吸取；

(3)接种培养：将步骤(2)所得外植体旧伤口剪去，插入步骤(1)所得培养基中，置于培养室内培养，培养条件为：光照16h/d，光照度为2000lx，温度控制在(25±2)℃。

实施例3：

(1)培养基的配制：选择1/2MS培养基作为基础培养基，加入蔗糖和琼脂，浓度分别为30g/L和7g/L，再加入萘乙酸，其浓度为0.05mg/L，调节pH值为5.8～6.0，121℃高压下灭菌25min，即得；

(2)外植体处理：选择不带芽的外植体，先用洗衣粉浸泡干净后，再用纯水冲洗2小时，然后用75％酒精处理30秒，再用0.1％的升汞浸泡6min，最后用无菌水冲洗5次，残留的水分用无菌滤纸吸取；

(3)接种培养：将步骤(2)所得外植体旧伤口剪去，插入步骤(1)所得培养基中，置于培养室内培养，培养条件为：光照16h/d，光照度为2000lx，温度控制在(25±2)℃。

实施例4：

(1)培养基的配制：选择1/2MS培养基作为基础培养基，加入蔗糖和琼脂，浓度分别为30g/L和7g/L，再加入萘乙酸，其浓度为0.05mg/L，调节pH值为5.8～6.0，121℃高压下灭菌25min，即得；

(2)外植体处理：选择不带芽的外植体，先用洗衣粉浸泡干净后，再用纯水冲洗2小时，然后用75％酒精处理30秒，再用0.1％的升汞浸泡5min，最后用无菌水冲洗5次，残留的水分用无菌滤纸吸取；

(3)接种培养：将步骤(2)所得外植体旧伤口剪去，插入步骤(1)所得培养基中，置于培养室内培养，培养条件为：光照16h/d，光照度为2000lx，温度控制在(25±2)℃。

实施例5：

(1)培养基的配制：选择1/2MS培养基作为基础培养基，加入蔗糖和琼脂，浓度分别为30g/L和7g/L，再加入萘乙酸，其浓度为0.05-1mg/L，调节pH值为5.8～6.0，121℃高压下灭菌25min，即得；

(2)外植体处理：选择不带芽的外植体，先用洗衣粉浸泡干净后，再用纯水冲洗2小时，然后用75％酒精处理30秒，再用0.1％的升汞浸泡8min，最后用无菌水冲洗5次，残留的水分用无菌滤纸吸取；

(3)接种培养：将步骤(2)所得外植体旧伤口剪去，插入步骤(1)所得培养基中，置于培养室内培养，培养条件为：光照16h/d，光照度为2000lx，温度控制在(25±2)℃。

实验例1不同消毒时间对撒瓦那柏茎尖污染的影响

不同消毒时间对撒瓦那柏茎尖的影响如表1所示。对外植体处理效果最好的是处理1，成活率达到87.7％，污染率最高的也是处理1达46％，而死亡率最高的是处理3达31.6％，可以看出，污染随升汞的处理时间延长而下降，但死亡率却反而升高，说明随着升汞处理时间的增加，对外殖体的伤害也逐渐加大，因而死亡率会逐渐升高，植物的细胞因而失去活力。综合以上各项指标可以看出，处理2是最好的处理条件，也就是在75％的酒精处理30s后，用0.1％升汞处理6min是对外殖体影响最小的。

表1不同消毒时间对撒瓦那柏茎尖污染的影响

实验例2不同的培养基对初代培养效果的影响

通过对平均再生鳞叶数占原有鳞叶数百分比数据进行方差分析，不同基础培养基间的F＝2.92＜3.34＝F0.05(3,14)，故四种基础培养基对初代培养无显著影响。从说明书附图1中可以明确看出：接种于1/2MS和B5培养基上的外植体萌发率同样高，且1/2MS培养基上外植体死亡率最低，污染率相对较低。因此，1/2MS培养基最适合撒瓦那柏的初代培养。

实验例3不同浓度的6-BA对初代培养效果的影响

同样对数据进行方差分析，不同6-BA浓度间的F＝1.04＜3.34＝F0.05(3,14)，故四种6-BA浓度对初代培养无显著影响。由说明书附图2可得：随着6-BA浓度的增加，萌发率不断降低，培养基中加入了第1种6-BA浓度的撒瓦那柏外植体萌发率最高，污染率、死亡率最低，可知培养基中加入第1种(及不添加)6-BA对撒瓦那柏初代培养效果较好。

实验例4不同浓度的NAA对初代培养效果的影响

同样对数据进行方差分析，不同NAA浓度间的F＝0.52＜4.07＝F0.05(3,8),故四种NAA浓度对初代培养无显著影响。由说明书附图3可知：培养基中加入了第2种NAA浓度的撒瓦那柏外植体萌发率最高，污染率、死亡率最低，可得培养基中添加第2种(及0.05mg/L)NAA有利于撒瓦那柏的初代培养。

实验例4整个组培方法污染率和成活率考察

取同一批次的撒瓦那柏，分别按照本发明实施例3、4和5方法进行初代组培，分别设为实施例3组、4组和5组；

另取以上相同批次的撒瓦那柏，按照现有技术中进行初代组培，作为对照组。

各组分别培养17天后对外植体的污染率和成活率进行统计，结果下见表2

表2各组植株移栽成活率

由上表1结果可得，本发明实施例组将各种因素组合，所得外植体污染率大大降低，成活率大大提高，并且实施例3组的效果最佳；相比较对照组，本发明初代组培方法，能够显著降低撒瓦那柏外植体的污染率，并且显著提高其成活率。

此外，相比较对照组，本发明三个实施例组的撒瓦纳柏形成了更多分枝，并且没有出现玻璃化、褐化等现象。